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要約

関係なく、動作条件、ICP帯の伝播を停止することができる新規なイオン濃度分極（ICP）プラットフォームのためのプロトコルを説明します。プラットフォームのこのユニークな能力は、ICP現象の2極性があるイオン減少および濃縮を、マージを使用することにあります。

要約

イオン濃度分極（ICP）現象は、低存在量の生体試料を前濃縮するための最も有力な方法の一つです。 ICPは、荷電した生体分子（ すなわち、イオン欠乏ゾーン）用の非侵襲性の領域を誘導し、ターゲットは、この領域の境界上に予備濃縮することができます。 ICPと高い予備濃縮性能にもかかわらず、非伝播イオン欠乏ゾーンの運転条件を見出すことは困難です。この狭い動作ウィンドウを克服するために、我々は最近、時空間固定予備濃縮のための新しいプラットフォームを開発しました。イオンのみの枯渇を使用する方法を先行するとは異なり、このプラットフォームはまた、イオン欠乏ゾーンの伝播を停止するICP（ すなわち、イオン濃縮）の反対の極性を使用しています。空乏ゾーンで濃縮ゾーンに直面することで、2ゾーンが合流し、停止します。本稿では、この時空定義されたICP platfを構築するための詳細な実験プロトコルを記述しますORMと従来のものとそれらを比較することにより、新しいプラットフォームの前濃縮ダイナミクスを特徴づけます。定性的なイオン濃度プロファイルと、現在の時間応答が正常にマージされたICPおよびスタンドアローンICPとの間の異なるダイナミクスを捕捉します。のみ〜5 Vで予備濃縮の場所を修正することができ、従来とは対照的に、新しいプラットフォームは、運転条件の広い範囲内の特定の場所で目標凝縮プラグを生成することができます：電圧（0.5から100 V）、イオン強度（1-100 mM）の、およびpH（3.7から10.3）。

概要

イオン濃度分極（ICP）は、イオン濃度勾配1、2と追加の電位降下を生じ、選択透過膜にイオン濃縮とイオン減少の間に生じる現象をいいます。この濃度勾配は線形であり、より高い電圧が印加されると、膜上のイオン濃度は、（レジームを限定する）がゼロに近づくまでは（オームレジーム）急になります。この拡散制限条件に、勾配（および対応するイオン流束）を最大化することが知られている/ 1を飽和させました。電圧（または電流）をさらに増加すると、この従来の理解を超えて、overlimiting電流がゾーン境界1,3の平坦空乏領域と非常にシャープな濃度勾配を用いて、観察されます。フラットゾーンは、非常に低いイオン濃度を有するが、表面伝導電気osmoti C流（EOF）、及び/又は電気浸透不安定性は、イオンフラックスを促進しoverlimiting電流3、4、5を誘導します 。 6、7、8、9および/または予備濃縮をフィルタリング静電バリアが、10、11を標的とするように興味深いことに、平坦な空乏ゾーンが働きます。 （電気的中性を満足するための）荷電粒子の表面電荷をスクリーニングするイオンの不十分な量があるので、粒子は、この空乏領域を通過し、従って、その境界で整列することができません。この非線形ICP効果は、膜10、11、12、13の様々なタイプの一般的な現象であります> 14およびジオメトリ6、15、16、17、18、19、20、21。研究者は、濾過6、7、8の種々のタイプを開発することができた理由は、9 非線形ICPを使用して10、11デバイスを予備濃縮。

でも、このような高い柔軟性と堅牢性と、まだ非線形ICPデバイスの動作条件を明確にする実用的な課題です。 ICPの非線形政権はすぐに陽極に向かって移動する陰イオンの変位を引き起こす陽イオン交換膜を介して、陽イオンを除去します。としてその結果は、フラットな空乏ゾーンは、ショックの伝播22を彷彿とさせるその、すぐに伝播します。マニら。このダイナミックな脱イオン（または枯渇）23に衝撃を与えると呼ばれます。指定された検知位置にターゲットを前濃縮するために、イオン欠乏ゾーンの拡大を防止することは、例えば、帯域拡張24に対してEOFまたは圧力駆動流を適用することによって、必要です。 Zangle ら。 図22は、一次元モデルでICP伝播の条件を明確にし、それは非常にように電気泳動移動度17、イオン強度18、pHを25に依存し、。これは、適切な動作条件は、試料条件に応じて変更されることを示しています。

ここでは、spatiotemp内の目標を前濃縮小説ICPプラットフォームのための詳細設計および実験プロトコルを提示します経口位置26を定義しました。イオン欠乏ゾーンの拡大は関係なく、動作時間の、割り当てられた位置に固定予備濃縮プラグを残して、イオン富化ゾーンによって印加される電圧、イオン強度、およびpHが遮断されます。この詳細なビデオプロトコルは、マイクロ流体デバイス内に陽イオン交換膜を統合すると、従来に比べて新しいICPプラットフォームの予備濃縮の性能を実証するために最も簡単な方法を示すことを意図しています。

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プロトコル

陽イオン交換膜に統合されたマイクロ流体チップの1製作

  1. シリコンマスターの準備
    1. 設計シリコンマスターの二種類：陽イオン交換樹脂及びポリジメチルシロキサン（PDMS）を有するマイクロチャネルを構築するための他のパタ​​ーニングのための1つ。
      注：詳細ジオメトリは、ステップ1.3.1と1.4.1で説明します。
    2. 従来のフォトリソグラフィまたはディープ反応性イオンエッチング27のいずれかを用いてシリコンマスターを作ります。
    3. 30分間真空瓶にトリクロロシラン（〜30μL）とマイクロパターンシリコンマスターをSilanize。
      注意：トリクロロシランは可燃性であり、急性毒性（吸入、経口摂取）を持っている自然発火性液体です。
  2. PDMS鋳型の調製
    1. 10に硬化剤とシリコーンエラストマーベースを混ぜる：1の比率と、この未硬化のPDMSを有するカップを置きます気泡を除去するために30分間真空瓶中の（4-のシリコンウェハ上に微細構造を複製するための30から40 mL）で。
      注：シリコーンベースは、ビニル基と白金系触媒で終わるシロキサンオリゴマーが含まれています。硬化剤は、3個のケイ素-水素結合28を有するオリゴマーを架橋含ま。
    2. シリコンマスター上の未硬化PDMSを注ぎ、ブロアーで気泡を除去し、対流式オーブン中で2時間80℃でPDMSを治します。
    3. シリコンマスターから硬化PDMSを外し、適切にナイフでPDMSを形作る（ 図2a-Bに示すように、IV、形状を乗）。
  3. 陽イオン交換膜をパターニング
    1. 二つの平行なマイクロチャンネルに垂直にPDMSモールドの半分をカットし、2.0 mmの生検パンチとPDMSチャネルの両端に穴をパンチ。
      注：カチオン選択性膜をパターニングするためのPDMSモールドは2パーを持っています対立マイクロチャネル（幅：100ミクロン、高さが50μm、チャネル間の距離：100ミクロン; 図1a）。金型の元の形状は、切断線に沿ってスライスした金型をミラーリングすることによって想像することができます。 L字型マイクロチャネルは重複せずに2つの穴を打ち抜くために推奨されています。
    2. スライドガラスとPDMSモールドテープで送風機をきれいにし、それらの間の可逆的な添付ファイルを作成するために、スライドガラス上に金型を置きます。
    3. マイクロパターニング技術29によれば、ステップにスライスされたチャネルの開放端にカチオン交換樹脂1.3.1のリリース〜10μL（ 図1B）。パンチ穴に注射器ヘッドを置き、プランジャ（ 図1b中の黒矢印）を引き出します。穏やかな負圧は、陽イオン交換樹脂を引っ張るし、樹脂を2つのチャネルを充填します。
      注：マイクロチャネルの高さは15以上であることが推奨されます81;メートル、樹脂の高粘度は、チャネルを埋めるために高い圧力を必要とするため。パターン化されたイオン選択性膜が1μmより厚くなりますので、一方、高さが100μmを超えないことが良好です。このような厚い膜は、膜とPDMSチャンネル13との間のギャップを作成することができます。
    4. パターン化された樹脂に触れずにPDMSモールドを取り外し、樹脂中の溶媒を蒸発させるために95℃で5分間加熱器のスライドガラスを置きます。
      注：パターン化された膜の厚さは、<1ミクロンよりも通常小さいです。金型を静かにオープンエンド側（ 図1bの点線矢印）に金型を蝶番により剥離されます。これは、樹脂を充填した後、金型に1分未満をデタッチするのが最善です。金型は、数分後に取り外された場合には、より厚い膜を得ることができ、それらは毛管作用に凹形状を有するであろう。
    5. 不要はがしカミソリの刃を持つパターン化膜の一部、分離した2つのラインパターン（ 図1c）を作ります。
      注：ここで使用される陽イオン交換材料が強くガラスに接着されていないパターンを意味し、グループをペルフルオロ化しています。したがって、単純なブレーディング法は、簡単に、膜の不要な部分を削除することができます。
  4. マイクロチャネルの統合と膜パターニング基板
    1. マイクロチャネルの両端にある2つの穴と膜パターンがステップ1.3で作製した膜パターニング基板にPDMSチャネルを接合した後に配置される他の2穴パンチ。
      注：PDMSマイクロチャネルは、1チャンネル（：50〜100μmで、高さ、幅10μm）を持っていますが、それは、隣接チャネル（ 図1D）の端部に接合されています。
    2. W 100と50ミリトールで40秒間、直ちに酸素プラズマ処理後の膜パターニングされた基板にPDMSマイクロチャネルを結合。
      注：マイクロチャネルの中央に垂直にパターン化された膜を配置します。

2. ICP前濃縮

  1. 実験の準備
    1. 1-100のKCl、1mMのNaClを含む、種々の試験溶液を調製し（pH約7）、1 mMのNaClおよび0.2mMの塩酸（pH約3.7）、1 mMのNaClおよび0.2mMのNaOHで（pHが混合物の混合物〜 10.3）、および1×リン酸緩衝生理食塩水。
    2. 試験溶液に負に帯電した蛍光色素（〜1.55μM）を追加します。
      注：帯電した染料は、電流30に寄与しないように、追加の色素の濃度は、塩イオン（<10μM）のそれよりもはるかに低くあるべきである、31。
    3. チャネルの1リザーバ内の試料溶液をロードし、溶液を用いてチャネルを埋めるために、他の容器に負圧を加えます。 rで流体力学的に2つのリザーバを接続しますチャンネル（ 図2A）に沿った圧力勾配を排除する大きな液滴eleasing。
    4. リザーバ内のICP効果を補償するために、シリンジまたはピペットを使用して、緩衝液（1 MのKClまたは1 M​​ NaCl）で、陽イオン交換パターンに接続された2つのリザーバを充填します。
    5. 2パターン化膜（右に左リザーバとカソードにアノード）を横切って、貯水池でワイヤを配置し、ソース測定ユニット（ 図2a）とそれらを接続します。
  2. ICP現象とICPの予備濃縮の可視化
    1. 倒立落射蛍光顕微鏡上のICPデバイスをロードします。電圧（0.5100 V）を印加し、ソース測定ユニットと電流応答を測定します。
    2. 電荷結合素子カメラで蛍光画像をキャプチャし、イメージングソフトウェア32を使用して蛍光強度を解析します。

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結果

膜一体型マイクロ流体の予備濃縮の模式的な製造工程は、 図1に示されています。製造の詳細な説明は、プロトコルに記載されています。時空間的に定義プレコンセントレータ26のデザインやデバイスの画像は、従来の予備濃縮11（ 図2）のものと対比されます。時空定義予備濃縮でICP現象は、電流-電圧-時?...

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ディスカッション

我々は、10,000倍を実現し、製造プロトコルおよび印加電圧（0.5から100 V）、イオン強度（1-100 mM）の、およびpH（3.7から10.3）の範囲内の時空間的に定義されたプレコンセントレータのパフォーマンスを記載しています10分以内に染料やタンパク質の予備濃縮。以前のICPデバイスなど、予備濃縮性能は高い電圧でかつ低いイオン強度で良好となります。ここで検討することができますつの追加の?...

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開示事項

The authors have nothing to disclose.

謝辞

This work was supported by the internal fund of the Korea Institute of Science and Technology (2E26180) and by the Next Generation Biomedical Device Platform program, funded by the National Research Foundation of Korea (NRF-2015M3A9E202888).

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Sylgard 184 Silicone Elastomer kitDow Corning
TrichlorosilaneSigma Aldrich175552Highly toxic
Nafion perfluorinated resin, 20 wt%Sigma Aldrich527122
Sodium chlorideSigma Aldrich71394
Potassium chlorideSigma Aldrich60121
Alexa Fluor 488 carboxylic acid, succinimidyl esterInvitrogenA20000
Isothiocyanate-conjugated albuminSigma AldrichA9771
Phosphate buffer saline, 1xWengeneLB004-02
Tween 20Sigma AldrichP1379
Epifluorescence microscopeOlympusIX-71
Charged-coupled device cameraHamamtsu Co.ImageEM X2
Source measurement unitKeithley Instruments2635A
Covance-MPFemto Science

参考文献

  1. Probstein, R. F. Physicochemical Hydrodynamics: An Introduction. , Wiley-Interscience. New York. (2003).
  2. Strathmann, H. Ion-Exchange Membrane Separation Processes. , Elsevier. Amsterdam. (2004).
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  4. Kwak, R., Pham, V. S., Lim, K. M., Han, J. Y. Shear flow of an electrically charged fluid by ion concentration polarization: scaling laws for electroconvective vortices. Phys. Rev. Lett. 110 (11), 114501(2013).
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  38. Chen, C. -H., et al. Enhancing protease activity assay in droplet-based microfluidics using a biomolecule concentrator. J. Am. Chem. Soc. 133, 10368-10371 (2011).
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