从小鼠在原代肝细胞培养物的炎性反应的诱导

摘要

这里，我们表明酶促方法来原代肝细胞从成年小鼠隔离，我们描述了使用ELISA和实时PCR的炎症反应的量化。

摘要

肝脏在全身性炎症的调节决定性的作用。特别是在慢性肾脏疾病，肝脏响应于尿毒症环境，氧化应激，内毒素血症和通过产生大量的急性期反应物的循环促炎性细胞因子的清除率降低反应。实验工具来研究炎症和肝细胞的基本作用是理解的调节和肝细胞因子的贡献全身急性期反应和延长的促炎症的情况下，尤其是在复杂的环境至关重要如慢性肾脏疾病。自体内研究炎症的复杂的机制仍然是具有挑战性的，耗费资源的，通常需要转基因动物的使用，一次分离的肝细胞提供一个强大的工具来获得机械分析上市肝急性期反应。由于这种体外技术特点适中成本，高重可生产和技术常识，一次分离的肝细胞也可以很容易地用作筛选方法。这里，我们描述一个基于酶促法以分离原代鼠肝细胞，和我们描述在使用ELISA和定量实时PCR这些细胞的炎症反应的评估。

引言

慢性肾病（CKD）可以被定义为急性和慢性炎症¹的状态。在慢性肾脏病患者中，phosphaturic激素成纤维细胞生长因子23（FGF23）的血清水平逐步上升，以维持血清磷酸盐稳态^2。提高血清FGF23水平分别与心血管发病率和死亡率谁开始血液透析治疗^3，4患者有关。此外，一些临床研究表明升高的FGF23水平与C-反应蛋白（CRP），白介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子^{α（TNFα）5,6}的血清水平之间存在很强的相关性。另外，在实验研究中，我们最近表明，FGF23可以直接靶向肝细胞，并导致增加的CRP和IL-6 P的炎症反应roduction在肝脏^7。因此，FGF23可能充当有助于全身炎症反应在CKD循环因素。

在70年代初，原代肝细胞分离并研究首次^8。自那时以来，原代培养的肝细胞已被广泛用来研究代谢加工，激素功能，药物代谢和毒性，以及免疫和炎症反应^9,10。先前协议已经主要描述原代肝细胞的酶活隔离从人肝脏组织^11，12。虽然一个很好的模式，这留下了研究操纵基因是如何影响肝脏复杂的信号机制，以及在不同类型的刺激功能的后果的能力。在下面，我们描述了小鼠原代肝细胞的分离。值得注意的是，肝急性期反应的几种介质，如脂多糖（LPS），IL-6和FGF23的效果可在简单，快速和可重复的方式¹³进行分析。

在此，我们提出了从成年小鼠肝细胞的酶促隔离的协议，并且我们表明，炎症的建立诱导，如LPS和IL-6，以及新颖的炎症介质如FGF23，可直接刺激的表达和分泌炎性细胞因子，如在培养的肝细胞的CRP和IL-6。

研究方案

所有动物方案和实验过程由医学迈阿密大学米勒医学院大学的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1.准备

1. 预热肝灌注介质和肝脏，在37℃消化介质中的水浴中。
2. 设置一个灌注泵（30毫升/分钟）。仔细预填肝灌注介质泵的管道系统。避免在系统中的任何气泡，并准备立体显微镜。
3. 使用根据制造商的协议我型胶原涂层细胞培养皿。

2.肝恢复

1. 麻醉用氧气/异氟醚（异氟烷4％/ 2升/分钟氧气）供体小鼠。
   1. 通过降低异氟烷以2-2.5％或通过注射氯胺酮维持麻醉（100mg / kg的体重腹膜内）和赛拉嗪（10毫克/公斤体重的intraperitoneally）。连续异氟烷麻醉优选自氯胺酮降低血压，并可能导致肝毒性。
2. 放置麻醉小鼠上的吸收垫。用胶带固定鼠标的四肢。
3. 刮脸和消毒鼠标的腹部，并从耻骨进行剖腹探查腹用手术剪刀锋利/钝头肝脏的颅边框。切开腹壁向两侧，膜片的尾部。
4. 经肠道仔细移动到右侧暴露下腔静脉（IVC）。用消毒棉签拭子和角度的尖镊子仔细解剖周围的IVC脂肪组织。
5. 切开肝上下隔膜，并用细手术剪刀锋利/锋利的尖端两侧切口打开胸腔。使用胸外科IVC丝（5/0）结扎。
6. 使用屏蔽静脉导管导管插入下腹IVC，小心地取出针头，连接灌注泵，开始灌注肝脏。如果执行得当，肝应立即开始发白和膨胀。
7. 横切门静脉使血液和灌注媒体适当的排水用细手术剪。
8. 灌注用约30毫升肝灌注介质的肝脏，然后切换到肝脏消化介质（30毫升）中。关闭灌注泵并取出插管灌注一次完成。
9. 轻轻暴露肝脏的中央区域并定位在连接组织联的肝叶。抓住中央连接光纤，仔细剖析控股肝脏全部到位组织和轻轻取出肝脏。
10. 紧接在肝脏转移到含有15毫升的50mL聚丙烯锥形管肝脏消化介质。
    注:有没有具体的时间线的这一步。灌注后，肝脏保持在消化介质输送到无菌细胞培养罩。所有Subsequent步骤应在无菌环境中进行。

细胞3.隔离治疗

1. 在细胞培养罩，转移从50毫升聚丙烯锥形管含有消化媒体肝脏进入无菌组织培养皿。
2. 使用无菌镊子轻轻撕肝脏的四个叶片。如果正确执行，消化中应该由于从肝脏分离肝细胞变浑浊。
3. 用25毫升无菌枪头，通过70微米尼龙细胞过滤混浊消化介质过滤到一个新的50毫升聚丙烯锥形管以除去未消化的组织颗粒和细胞碎片。
4. 重复步骤3.2和3.3，用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）。这有助于从肝驱除残存肝细胞。
5. 离心机在50×g离心在4℃下2分钟。吸出上清液含有过量的细胞碎片，轻轻地再暂停25毫升冷的1×细胞威廉姆斯的中E.
6. 用25毫升无菌枪头，通过一个新的70微米尼龙细胞过滤器过滤再悬浮到50mL聚丙烯锥形管以实现清洁悬浮液。
7. 重复步骤3.5和3.6使用冷威廉姆斯中等E 1X，以获得更清晰的细胞悬液三个额外的洗涤。
8. 最后洗涤步骤后，吸去上清液，以除去过量的细胞碎片。重悬和过滤器的细胞在25mL暖Williams的媒体E 1X包含原代肝细胞的解冻和电镀补充剂通过一个新的70微米尼龙细胞过滤到50mL聚丙烯锥形管中。
9. 算使用血球25毫升细胞悬浮液中的细胞。平均预期15 - 每位成人肝20000000细胞。使用台盼蓝染色测定细胞生存力。
10. 板块细胞威廉姆斯的2毫升媒体E 1X包含原代肝细胞解冻和电镀添加剂在胶原包被的6孔策LL培养簇（每孔9×10 ^5个细胞）。
11. 4小时后，介质改为威廉姆斯的媒体E 1X包含原代肝细胞的维护补充剂。
12. 24小时后，血清饥饿用Dulbecco改进的Eagle培养基（DMEM）培养基1×6小时的细胞。
13. 用PBS处理细胞作为溶媒，FGF23（25毫微克/毫升），脂多糖（100微克/毫升），或在无血清培养基中的IL-6（50毫微克/毫升），并培育24小时。

4.隔离的RNA

1. 使用根据制造商的说明在商业自旋柱试剂盒制备的RNA。

5.生成的cDNA通过逆转录RNA分离

1. 添加200毫微克分离的RNA样品以PCR管。
2. 从步骤5.1添加核酸内切酶游离H ₂ O至PCR管的14微升。
3. 从步骤5.1添加4微升反转录酶对PCR管。
4. 轻轻重悬内容，以混合均匀;离心平缓。
5. 放置装有该混合物成热循环PCR管。用于逆转录运行热循环:1个循环的25℃（5分钟），42℃（30分钟），85℃（5分钟），然后保持在4℃。最终产品将是所需cDNA。

6.实时定量PCR细胞分析（定量PCR）

1. 准备96孔板。
   1. 放置在冰上的qPCR反应的所有成分:1μL的cDNA，0.25微米的正向引物，0.25μM反向引物，5μL的SYBR绿，3.5微升的PCR级水，以10μL的总体积。使用的SYBR Green，准备预混一式三份运行的所有样本。
   2. 一旦主结构完成后，旋涡，使均匀。等分试样9的qPCR的微升主混合物到96-WLL板的各孔中。后，小心加cDNA的1微升到每口井。反应总量将成为10微升。
   3. 加载完成后，密封用光学96孔平板粘合膜和短暂离心96孔板（50×g离心1分钟）。
2. 运行样品在实时PCR仪。处密封保存96孔板为实时PCR仪和运行样品按照仪器制造商的建议。标准和快速循环的例子包括在下面。
   1. 对于标准循环参数，使用以下命令:预变性94℃120秒，然后94℃40个循环15秒，60℃60秒，然后有选择地在4℃举行。
   2. 对于快速循环参数:使用以下命令:94℃预变性30秒，然后95℃40个循环5秒，58℃15秒，然后72℃10秒。
3. 参考仪器手册，了解有关如何分析数据的指导。

7.通过ELISA细胞上清液的分析

注:根据制造商的协议执行的所有步骤。

1. 样品制备
   1. 稀释分装398微升到单独的试管。吸取2μL细胞上清液样品放入398微升稀释剂管。这将提供为200的稀释倍数。
   2. 对每个样品重复步骤7.1.1进行测试。
2. 程序
   1. 吸取100μL的200倍稀释的样品和标准于96孔板的孔中。
   2. 孵育96孔板在25℃下用在以150rpm微孔板摇床上45分钟。
   3. 洗孔5次用1×洗涤缓冲液。一旦最后一次洗涤完成后，取出用吸水纸全部残留洗涤液。
   4. 加入酶标试剂500微升到每口井。
   5. 重复步骤7.2.2 - 7.2.3。
   6. 吸取100μL的四甲基联苯胺（TMB）试剂到96孔板的每个孔中。
   7. 轻轻在25℃的微量混合96孔板20分钟摇床在150rpm。通过直接加入100微升的终止溶液以每孔停止反应，并轻轻混合。一旦停止溶液的颜色应该变黄。这个通知的终止溶液已正确混合。
   8. 使用微量滴定板读数器，确定第一个5分钟内450nm处的光密度。
3. 结果计算
   1. 计算每个样本和每个标准平均吸光度值（A _450）的表。
   2. 在NG密谋反对它的标准浓度每个标准的A ₄₅₀平均组装的标准曲线/毫升的线性图。允许x轴表示的浓度和y轴来表示A ₄₅₀值。
   3. 利用意味着从每个稀释样品A _450，从标准曲线确定毫微克/毫升所需蛋白的浓度。
   4. 通过稀释事实上乘以样品浓度河这将允许用于确定细胞上清液样品中的所希望的蛋白质的实际浓度。
   5. 绘制从样本构建表成线图。如果OD ₄₅₀值在标准曲线的外部，样品应适当地稀释并重新测试。
   6. 结果归为500,000个细胞。

结果

组织学

一次分离和培养的细胞的代表性光显微镜图像在图1A中描绘。免疫细胞化学分析表明，分离的肝细胞中高度表达白蛋白（红色），以及成纤维细胞生长因子受体-4（FGFR4）（绿色）。细胞核用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（蓝色）。 （ 图1B）。

定量?...

讨论

从小鼠中分离原代肝细胞是一种快速，廉价和可靠的工具来研究炎症反应体外。如果正确执行，结果可以很容易地生成并及时和具有成本效益的方式再现。以下几点应仔细评估，以确保成功隔离。

手术切口和下腔静脉的插管应在全身麻醉下，不安乐死之后进行。一个年轻的，缺乏经验的调查员将需要更多的时间在一开始就熟悉小鼠腹部的解剖学特征，并进行正确的插?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables
Cell Strainer 70 μm Nylon cell strainer	Falcon	352350
BD Insyte Autoguard	BD	381412
50 mL Polypropylene Conical Tube	Falcon	352098
100 6-inch Cotton Tipped Applicators	Puritan	806-WC
1cc U-100 Insulin Syringe 28 G 1/2	Becton Dickinson	329420
Tissue Culture Dish 100 x 20 mm Style	Corning	353003
6 well Cell Culture Cluster	Costar	3516
5/0 Black Braided Surgical Silk (100 yards)	LOOK	SP115
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Minipuls 3 Perfusion Pump	Gilson	F155007
Hemacytometer Kits, Propper	VWR	48300-474
Hemacytometer Cover Glasses, Propper	VWR	48300-470
Surgical Scissers - Sharp/Blunt	F.S.T.	14001-12
Iris Scissors-ToughCut Straight	F.S.T.	14058-11
Dumont SS-45 Forceps	F.S.T.	11203-25
Student Tissue Forceps	F.S.T.	991121-12
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Acetic acid solution, 2.0 N	Sigma	A8976-100ML
Isoflurane, USP 250 mL	Piramal Healthcare	66794-013-25
KetaVed 1,000 mg/10 mL (100 mg/mL)	VEDCO	50989-161-06
Xylazine 100 mg/mL	AnaSed Injection	139-236
Willams' Medium E (1x)	gibco	12551-032
Liver Perfusion Medium (1x)	gibco	17701-038
Liver Digest Medium (1x)	Life Technologies	17703034
Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements	Life Technologies	CM3000
Primary Hepatocyte Maintenance Supplements	Life Technologies	CM4000
Phosphate Buffer Saline (PBS) pH 7.4	ThermoFisher scientific	10010031
Collagen Type 1	Corning	354236
Trypan Blue Solution	VWR	45000-717