마우스에서 차 간세포 문화에 염증 반응의 유도

요약

여기서는 성인 마우스로부터 일차 간세포를 분리하는 효소 방법을 보여, 우리는 ELISA 및 실시간 PCR을 이용하여 염증 반응을 정량 설명한다.

초록

간은 전신적인 염증 반응의 조절에 결정적인 역할을한다. 특히 만성 신장 질환, 간은 요독, 산화 스트레스, 내 독소 혈증 및 급성기 반응물의 대량 생산으로 염증성 사이토 카인 순환 감소 간격에 응답하여 반응한다. 염증 및 간세포의 기본 역할 실험 도구 연구는 만성 신장 질환으로 특히 복잡한 설정에서 규제와 간 사이토 카인의 기여 전신 급성 위상 응답 및 연장 염증성 시나리오를 이해하기 중요하다. 생체 내에서 염증의 복잡한 메커니즘을 연구하는 것은 도전 남아 있기 때문에, 리소스를 많이 사용하는 보통 및 형질 전환 동물의 사용을 필요로 차 격리 된 간세포는 간 급성 위상 응답으로 기계적인 통찰력을 얻을 수있는 강력한 도구를 제공합니다. 이 체외 기술은 적당한 비용을 갖추고 있기 때문에, 높은 재생산성 및 일반적인 기술 지식은 주 절연 간세포 쉽게 스크리닝 방법으로 사용될 수있다. 여기, 우리는 기본 쥐의 간세포를 분리하는 효소 기반의 방법을 설명하고, 우리는 ELISA 및 정량 실시간 PCR을 사용하여 이러한 세포에서 염증 반응의 평가에 대해 설명합니다.

서문

만성 신장 질환 (CKD)는 급성 및 만성 염증 ^(1)의 상태로 정의 될 수있다. CKD 환자에서 phosphaturic 호르몬 섬유 아세포 성장 인자 23 (FGF23)의 혈중 농도가 점진적 혈청 ^{인산염이 항상성을} 유지하기 위해 증가. 증가 된 혈청 FGF23 수준은 독립적으로 혈액 투석 치료 ^{3, 4를} 시작하는 환자 중 심혈 관계 이환율과 사망률과 연관되어 있습니다. 또한, 여러 임상 연구 상승 FGF23 수준 및 C 반응성 단백질 (CRP), 인터루킨 6 (IL-6) 및 종양 괴사 인자 α (TNFα) ^{(5), (6)의} 혈청 레벨 사이의 강한 상관 관계를 보여 주었다. 또한, 실험 연구에서, 우리는 최근에 FGF23 직접 간세포를 대상으로하고 증가 CRP와 IL-6 페이지에 의한 염증 반응을 일으킬 수 있다는 것을 증명하고있다간 ⁷ roduction. 따라서, FGF23는 CKD에 전신 염증에 기여하는 순환 요인으로 작용할 수 있습니다.

70 년대 초, 차 간세포는 고립되었다 처음으로 ⁸ 공부했다. 이후 일차 배양 된 간 세포는 ^{광범위하게, 열 처리는} 대사 호르몬 기능 약물 대사 및 독성뿐만 아니라 면역 및 염증 ^반응을 조사 ^구하는데 사용되어왔다. 이전 프로토콜은 주로 인간 간 조직 ^{(11) (12)로부터} 일차 간세포의 효소 격리 설명 하였다. 우수한 모델이지만,이 복합 간 시그널링 메커니즘뿐만 아니라 자극의 종류에 따라 기능적 결과에 미치는 영향을 연구하는 유전자 조작 능력을 남긴다. 이하에서, 우리는 기본 쥐 간세포의 단리를 설명. 특히, 예컨대 리포 폴리 사카 라이드 (LPS), IL-6와 같은 FGF23 간 급성 단계 반응의 여러 매개체의 효과는 쉽게 빠르고 재현성있는 방법 ^(13)에 분석 될 수있다.

여기서, 우리는 성체 생쥐에서 간세포의 효소 격리를위한 프로토콜을 제공하고, 우리는 LPS 및 IL-6과 같은 FGF23 같은 신규 염증성 매개체로서 염증 확립 유도제는 직접 발현 및 분비를 자극 할 수 있음을 입증 이러한 배양 간세포 CRP 및 IL-6과 같은 염증성 사이토킨.

프로토콜

모든 동물 프로토콜과 실험 절차는 의학의 마이애미 밀러 학교의 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.

1. 준비

1. 데우고 간 관류 미디어 간 37 ℃에서 수욕 미디어 다이제스트.
2. 관류 펌프 (30 mL / 분)를 설정합니다. 조심스럽게 간 관류 미디어와 펌프의 배관 시스템을 미리 기입. 시스템의 모든 공기 방울을 피하고 정위 현미경을 준비합니다.
3. I 제조사의 프로토콜에 따라 콜라겐 타입을 사용 외투 세포 배양 접시.

2. 간 복구

1. 산소 / 흡입 이소 플루 란 (이소 플루 4 % / 2 L / min의 산소)를 이용하여 공여 마우스를 마취.
   1. 2-2.5 %의 이소 플루 란을 저하 또는 마취제를 주입하여 마취를 유지한다 (100 ㎎ / ㎏ 복강 신체 체중)과 자일 라진 (체중이 10 ㎎ / kg intraperitoneally). 연속 이소 플루 란 마취 케타민 혈압을 낮추고 간독성을 유발할 수 있기 때문에 바람직하다.
2. 흡수 패드에 마취 마우스를 놓습니다. 접착 테이프로 마우스의 사지를 고정합니다.
3. 면도와 마우스의 복부를 소독하고 선명한 / 무딘 팁 수술 가위를 사용하여 간의 두개골 경계에 치골에서 복부 개복술을 수행합니다. 양측 복벽, 진동판의 꼬리를 절개.
4. 심하게 우측으로 부위를 이동하여 하대 정맥 (IVC)을 노출. 조심스럽게 멸균 솜 팁 면봉와 각도 팁 집게를 사용하여 IVC 주변의 지방 조직을 해부하다.
5. suprahepatic 다이어프램을 절개하고 선명한 / 날카로운 팁 미세 수술 가위를 사용하여 두 개의 횡 절개하여 흉강을 엽니 다. 흉부 IVC는 수술 실크 (5/0)를 사용하여 결찰.
6. 조심스럽게 바늘을 제거, 차폐 정맥 카테터를 사용하여 infrarenal IVC를 Cannulate관류 펌프를 연결하고 간을 관류 시작합니다. 제대로 수행 한 경우, 간은 즉시 희게하고 팽창하기 시작한다.
7. 미세 수술 가위를 사용하여 혈액 및 관류 미디어의 적절한 배수를 허용 정 맥 포털을 가로로 쪼개다.
8. 간 관류 매체의 약 30 ㎖로 간을 관류하고 용지 (30 ㎖)를 소화 간 전환. 관류 펌프를 끄고 관류가 완료되면 정맥을 제거합니다.
9. 부드럽게 간의 중심 영역을 노출하고 간 로브를 연결하는 연결 조직을 찾습니다. 중앙 연결 섬유를 잡고 조심스럽게 자리에 간을 들고 모든 조직을 해부 살짝 간을 제거합니다.
10. 즉시 소화 매체 간 15ml를 함유하는 50 ㎖ 폴리 프로필렌 원추형 튜브 간을 옮긴다.
    참고 :이 단계에 대한 구체적인 타임 라인이 없습니다. 재관류 후, 간은 무균 세포 배양 후드에 전송을 위해 다이제스트 미디어에 남아 있습니다. 모든이야ubsequent 단계가 무균 환경에서 수행되어야한다.

세포의 3. 분리 및 치료

1. 세포 배양 후드 내 멸균 조직 배양 접시에 50 ㎖ 폴리 프로필렌 원추형 튜브 함유 소화 매체 간을 옮긴다.
2. 멸균 포셉 사용하여 부드럽게 간의 네 로브 눈물. 제대로 수행 한 경우, 소화 매체 인해 간에서 간세포를 분리에 혼탁이 될 것이다.
3. 25 mL의 멸균 피펫 팁을 사용하여, 소화 조직 입자 및 세포 파편을 제거하기 위해 새로운 50 ㎖ 폴리 프로필렌 원추형 튜브에 70 ㎛의 나일론 세포 여과기를 통해 혼탁 소화 매체 필터.
4. 반복 3.2 멸균 인산 완충 식염수 (PBS) 3.3 단계. 이는 간에서 잔류 간세포를 분리하여 지원한다.
5. 4 ℃에서 2 분 50 XG에 원심 분리기. 25 mL의 차가운 1X 세포를 다시 일시 중지 부드럽게 초과 세포 파편을 포함 뜨는을 기음과윌리엄스 '중간 E.
6. 25 mL의 멸균 피펫 팁을 사용하여, 청소기 현탁액을 달성하기 위해 50 ㎖ 폴리 프로필렌 원추형 튜브에 새로운 70 ㎛의 나일론 세포 여과기를 통하여 재 현탁액을 필터.
7. 반복 3.5 및 명확한 세포 현탁액을 얻기 위해 추운 윌리엄스 '중간 E 1X를 사용하여 세 개의 추가 세척 3.6 단계를 반복합니다.
8. 최종 세척 단계 후, 흡 상등액 초과 균체 잔사를 제거했다. 다시 일시 중지하고 50 mL의 폴리 프로필렌 원뿔 관에 새로운 70 μm의 나일론 셀 스트레이너를 통해 차 간세포 해동 및 도금 보충제를 포함 25 mL의 따뜻한 윌리엄스 '미디어 E 1 배속에서 필터 세포.
9. 혈구를 사용하여 25 ㎖의 세포 현탁액 내의 셀 개수. 성인 간 당 2000 만 셀 - 평균적으로 15을 기대합니다. 트리 판 블루 염색을 사용하여 세포 생존을 결정합니다.
10. 콜라겐 코팅 6 잘 가전에 차 간세포 해동 및 도금 보충제를 포함 2 mL의 '윌리엄스의 미디어 E 1 배속에서 플레이트 세포LL 문화 클러스터 (물론 당 9 × 10 ⁵ 세포).
11. 4 시간 후, 차 간세포 유지 보수 보충제를 포함 윌리엄스 '미디어 E 1 배속 미디어를 변경합니다.
12. 24 시간 후, 혈청 둘 베코의 변형 이글 배지 (DMEM) 미디어 1 배 6 시간 동안 세포를 굶어.
13. 차량 FGF23 (25 NG / ㎖), LPS로 PBS로 세포를 처리 (100 μg의 / ㎖) 또는 무 혈청 배지에서 IL-6 (50 ng의 / ㎖) 및 24 시간 동안 배양한다.

RNA 4. 분리

1. 제조업체의 지시에 따라 상용 스핀 컬럼 키트를 사용하여 RNA를 준비한다.

역전사에 의해 고립 된 RNA 5. 생성 된 cDNA

1. PCR의 튜브에 고립 된 RNA 샘플의 200 NG를 추가합니다.
2. 단계 5.1에서 효소가없는 H ₂ O PCR에 튜브 14 μL를 추가합니다.
3. 단계 5.1에서 PCR 튜브에 역전사 효소의 4 μL를 추가합니다.
4. 혼합물이 균일하게 부드럽게 내용을 다시 중단; 부드럽게 원심 분리기.
5. 열 순환기에 혼합물을 포함하는 PCR 튜브를 놓습니다. 실행 역전사에 대한 열 순환기 : 다음 25 ° C (5 분), 42 ° C (30 분)의 1주기, 85 ° C (5 분)와 4 ° C에서 개최합니다. 최종 제품은 원하는 cDNA를 할 것이다.

6. 정량적 실시간 PCR에 의한 세포의 분석 (qPCR에)

1. 96 웰 플레이트를 준비합니다.
   1. 1 μL의 cDNA, 0.25 μM 정방향 프라이머, 0.25 μM 역방향 프라이머, 5 μL SYBR 녹색, 10 μL의 총 부피 3.5 μL PCR 등급 물 : 얼음에 qPCR에 반응의 모든 구성 요소를 배치합니다. SYBR 녹색을 사용하여, 세중의 모든 샘플을 실행하는 마스터 믹스를 준비합니다.
   2. 마스터 믹스가 완료되면 소용돌이는 균질 확인합니다. 96 WLL 플레이트의 각 웰에 나누어지는 9 μL qPCR에의 마스터 믹스. 후 신중하게 잘 각각에 cDNA를 1 μL를 추가합니다. 총 반응 부피는 10 μL 될 것입니다.
   3. 로딩이 완료된 후 광 96 웰 플레이트를 밀봉접착 필름 간단히 원심 분리기 96 웰 플레이트 (1 분 50 XG).
2. 리얼 타임 PCR 기기에서 실행 샘플. 실시간-PCR 기기에 밀봉 된 96 웰 플레이트 및 장비 제조업체 권장 사항에 따라 실행 샘플을 놓습니다. 표준 및 빠른 사이클의 예는 아래에 포함되어 있습니다.
   1. 60 초 동안, 15 초 동안 다음, 120 초 동안 94 ° C에서 60 ° C를 94 ° C의 40주기를 초기 변성 한 다음 선택적으로 4 ° C에서 개최 : 표준 사이클 파라미터를 들어, 다음을 사용합니다.
   2. 빠른 순환 매개 변수의 경우 : 5 초, 15 초 동안 58 ° C, 10 초 동안 다음 72 ° C에 대해 다음 30 초 동안 95 ° C의 40주기를 94 ° C에서 초기 변성 다음을 사용합니다.
3. 데이터를 분석하는 방법에 대한 지침은 장비 설명서를 참조하십시오.

ELISA에 의한 세포 상층 액 7. 분석

참고 : 제조사의 프로토콜에 따라 모든 단계를 수행합니다.

1. 샘플 준비
   1. 별도의 튜브에 희석제 398 μL를 분배. 398 μL 희석액 튜브에 세포 상층 액 샘플의 피펫 2 μL. 이것은 200의 희석 배를 제공 할 것입니다.
   2. 각 샘플 단계를 반복 7.1.1 테스트 할 수 있습니다.
2. 순서
   1. 피펫 100 내지 200 배 희석 한 시료와 μL를 96 웰 플레이트의 웰에 표준.
   2. 150 rpm에서 마이크로 플레이트 쉐이커상에서 45 분 동안 25 ° C에서 96 웰 플레이트를 인큐베이션.
   3. 우물을 1 배 세척 완충액으로 5 회 반복한다. 마지막으로 세탁이 완료되면, 흡수지 모든 잔여 세척액을 제거한다.
   4. 각 웰에 HRP-복합 시약 500 μL를 추가합니다.
   5. 7.2.3 - 반복 7.2.2 단계를 반복합니다.
   6. 테트라 메틸 벤지딘의 피펫 100 μL (TMB) 96 웰 플레이트의 각 웰에 시약.
   7. 부드럽게 마이크로 플레이트에서 20 분 동안 25 ° C에서 96 웰 플레이트 믹스150 rpm에서 진탕. 직접 각 웰에 정지 용액 100 μL를 첨가하여 반응을 정지하고 부드럽게 혼합한다. 정지 용액을 첨가 한 후에 색깔이 황색 회전한다. 이것은 정지 용액 정확하게 혼합되었음을 알린다.
   8. 미세 적정 플레이트 판독기를 사용하여, 처음 5 분 이내에 450 nm에서의 광학 밀도를 결정한다.
3. 결과의 계산
   1. 각각의 샘플 및 각 표준에 대한 평균 흡광도 값 (A _450)의 표를 계산합니다.
   2. NG에 표준 농도에 대한 각 기준의 ₄₅₀ 평균 음모를 꾸미고하여 표준 곡선을 조립 / 선형 그래프 mL로. X 축이 농도 및 _450의 값을 나타내는 Y 축를 대표 할 수있다.
   3. (가) 각 희석 된 시료에서 _{450 의미} 이용하여, 표준 곡선으로부터 NG / ㎖에서 목적 단백질의 농도를 결정한다.
   4. 사실상 희석하여 샘플의 농도를 곱아르 자형. 이것은 세포 상등액 시료 중에 목적 단백질의 실제 농도를 결정하기 위해 허용 할 것이다.
   5. 선 그래프로 샘플에서 구성된 테이블을 플롯. OD ₄₅₀ 값이 표준 곡선의 밖에있는 경우, 샘플을 적절하게 희석해야하고 다시 테스트.
   6. 500,000 셀에 결과를 정상화.

결과

조직학

기본 격리 및 배양 된 세포의 대표적인 광학 현미경 이미지는도 1a에 도시되어있다. 면역 조직 화학적 분석은 절연 간세포 높은 알부민 (적색)뿐만 아니라, 섬유 아세포 성장 인자 수용체 4 (FGFR4) (녹색)을 표현할 수 있음을 보여준다. 핵 4 ', 6-diamidino-2-페닐 인돌 (DAPI) (파란색)로 염색된다. (그림 1B).

토론

마우스에서 차 간세포를 분리하면 염증 반응 생체를 연구하는 빠르고, 저렴하고 신뢰할 수있는 도구입니다. 정확하게 수행하면 결과가 쉽게 발생하고, 신속하고 비용 효율적인 방식으로 재생 될 수있다. 다음 사항을 신중 성공적인 차단을 보장하기 위해 평가되어야한다.

수술 절개와 IVC의 삽관은 전신 마취가 아닌 안락사 후 수행해야합니다. 젊은, 경험이 연구...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables
Cell Strainer 70 μm Nylon cell strainer	Falcon	352350
BD Insyte Autoguard	BD	381412
50 mL Polypropylene Conical Tube	Falcon	352098
100 6-inch Cotton Tipped Applicators	Puritan	806-WC
1cc U-100 Insulin Syringe 28 G 1/2	Becton Dickinson	329420
Tissue Culture Dish 100 x 20 mm Style	Corning	353003
6 well Cell Culture Cluster	Costar	3516
5/0 Black Braided Surgical Silk (100 yards)	LOOK	SP115
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Minipuls 3 Perfusion Pump	Gilson	F155007
Hemacytometer Kits, Propper	VWR	48300-474
Hemacytometer Cover Glasses, Propper	VWR	48300-470
Surgical Scissers - Sharp/Blunt	F.S.T.	14001-12
Iris Scissors-ToughCut Straight	F.S.T.	14058-11
Dumont SS-45 Forceps	F.S.T.	11203-25
Student Tissue Forceps	F.S.T.	991121-12
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Acetic acid solution, 2.0 N	Sigma	A8976-100ML
Isoflurane, USP 250 mL	Piramal Healthcare	66794-013-25
KetaVed 1,000 mg/10 mL (100 mg/mL)	VEDCO	50989-161-06
Xylazine 100 mg/mL	AnaSed Injection	139-236
Willams' Medium E (1x)	gibco	12551-032
Liver Perfusion Medium (1x)	gibco	17701-038
Liver Digest Medium (1x)	Life Technologies	17703034
Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements	Life Technologies	CM3000
Primary Hepatocyte Maintenance Supplements	Life Technologies	CM4000
Phosphate Buffer Saline (PBS) pH 7.4	ThermoFisher scientific	10010031
Collagen Type 1	Corning	354236
Trypan Blue Solution	VWR	45000-717