Aβ的绝对定量<sub&gt; 1-42</sub&gt;在CSF使用质谱参考测量程序

摘要

A reference measurement procedure for the absolute quantification of Aβ_1-42 in human CSF based on solid-phase extraction and liquid chromatography tandem mass spectrometry is described.

摘要

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disease among the elderly and accounts for 60-80% of all cases of dementia. Currently, the diagnosis of AD is based on cognitive tests and mental state exams, but the peptide amyloid-beta (Aβ) in cerebrospinal fluid (CSF) is increasingly used in clinical trials and settings. As for most protein and peptide biomarkers, quantification is performed using antibody-based techniques, such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). However, intra- and inter-laboratory variability in these assays hamper its use as a diagnostic marker in clinical routine.

An antibody-independent Reference Measurement Procedure (RMP) was developed based on solid-phase extraction (SPE) and liquid chromatography (LC)-tandem mass spectrometry (MS/MS), where stable, isotope-labeled Aβ peptides were used as internal standards, enabling absolute quantification. A high-resolution quadrupole-orbitrap hybrid instrument was used for the measurements. The method allows for the quantification of CSF Aβ_1-42 between 150-4,000 pg/mL.

引言

阿尔茨海默氏病（AD）是老年痴呆症的最常见的形式，影响^了全球¹⁰⁰约35万人。疾病广泛认为在躺在床上的AD发病的芯的神经病学特征是tau蛋白的蛋白²的细胞内神经原纤维缠结和细胞外斑块由聚集的淀粉样-β（Aβ）肽^3。本着这一精神，体内斑块病理的生物标志物评估最近已包含在公元⁴研究的诊断标准。对于_Aβ1-42的CSF测量，几个免疫测定可以使用，在许多临床实验室⁵被使用。 _的Aβ1-42的CSF中的浓度是在AD患者比在认知正常老年人下大约50％，这反映了肽在斑中的BR的沉积AIN ^6,7。

这些生物标志物重点分析使用免疫（ 即，基于抗体的技术），但这些试验可以由基体效应⁸的影响。使用不同技术平台的免疫测定和缺乏测定标准化^9，10，使引入全球截止浓度难以^11,12。一种分析验证RMP将允许不同的检测平台统一校准，最好导致跨平台的分析比较好和更好的控制有助于整体测量变异的因素。

使用开发的LC-MS / MS方法_的Aβ1-42的绝对定量克服了与基于抗体的TECHN有关的问题iques。该方法被列为联合委员会溯源实验室医学（JCTLM数据库标识号C11RMP9），一个RMP将被用来确定一个标准物质_{（CRM）Aβ1-42}的绝对浓度协调_CSFAβ1跨越技术和分析平台_-42测量。所描述的工作流程应该是相关的用于医学的其他领域内的肽和蛋白质候选参考方法的发展。

研究方案

注:此协议需要至少50微升的等分试样，对每个Aβ肽50微克/ mL的浓度，作为原料。 Aβ的肽应溶于20％乙腈（ACN）和4％浓氨溶液在去离子水（v / v）中并储存在80℃。

注意:请参阅表1的安全信息。

1.溶液的制备

1. 通过稀释20毫升乙腈和4毫升浓氨水（〜25％）在去离子水中制备100毫升20％的ACN和4％的在去离子水（v / v）的浓氨溶液。调节最终体积至100毫升去离子水。让每天新鲜。
2. 通过26.08克胍 - 盐酸盐溶解在去离子水至50毫升的最终体积制备50毫升，5M胍盐酸盐。在20°C储存，使新鲜的月刊。
3. 制备200毫升的4％磷酸在去离子水（v /ⅴ）通过稀释9.4毫升去离子水中的浓磷酸（〜85％）的。调节最终体积至200毫升去离子水。存放在冰箱，并每周新鲜。
4. 通过稀释37.5毫升乙腈和5mL浓氨水（〜25％）在去离子水中制备50毫升75％的ACN和10％的浓氨水溶液（体积/体积）在去离子水中。调节最终体积至50mL去离子水。让每天新鲜。
5. 解冻至少2.5 mL人CSF为校准器，从常规临床分析去确定剩余样品。
6. 制备含有150mM的Na，3.0毫钾，1.4毫米的Ca，0.8毫镁，1.0mM的磷，和155毫氯在去离子水中人工CSF和添加的牛血清白蛋白4毫克/毫升的最终浓度。只有1毫升每分析需要的，但制备大体积，等分它，并存储以供将来使用。

2.校准器的研制

1. 准备的4微克0.5毫升/ ¹毫升_5NAβ1-42肽通过在0.5毫升微量离心管中加入40微升50微克/毫升_^15NAβ142至0.46毫升20％的ACN和4％浓氨水的。混合在涡旋混合器上于1分钟。
2. 通过在2毫升的离心管中加入50微升4微克/毫升^_15NAβ142至1.95毫升20％的ACN和4％浓氨水的制备2毫升100纳克/毫升^_15NAβ1-42肽。混合在涡旋混合器上于1分钟。
3. 由表2中所示的各溶液的体积混合准备六节校准溶液（AF）。使用0.5，1.5，和2mL微量离心管。混合在涡旋混合器上于1分钟。
4. 通过将相应的校准溶液，并根据表3混合在涡旋混合器上于1分钟人CSF制备于0.5mL微离心管中的最后的校准（一式两份）。

3.内部标准的研制

1. 通过在2毫升的离心管中加入32微升50微克/毫升^_13CAβ142以1.968毫升20％ACN和4％浓氨水的制备2毫升0.8微克/毫升^_13CAβ1-42肽。混合在涡旋混合器上于1分钟。
2. 通过在5毫升的离心管中加入0.1毫升0.8微克/毫升至4.9毫升20％的ACN和4％浓氨水的制备5mL的16毫微克/毫升^_13CAβ1-42肽。混合在涡旋混合器上于1分钟。

4.响应系数样品的制备

注意:响应因子（RF）判定被执行以确定用于校准^{_{（15NAβ1-42）}}标记的肽的浓度。这就要求本机_的Aβ1-42肽的浓度已经使用氨基酸分析（AAA）确定。因此，体积和天然_的Aβ1-42肽的等分试样的浓度需要履行的AAA的要求。

1. 通过以0.5毫升微量离心管中加入40微升50微克/ mL的原生_的Aβ1-42至0.46毫升20％的ACN和4％浓氨水的制备0.5毫升4微克/毫升天然（未标记） ^_的Aβ1-42的。混合在涡旋混合器上于1分钟。
2. 通过加入4微克20微升/毫升天然_的Aβ1-42和20微升为4μg/ mL的^_15NAβ1-42制备天然的和^_15NAβ1-42的2毫升40纳克/毫升组合，以1.96毫升的20％ ACN和4％在一个2毫升的离心管中浓氨。混合在涡旋混合器上于1分钟。
3. 添加40毫微克/毫升混合20微升至0.38毫升的人工脑脊液在0.5毫升离心管中。准备重复并在涡旋混合器上混合1分钟。

5.样品制备

注:融化样品在上辊室温进行测定。

1. 添加每个校准器，响应因子，和未知样品（包括质量控制[QC]样品，如果使用的话），以1毫升的蛋白质的96深孔板的0.18毫升，根据图1（假设全板使用）。确保添加样品中，或接近，在孔的底部。
2. 加入内标20微升到每口井（ 即校准器，响应因子，QCS系统和未知）;关键的是要释放井靠近样品的表面侧的压降而不浸没枪头。
3. 0.2毫升，5M胍盐酸添加到每个孔中。
4. 放置在微板振荡器上样品板并以1100rpm进行45分钟混合样品。最佳频率可能会因仪器不同。设定混频器的频率和振幅，以使溶液充分混合，没有内部标准或脑脊液滴留未混合在孔的一侧。
5. 加0.2毫升的4％磷酸到每个孔中。轻轻振荡混匀。

6.固相萃取

注:在所有的洗涤，装载和洗脱步骤，应用可能的最低的真空加入溶液后，并根据需要装载或洗脱溶液逐渐增加。禁用每个加载和洗脱步骤之间的真空。

1. 置于废物贮存池托盘混合模式下，在萃取板歧管室的阳离子交换，96孔固相萃取（SPE）板。
2. 通过加入0.2毫升甲醇中以每孔调节在SPE吸附剂。
3. 通过加入0.2毫升的4％磷酸至每个孔平衡吸附剂。
4. 从深孔板转移所有样品（每孔约0.62 mL）添加到SPE板。样品从深孔板SPE板传送时使用8通道移液器;它不是传输所有样品的整个或相等体积至关重要的，因为样品中含有的实习生人的标准，将为变化进行补偿。
5. 洗吸附剂样品已通过加入0.2毫升的4％磷酸向每个孔穿过后。
6. 洗涤溶剂从吸附剂洗脱后，更换一个收集盘或管水库托盘。
7. 通过两次加入75％ACN / 10％浓氨水加入50μL洗脱从吸附剂样品，并注意此解决方案要求一个非常低的真空穿过吸附剂。记住要禁用每个另外的真空。
   1. 可选:密封收集板或管，并在-80℃冷冻。继续步骤6.8.2之前从收集板或管密封。
   2. 干燥使用真空离心（不施加热量）洗脱液;这可以从一个到几个小时，取决于真空离心机。
   3. 密封该容器，并在-80℃冷冻。

7.液体色谱造影

1. 制备流动相A（5％ACN和0.3％浓氨水在去离子水[体积/体积]），B（4％去离子水和0.1％浓氨水在ACN [体积/体积]），并且针洗涤（50％ACN和4％浓氨水在去离子水[体积/体积]）。
   1. 为500毫升流动相A，加入25毫升乙腈和1.5毫升浓氨水，以去离子水。调节最终体积至500毫升去离子水。
   2. 为500毫升流动相B，加500微升浓氨水和25毫升去离子水于乙腈。调节最终体积至500mL乙腈。
   3. 通过加入120mL的乙腈和10mL浓氨水去离子水的制备250毫升洗针的。调节最终体积至250毫升去离子水。
   4. 把流动相A，打开B和针头清洗瓶子在超声浴20分钟，LC系统使用前
2. 溶解有20 25微升％ACN和4％concentra各样品泰德氨水溶液，将其放在20分钟的振动筛。离心下来的样品，并放置在自动进样器（保持在7℃）。
3. 注入上保持在50℃的1×250毫米²的聚苯乙烯-二乙烯基苯（反相）整体柱的样品20微升。
   1. 使用在表4中为0.3毫升/分钟的流速所示的LC梯度。转移的前两个和最后五分钟使用一个转向阀，以减少质谱仪的污染浪费（柱后）。

8.质谱分析

注意:这些参数被用于配备aheated电喷雾源的四极的Orbitrap杂交质谱仪。

1. 根据表5中设置用于离子源的参数。
2. 设置MS仪器来隔离本地_Aβ1-42的4 +充电状态（按质量1,129.48电荷比[M / ^{_{Z]），15NAβ1-42（1,143.00}} M / Z），和^{_{13CAβ1-42（1,179.50}} M / Z）中的四极质量分析器，用2.5 M / Z的隔离宽度。
3. 分段在碰撞单元中的分离的肽与17.0归一化碰撞能量（NCE）。这可能需要被调谐每个仪器，即使是同一类型的（尤其是如果使用其它类型的仪器，诸如三重四极杆质谱）。
4. 记录片段光谱和17.500的分辨率，为2×10 ^5个电荷的自动增益控制目标和250毫秒的最大喷射时间。

9.数据处理

1. 在表6中使用的产品的离子的总和（具有±250毫质量单位[MMU]的质量公差）来计算的色谱区域为每个肽。需要注意的是离子种类和数量只显示了本机Aβ _{1-42产物离子，因为它们是为^15NAβ1-42和^13CAβ1-42相同。}
2. 由^_15NAβ1-42的曲线（色谱峰）与天然_Aβ1-42的曲线下的面积下，将该区域确定两个响应因子样本的平均响应因子。
3. 调整通过在步骤9.2计算出的响应因子乘以它用于校准的^_15NAβ1-42的浓度。
4. 通过从两组对浓度校准的标绘的¹⁵面积比_{^{NAβ1-42〜13CAβ1-42}}构建校准曲线。
5. 计算使用线性回归校正曲线的斜率和截距。
6. 计算机_的Aβ1-42的面积比的内标^{_{（13CAβ1-42）}}为未已知样品。
7. 推断使用在步骤9.5中得到的斜率和截距由校准曲线未知样品的浓度。

结果

图1中的板设置用于样品的完整板。如果较少的未知样本进行分析，所述第二校准器，RF和QC套应置于未知样品的前半部分后。

如在图2中看到的那样，校准接近回归线，具有低标准偏差。这种方法具有150皮克/毫升和4000皮克/毫升的量化的上层的定量的较低水平。当然校准的剩余标准偏差应尽可能低。如...

讨论

对于所描述的方法，而不是使用一个代理矩阵，我们使用了替代的分析物的方法^{13，14，15，16，}它使校正在人CSF。代孕的方式分析涉及到两个不同的同位素标记的标准。酮_{^{（15NAβ142）}}被用来产生于人类CSF中的校准曲线，而另一个_{^{（13CAβ142）}}用作内标。然后未知的内源性...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 0.5 mL	Eppendorf	022431081
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 1.5 mL	Eppendorf	022431081
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL	Eppendorf	022431102
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 5 mL	Eppendorf	0030 108.310
Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plates 96	Eppendorf	951032905
Micronic 0.75 mL polypropylene tubes, V-bottom	Micronic	MPW32071BC3	Tubes used for collecting SPE eluate, but other collection devices can be used such as 96-well plates.
Micronic Split TPE Capcluster for 96 ind. tubes	Micronic	MP53026	Caps for Micronic tubes.
Micronic Loborack-96 white w high cover bar coded	Micronic	MPW51015BC3	Holder for Micronic tubes.
Biohit Optifit tips 1.2 mL	Sartorius	791210	Used to reach all the way to the bottom of the LoBind deepwell plates (96-well). Other narrow tips might work as well.
Waters Oasis MCX 96-well µElution Plate	Waters	186001830BA
Waters Plate manifold reservoir tray	Waters	WAT058942
Waters Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates	Waters	186001831
Ammonium hydroxide solution, puriss. p.a., reag. ISO, reag. Ph. Eur., ~25% NH3 basis	Sigma-Aldrich	30501-1L-D
Acetonitrile, Far UV HPLC Gradient grade, 2.5 L	Fisher Scientific	A/0627/17X
ortho-Phosphoric acid 85%, ACS,ISO,Reag. Ph Eur	Merck Millipore	1005731000
Guanidine Hydrochloride, 500 g	Thermo Scientific	24110
Thermo Scientific Q-exactive Hybrid Quadrupole Orbitrap Mass Spectrometer	Thermo Scientific	IQLAAEGAAPFALGMAZR	With bundled Dionex Ultimate 3000 LC & autosampler.
Dionex ProSwift RP-4H Monolith Column (1.0 x 250mm)	Dionex	066640
Bovine Serum Albumin, lyophilized powder, suitable for (for molecular biology), Non-acetylated	Sigma-Aldrich	B6917
Beta-Amyloid (1-42), Ultra Pure, TFA	rPeptide	A-1002-2
15N Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled	rPeptide	A-1102-2
13C Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled	rPeptide	A-1106-2
Microplate shakers, TiMix 2	Edmund Bühler	6110 000