L'induzione di una risposta infiammatoria in colture primarie epatociti di topi

Riepilogo

Qui vi mostriamo un approccio enzimatico per isolare epatociti primari da topi adulti, e descriviamo la quantificazione di una risposta infiammatoria con ELISA e PCR in tempo reale.

Abstract

Il fegato svolge un ruolo determinante nella regolazione dell'infiammazione sistemica. Nella malattia renale cronica in particolare, il fegato reagisce in risposta al ambiente uremico, stress ossidativo, endotossiemia e la clearance dell'amlodipina circolante citochine proinfiammatorie producendo un gran numero di proteine ​​della fase acuta. strumenti sperimentali per studiare l'infiammazione e il ruolo di fondo di epatociti sono cruciali per comprendere la regolamentazione e il contributo di citochine epatiche ad una risposta di fase acuta sistemica e uno scenario pro-infiammatoria prolungata, particolarmente in un contesto complicato come la malattia renale cronica. Dal momento che lo studio complessi meccanismi di infiammazione in vivo rimane difficile, e di solito ad alta intensità di risorse richiede l'utilizzo di animali transgenici, epatociti isolati primari forniscono uno strumento robusto per acquisire conoscenze meccanicistici nella risposta della fase acuta epatica. Poiché questa tecnica in vitro offre costi contenuti, alta reproducibilità e la conoscenza tecnica comune, epatociti isolati primari possono anche essere facilmente utilizzato come un approccio di screening. Qui, descriviamo un metodo enzimatico-based per isolare epatociti murini primari, e descriviamo la valutazione di una risposta infiammatoria in queste cellule utilizzando ELISA e quantitativa real-time PCR.

Introduzione

Malattia renale cronica (CKD) può essere definita come uno stato di infiammazione acuta e cronica ^1. Nei pazienti con insufficienza renale cronica, i livelli sierici del fattore di crescita dei fibroblasti ormone phosphaturic 23 (FGF23) progressivo aumento al fine di mantenere l'omeostasi fosfato sierico ^2. L'aumento dei livelli sierici di FGF23 sono indipendentemente associati con la morbilità e mortalità cardiovascolare tra i pazienti che iniziano il trattamento di emodialisi ^{3, 4.} Inoltre, diversi studi clinici hanno dimostrato una forte correlazione tra i livelli di FGF23 elevate e livelli sierici di proteina C-reattiva (CRP), interleuchina-6 (IL-6) e Tumor Necrosis Factor α (TNF-alfa) ^{5, 6.} Inoltre, in uno studio sperimentale, abbiamo recentemente dimostrato che FGF23 può indirizzare direttamente epatociti e provocare una risposta infiammatoria aumentando CRP e IL-6 produzione nel fegato ^7. Quindi, FGF23 potrebbe agire come un fattore che contribuisce alla circolazione infiammazione sistemica in CKD.

Nei primi anni '70, epatociti primari sono stati isolati e studiati per la prima volta ^8. Da allora le cellule epatiche in coltura primaria sono stati ampiamente utilizzati per esaminare il trattamento metabolico, la funzione ormonale, il metabolismo dei farmaci e la tossicità, nonché immunità e le risposte infiammatorie ^{9, 10.} Protocolli precedenti hanno descritto principalmente l'isolamento enzimatica di epatociti primari da tessuto epatico umano ^{11, 12.} Mentre un modello eccellente, questo lascia la possibilità di studiare come genetica manipolazione riguarda i meccanismi di segnalazione epatica complessi così come conseguenze funzionali su diversi tipi di stimoli. Nel seguito si descrive l'isolamento di epatociti primari murini. In particolare, l'effetto di diversi mediatori della risposta di fase acuta epatica, come lipopolisaccaride (LPS), IL-6 e FGF23 può essere analizzato in modo facile, veloce e riproducibile ^13.

Qui, vi presentiamo un protocollo per l'isolamento enzimatica di epatociti di topi adulti, e dimostriamo che induttori stabiliti di infiammazione, come LPS e IL-6, così come mediatori infiammatori innovative come le FGF23, in grado di stimolare direttamente l'espressione e la secrezione di citochine infiammatorie, come la PCR e iL-6 in epatociti coltivati.

Protocollo

Tutti i protocolli di animali e procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) dell 'Università di Miami Miller School of Medicine.

1. Preparazione

1. mezzi di perfusione epatica di preriscaldamento e fegato digerire media in un bagno d'acqua a 37 ° C.
2. Impostare una pompa di perfusione (30 mL / min). precompilare con attenzione il sistema di tubi della pompa con mezzi di perfusione epatica. Evitare eventuali bolle d'aria nel sistema e preparare il microscopio stereotassica.
3. Coat piatti di coltura cellulare utilizzando collagene di tipo I secondo il protocollo del produttore.

2. Il recupero del fegato

1. Anestetizzare il mouse donatore utilizzando ossigeno / inalazione isoflurano (isoflurano 4% / 2 L / min di ossigeno).
   1. Mantenere anestesia abbassando isoflurano al 2-2,5% o iniettando ketamina (100 mg / kg di peso corporeo per via intraperitoneale) e xilazina (10 mg / kg di peso corporeo intraperitoneally). Continuo anestesia isoflurano è preferito da ketamina abbassa la pressione sanguigna e può causare epatotossicità.
2. Posizionare il mouse anestetizzato su un tampone assorbente. Fissare le estremità del topo con del nastro adesivo.
3. Shave e disinfettare l'addome del mouse ed eseguire una laparotomia ventrale dal pube fino al confine craniale del fegato con le forbici chirurgiche con punte affilate / smussato. Incidere la parete addominale su entrambi i lati, caudale del diaframma.
4. Esporre la vena cava inferiore (IVC) spostando attentamente l'intestino al lato destro. sezionare con cura il tessuto grasso intorno alla IVC utilizzando sterili tamponi punta di cotone e pinze punta angolata.
5. Incidere il diaframma sovraepatica e aprire la cavità toracica da due incisioni laterali con le forbici chirurgiche sottili con punte taglienti / appuntiti. Legare l'toracica IVC utilizzando seta chirurgica (5/0).
6. Cannulate il infrarenale IVC utilizzando un catetere IV schermato, rimuovere con attenzione l'ago,collegare la pompa di perfusione e iniziare perfusione del fegato. Se eseguita correttamente, il fegato dovrebbe iniziare immediatamente a scottare e si gonfiano.
7. Transetto della vena porta che consente il drenaggio adeguato dei mezzi di comunicazione di sangue e perfusione con le forbici chirurgiche sottili.
8. Profumato fegato con circa 30 ml di fegato mezzi perfusione, e poi passare a fegato digerire i media (30 ml). Spegnere la pompa di perfusione e rimuovere la cannula volta perfusione è completa.
9. esporre delicatamente la regione centrale del fegato e individuare il tessuto connettivo che collega i lobi del fegato. Afferra le fibre che collegano centrali e con attenzione sezionare tutti i tessuti che tengono il fegato in atto e rimuovere delicatamente il fegato.
10. Trasferire immediatamente il fegato in un tubo conico da 50 ml in polipropilene contenente 15 ml di fegato digerire media.
    NOTA: Non c'è tempo-linea specifica per questo passo. Dopo perfusione, il fegato rimane in mezzi Digest per il trasporto ad una cappa sterile coltura cellulare. Tutti spassi ubsequent devono essere eseguite in un ambiente sterile.

3. Isolamento e trattamento delle cellule

1. All'interno di una cappa di coltura cellulare, trasferire il fegato da terreni contenenti digestione 50 mL provetta di polipropilene conica in una piastra di coltura tissutale sterili.
2. Utilizzando pinze sterili, strappare delicatamente i quattro lobi del fegato. Se eseguita correttamente, medio digestione dovrebbe diventare torbida a causa di isolare epatociti dal fegato.
3. Utilizzando una punta 25 mL pipetta sterile, filtrare il mezzo di digestione torbida attraverso un colino 70 micron cella nylon in una nuova provetta conica da 50 ml in polipropilene per rimuovere le particelle di tessuto non digerito e detriti cellulari.
4. Ripetere i punti 3.2 e 3.3 con sterile PBS (PBS). Questo aiuta a rimuovere eventuali residui epatociti dal fegato.
5. Centrifugare a 50 xg per 2 minuti a 4 ° C. Aspirare il surnatante contenente detriti cellulari in eccesso e delicatamente risospendere le cellule in 25 ml 1x freddoWilliams 'Media E.
6. Utilizzando un 25 mL punta pipetta sterile, filtrata del risospensione attraverso un nuovo 70 micron colino cella di nylon in un tubo da 50 ml in polipropilene conica per ottenere una sospensione più pulito.
7. Ripetere i punti 3.5 e 3.6 per tre lavaggi aggiuntivi utilizzando freddo Williams 'Medium E 1x per ottenere una sospensione di cellule più chiara.
8. Dopo l'ultimo lavaggio, aspirare il surnatante per rimuovere i detriti delle cellule in eccesso. Risospendere e celle filtranti in 25 ml caldo Williams 'Media e 1x che contiene lo scongelamento degli epatociti primari e integratori placcatura attraverso un nuovo 70 micron colino cella di nylon in un tubo da 50 ml in polipropilene conica.
9. Contare le celle all'interno della sospensione cellulare 25 mL con un emocitometro. In media si aspettano 15 - 20 milioni di cellule per il fegato adulto. Determinare la vitalità delle cellule utilizzando trypan colorazione blu.
10. cellule piastra in 2 ml di Williams 'Media e 1x che contiene lo scongelamento degli epatociti primari e supplementi placcatura su un collagene rivestito ce 6-benell cultura del cluster (9 x 10 ⁵ cellule per pozzetto).
11. Dopo 4 ore, cambiare media per Williams 'Media e 1x che contiene gli integratori di manutenzione epatociti primari.
12. Dopo 24 ore, il siero di fame le cellule con medie di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) supporti 1x per 6 ore.
13. Trattare cellule con PBS come veicolo, FGF23 (25 ng / mL), LPS (100 ug / mL) o IL-6 (50 ng / ml) in terreno privo di siero e incubare per 24 h.

4. Isolamento di RNA

1. Preparare RNA utilizzando un kit Spin Column commerciale in base alle istruzioni del produttore.

5. Generazione di cDNA da RNA isolato mediante trascrizione inversa

1. Aggiungere 200 ng di campione di RNA isolato dalla provetta.
2. Aggiungere 14 ml di-endonucleasi libera H ₂ O per PCR tubo dal punto 5.1.
3. Aggiungere 4 ml di trascrittasi inversa per provetta PCR dal punto 5.1.
4. Risospendere il contenuto con precauzione per fare miscela omogenea; centrifugare delicatamente.
5. Mettere provetta PCR contenente il composto in un termociclatore. Eseguire termociclatore per trascrizione inversa: 1 ciclo di 25 ° C (5 min), 42 ° C (30 min), 85 ° C (5 min) e poi mantenere a 4 ° C. Il prodotto finale sarà il cDNA desiderato.

6. Analisi di celle quantitativa Real-time PCR (qPCR)

1. Preparare la piastra a 96 pozzetti.
   1. Mettere tutti i componenti della reazione qPCR su ghiaccio: 1 ml di cDNA, .25 micron di primer in avanti, .25 micron inversione di fondo, 5 ml SYBR Green, 3,5 microlitri PCR acqua di grado per un volume totale di 10 microlitri. Utilizzando SYBR Green, preparare master mix per eseguire tutti i campioni in triplice copia.
   2. Una volta che il master mix è completo, vortex per rendere omogenea. Aliquota 9 ml di qPCR master mix in ciascun pozzetto di una piastra da 96 WLL. Dopo, aggiungere con cautela 1 ml di cDNA in ciascun pozzetto. Volume di reazione totale sarà di 10 ml.
   3. Dopo il caricamento è completo, sigillare piastra a 96 pozzetti con otticapellicola adesiva e centrifugare brevemente piastra a 96 pozzetti (50 xg per 1 min).
2. Campioni eseguito in uno strumento di Real-Time PCR. Mettere sigillato piastra a 96 pozzetti in vero e proprio strumento Time-PCR e campioni Esegui come strumento per le raccomandazioni del produttore. Esempi di cicli standard e veloci sono stati inseriti.
   1. Per i parametri di ciclismo normali, utilizzare il seguente: denaturazione iniziale a 94 ° C per 120 s, quindi 40 cicli di 94 ° C per 15 s, 60 ° C per 60 s, e quindi opzionalmente tenere a 4 ° C.
   2. Per i parametri ciclo rapido: utilizzare il seguente: denaturazione iniziale a 94 ° C per 30 s, quindi 40 cicli di 95 ° C per 5 s, 58 ° C per 15 s, quindi 72 ° C per 10 s.
3. Fare riferimento al manuale dello strumento per una guida su come analizzare i dati.

7. Analisi dei sopranatanti cellulari di ELISA

NOTA: Tutte le operazioni vengono eseguite secondo il protocollo del produttore.

1. Preparazione del campione
   1. Dispensare 398 ml di diluente in tubi separati. Pipettare 2 ml del campione surnatante cellulare nella provetta di diluente 398 ml. Ciò fornirà una piega diluizione 200.
   2. Ripetere il passaggio 7.1.1 per ogni campione da analizzare.
2. Procedura
   1. Pipettare 100 ml di campione diluito 200 volte e uno standard nei pozzetti di una piastra da 96 pozzetti.
   2. Incubare la piastra a 96 pozzetti a 25 ° C per 45 minuti su un agitatore per micropiastre a 150 rpm.
   3. Lavare i pozzetti 5 volte con soluzione tampone di lavaggio 1x. Una volta che l'ultimo lavaggio, rimuovere tutta la soluzione di lavaggio residua con carta assorbente.
   4. Aggiungere 500 ml di reagente HRP-coniugato in tutti i pozzetti.
   5. Ripetere i punti 7.2.2 - 7.2.3.
   6. Pipettare 100 ml di tetrametilbenzidina (TMB) dei reagenti in ciascun pozzetto della piastra da 96 pozzetti.
   7. Mescolare delicatamente piastra a 96 pozzetti a 25 ° C per 20 minuti su una micropiastraagitatore a 150 rpm. Arrestare la reazione aggiungendo direttamente 100 ml di soluzione di stop in ogni pozzetto e mescolare delicatamente. Una volta aggiunto alla soluzione di arresto il colore deve diventare giallo. Questo informa che la soluzione di arresto è stato correttamente miscelata.
   8. Utilizzo di un lettore di micropiastra, determinare la densità ottica a 450 nm entro i primi 5 minuti.
3. Calcolo dei risultati
   1. Calcolare una tabella di valori di assorbanza media (A ₄₅₀₎ per ogni campione e ciascuno standard.
   2. Montare una curva standard tracciando la media A ₄₅₀ di ogni standard contro la sua concentrazione standard in ng / mL su un grafico lineare. Consentire l'asse x per rappresentare la concentrazione e l'asse y per rappresentare A ₄₅₀ valori.
   3. Utilizzando la media A ₄₅₀ da ciascun campione diluito, determinare la concentrazione della proteina desiderata in ng / mL dalla curva standard.
   4. Moltiplicare la concentrazione del campione per la diluizione di fattor. Ciò consentirà per determinare la concentrazione effettiva della proteina desiderata nel campione surnatante cellulare.
   5. Tracciare la tabella costruita da campioni in un grafico a linee. Se OD ₄₅₀ valori non rientrano della curva standard, i campioni devono essere diluiti in modo appropriato e ri-testati.
   6. Normalizzare i risultati a 500.000 cellule.

Risultati

Istologia

Immagini luce microscopia rappresentativi di cellule isolate e coltivate primarie sono descritte nella Figura 1A. Immunocytochemical analisi dimostra che epatociti isolati altamente esprimono albumina (rosso) e fattore di crescita dei fibroblasti receptor 4 (FGFR4) (verde). I nuclei sono colorati con 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (blu). (Figura 1B).

Discussione

Isolando epatociti primari da topi è uno strumento veloce, economico e affidabile per studiare le risposte infiammatorie ex vivo. Se eseguita correttamente, i risultati possono essere facilmente generati e riprodotti in modo tempestivo ed economicamente efficiente. I seguenti punti devono essere attentamente valutati per assicurare un isolamento efficace.

L'incisione chirurgica e incannulamento della IVC devono essere eseguite in anestesia generale e non dopo l'eutanasia. U...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables
Cell Strainer 70 μm Nylon cell strainer	Falcon	352350
BD Insyte Autoguard	BD	381412
50 mL Polypropylene Conical Tube	Falcon	352098
100 6-inch Cotton Tipped Applicators	Puritan	806-WC
1cc U-100 Insulin Syringe 28 G 1/2	Becton Dickinson	329420
Tissue Culture Dish 100 x 20 mm Style	Corning	353003
6 well Cell Culture Cluster	Costar	3516
5/0 Black Braided Surgical Silk (100 yards)	LOOK	SP115
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Minipuls 3 Perfusion Pump	Gilson	F155007
Hemacytometer Kits, Propper	VWR	48300-474
Hemacytometer Cover Glasses, Propper	VWR	48300-470
Surgical Scissers - Sharp/Blunt	F.S.T.	14001-12
Iris Scissors-ToughCut Straight	F.S.T.	14058-11
Dumont SS-45 Forceps	F.S.T.	11203-25
Student Tissue Forceps	F.S.T.	991121-12
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Acetic acid solution, 2.0 N	Sigma	A8976-100ML
Isoflurane, USP 250 mL	Piramal Healthcare	66794-013-25
KetaVed 1,000 mg/10 mL (100 mg/mL)	VEDCO	50989-161-06
Xylazine 100 mg/mL	AnaSed Injection	139-236
Willams' Medium E (1x)	gibco	12551-032
Liver Perfusion Medium (1x)	gibco	17701-038
Liver Digest Medium (1x)	Life Technologies	17703034
Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements	Life Technologies	CM3000
Primary Hepatocyte Maintenance Supplements	Life Technologies	CM4000
Phosphate Buffer Saline (PBS) pH 7.4	ThermoFisher scientific	10010031
Collagen Type 1	Corning	354236
Trypan Blue Solution	VWR	45000-717