La quantification absolue de Aß<sub&gt; 1-42</sub&gt; Dans le LCR aide d&#39;une référence Procédure de mesure de spectrométrie de masse

Résumé

A reference measurement procedure for the absolute quantification of Aβ_1-42 in human CSF based on solid-phase extraction and liquid chromatography tandem mass spectrometry is described.

Résumé

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disease among the elderly and accounts for 60-80% of all cases of dementia. Currently, the diagnosis of AD is based on cognitive tests and mental state exams, but the peptide amyloid-beta (Aβ) in cerebrospinal fluid (CSF) is increasingly used in clinical trials and settings. As for most protein and peptide biomarkers, quantification is performed using antibody-based techniques, such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). However, intra- and inter-laboratory variability in these assays hamper its use as a diagnostic marker in clinical routine.

An antibody-independent Reference Measurement Procedure (RMP) was developed based on solid-phase extraction (SPE) and liquid chromatography (LC)-tandem mass spectrometry (MS/MS), where stable, isotope-labeled Aβ peptides were used as internal standards, enabling absolute quantification. A high-resolution quadrupole-orbitrap hybrid instrument was used for the measurements. The method allows for the quantification of CSF Aβ_1-42 between 150-4,000 pg/mL.

Introduction

La maladie d'Alzheimer (MA) est la forme la plus courante de démence et affecte environ 35 millions de personnes à travers le monde ^1. Les caractéristiques neuropathologiques de la maladie largement soupçonné d'être au cœur de la pathogenèse de la MA sont des enchevêtrements neurofibrillaires intracellulaires de protéine tau hyperphosphorylée ² et plaques extracellulaires composées de agrégées bêta-amyloïde (Aß) peptides ^3. Conformément à cela, l'évaluation de la plaque pathologie in vivo par des biomarqueurs a récemment été inclus dans les critères diagnostiques de recherche pour AD ^4. Pour les mesures de LCR de Aß _1-42, plusieurs analyses immunologiques sont disponibles et sont utilisés dans de nombreux laboratoires cliniques ^5. La concentration de Aß _1-42 dans le LCR est d' environ 50% plus faible chez les patients AD que chez les sujets âgés normaux sur le plan cognitif, ce qui reflète le dépôt du peptide dans les plaques dans le brain ^{6, 7.}

Ces biomarqueurs sont principalement analysés en utilisant des immunoessais (ie, les techniques à base d' anticorps), mais ces essais peuvent être influencés par les effets de matrice ^8. L'utilisation d'immunoessais sur différentes plates - formes technologiques et le manque de dosage normalisation ^{9, 10} permet l'introduction de concentrations de coupure mondiales difficiles ^{11, 12.} Un RMP analytiquement validé permettrait l'étalonnage uniforme des différentes plates-formes de dosage, idéalement résultant en une meilleure comparabilité entre les plates-formes d'analyse et un meilleur contrôle des facteurs qui contribuent à la variabilité globale de mesure.

La quantification absolue de Aß _1-42 en utilisant la méthode LC-MS / MS développé surmonte un grand nombre des problèmes associés à la techn à base d' anticorpsiques. La méthode, répertorié comme un PGR par le Comité commun pour la traçabilité en médecine de laboratoire (JCTLM base de données le numéro d' identification de C11RMP9), sera utilisé pour déterminer la concentration absolue de Aß _1-42 dans un matériau de référence certifié (CRM) pour harmoniser CSF Aß ₁ mesures _-42 à travers des techniques et des plates - formes analytiques. Le workflow décrit devrait être de l'intérêt pour le développement de méthodes de référence des candidats pour des peptides et des protéines dans d'autres domaines de la médecine.

Protocole

NOTE: Ce protocole exige des aliquotes d'au moins 50 ul, avec une concentration de 50 pg / ml pour chaque peptide Aß, en tant que matériau de départ. Les peptides Aß doivent être dissous dans 20% d'acétonitrile (ACN) et une solution à 4% d'ammoniac concentrée dans de l'eau déminéralisée (v / v) et stockées à 80 ° C.

Attention: Voir le tableau 1 pour les informations de sécurité.

1. Préparation des solutions

1. Préparer 100 ml de 20% d'ACN et de 4% d'une solution concentrée d'ammoniaque dans de l'eau déminéralisée (v / v) en diluant 20 ml d'ACN et 4 ml d'ammoniaque concentré (~ 25%) dans de l'eau déminéralisée. Ajuster le volume final à 100 mL avec de l'eau déminéralisée. Faire frais tous les jours.
2. Préparer 50 ml de 5 M de guanidine-chlorhydrate par dissolution de 26,08 g de chlorhydrate de guanidine dans de l'eau déminéralisée jusqu'à un volume final de 50 ml. Conserver à 20 ° C et de faire mensuelle frais.
3. Préparer 200 ml de 4% d'acide phosphorique dans de l'eau déminéralisée (v /v) en diluant 9,4 ml d'acide phosphorique concentré (~ 85%) dans de l'eau déminéralisée. Ajuster le volume final à 200 mL avec de l'eau déminéralisée. Conserver au réfrigérateur et de faire chaque semaine.
4. Préparer 50 ml de 75% d'ACN et 10% de solution d'ammoniaque concentrée (v / v) dans de l'eau déminéralisée en diluant 37,5 ml d'ACN et 5 ml d'ammoniaque concentré (~ 25%) dans de l'eau déminéralisée. Ajuster le volume final à 50 ml avec de l'eau déminéralisée. Faire frais tous les jours.
5. Décongeler au moins 2,5 mL de CSF humain pour les étalons, obtenus à partir de dépersonnalisées échantillons restants de l'analyse clinique de routine.
6. Préparer CSF artificiel contenant 150 mM de Na, K 3,0 mM, 1,4 mM de Ca, Mg 0,8 mM, 1,0 mM de P et 155 mM de Cl dans de l'eau déminéralisée et on ajoute de l'albumine de sérum bovin à une concentration finale de 4 mg / ml. Seulement 1 mL est nécessaire par analyse, mais préparer un grand volume, aliquote, et magasin pour une utilisation future.

2. Préparation des calibrateurs

1. Préparer 0,5 ml de 4 pg / mL ¹5 NAβ peptide _1-42 par addition de 40 ul de 50 ug / ml ¹⁵ NAβ _{142 à 0,46} ml de 20% d' ACN et de 4% d' ammoniac concentrée dans un tube de microcentrifugation de 0,5 ml. Mélanger dans un mélangeur à vortex pendant 1 min.
2. Préparer 2 mL de 100 ng / ml ¹⁵ NAβ peptide _1-42 par addition de 50 ul de la 4 pg / ml ¹⁵ NAβ _{142 à 1,95} ml de 20% d' ACN et de 4% d' ammoniac concentré dans un microtube de 2 ml. Mélanger dans un mélangeur à vortex pendant 1 min.
3. Préparer six solutions d'étalonnage (AF) en mélangeant des volumes de chacune des solutions indiquées dans le tableau 2. Utiliser 0,5, 1,5 et 2 ml microtubes. Mélanger dans un mélangeur à vortex pendant 1 min.
4. Préparer les calibrateurs finales (en double), en ml tubes 0,5 à centrifuger en ajoutant les solutions d'étalonnage correspondantes et CSF humain selon le Tableau 3. Mélanger dans un mélangeur à vortex pendant 1 min.

3. Préparation de l'étalon interne

1. Préparer 0,8 ml de 2 pg / ml de peptide ¹³ CAβ _1-42 par addition de 32 pi de 50 pg / ml ¹³ CAβ _{142 à 1,968} ml de 20% d' ACN et de 4% d' ammoniac concentré dans un microtube de 2 ml. Mélanger dans un mélangeur à vortex pendant 1 min.
2. Préparer 5 ml de 16 ng / mL ¹³ CAβ _1-42 peptide en ajoutant 0,1 mL de 0,8 pg / ml à 4,9 ml de 20% d' ACN et 4% d' ammoniac concentré dans un tube 5 ml de microcentrifugation. Mélanger dans un mélangeur à vortex pendant 1 min.

4. Préparation de l'échantillon facteur de réponse

NOTE: Le facteur de réponse (RF) , la détermination est effectuée pour déterminer la concentration du peptide marqué utilisé pour le calibrage ⁽¹⁵ NAβ _1-42). Cela exige que la concentration du peptide natif Aß _1-42 a été déterminée par analyse des acides aminés (AAA). Ainsi, le volume et la concentration des fractions aliquotes de peptide Aß _1-42 nativesdoivent satisfaire aux exigences de l'AAA.

1. Préparer 0,5 ml de 4 ug / ml natif (sans étiquette) ^Aß _1-42 par addition de 40 pi de 50 pg / ml natif Aß _1-42 à 0,46 ml de 20% d' ACN et de 4% d' ammoniac concentrée dans un tube de microcentrifugation de 0,5 ml. Mélanger dans un mélangeur à vortex pendant 1 min.
2. Préparer un 2-ml 40 ng / ml de mélange natif et ¹⁵ NAβ _1-42 en ajoutant 20 pi de 4 pg / mL natif Aß _1-42 et 20 pi de 4 pg / mL ¹⁵ NAβ _1-42 à 1,96 mL de 20% ACN et 4% concentrés ammoniac dans un tube 2 ml de microcentrifugation. Mélanger dans un mélangeur à vortex pendant 1 min.
3. Ajouter 20 ul de 40 ng / mL mélange à 0,38 ml de CSF artificiel dans un ml tube de 0,5 à centrifuger. Préparer les doublons et mélanger dans un mélangeur à vortex pendant 1 min.

Préparation 5. Sample

NOTE: Décongeler les échantillons à mesurer à la température ambiante sur un rouleau.

1. Ajouter 0,18 ml de chaque calibrateur, facteur de réponse et échantillon inconnu (y compris le contrôle de la qualité [QC] échantillons, le cas échéant) à un 1 ml de protéine plaque de 96 puits profonds, selon la figure 1 ( en supposant une assiette pleine est utilisée). Assurez-vous d'ajouter les échantillons, ou à proximité, le fond des puits.
2. Ajouter 20 pi de standard interne à chaque puits (c. -à- calibrateurs, les facteurs de réponse, Qcs et inconnues); il est essentiel de libérer la goutte sur le côté du puits à proximité de la surface de l'échantillon, sans l'immerger la pointe de la pipette.
3. Ajouter 0,2 ml de 5 M de guanidine-chlorhydrate à chaque puits.
4. Placer la plaque d'échantillon sur un agitateur de microplaque et mélanger les échantillons pendant 45 min à 1100 rpm. La fréquence optimale peut varier en fonction de l'instrumentation. Régler la fréquence et l'amplitude du mélangeur, de sorte que les solutions sont soigneusement mélangés, et des gouttes de l'étalon interne ou le LCR sont laissées sans mélange sur le côté du puits.
5. Ajouter 0,2 ml de 4% d'acide phosphoriquechaque puits. Vortex mélanger brièvement.

6. extraction en phase solide

NOTE: Dans tous les laver, le chargement, et les étapes d'élution, appliquer le vide le plus bas possible après l'ajout de la solution et d'augmenter graduellement au besoin pour charger ou éluer la solution. Désactivez le vide entre chaque chargement et l'étape d'élution.

1. Mettez un plateau de réservoir pour les déchets sous un mode mixte, d'échange de cations, 96 puits d'extraction en phase solide (SPE) plaque dans la chambre de collecteur de plaque d'extraction.
2. Conditionner le sorbant SPE en ajoutant 0,2 ml de methanol à chaque puits.
3. Équilibrer le sorbant en y ajoutant 0,2 ml de 4% d'acide phosphorique à chaque puits.
4. Transférer tous les échantillons (environ 0,62 ml dans chaque puits) de la plaque de puits profonds à la plaque de SPE. Utiliser une pipette à huit canaux lors du transfert des échantillons de la plaque de puits profonds à la plaque de SPE; il est essentiel de transférer les volumes entiers ou égaux de tous les échantillons, car les échantillons contiennent un stagiairenorme al qui compenser les variations.
5. Laver le sorbant après que les échantillons ont traversé en y ajoutant 0,2 ml de 4% d'acide phosphorique à chaque puits.
6. Après que le solvant de lavage est élue du sorbant, remplacer le plateau de réservoir d'une plaque ou les tubes collection.
7. Éluer l'échantillon à partir du sorbant par deux fois en ajoutant 50 ul de 75% d'ACN / 10% d'ammoniaque concentrée et notez que cette solution nécessite une dépression très faible pour passer à travers le sorbant. Rappelez-vous de désactiver le vide entre chaque addition.
   1. OPTION: Sceller la plaque ou les tubes de collecte et de les congeler à -80 ° C. Retirez le joint de la plaque ou les tubes collection avant de passer à l'étape 6.8.2.
   2. Sécher les éluats en utilisant la centrifugation à vide (sans appliquer de la chaleur); cela peut prendre une à plusieurs heures, en fonction de la centrifugeuse sous vide.
   3. Sceller les récipients et les congeler à -80 ° C.

7. Liquid Chromatophie

1. Préparer la phase mobile A (5% ACN et 0,3% d' ammoniac concentré dans de l' eau déminéralisée [v / v]), B (4% d' eau déminéralisée et 0,1% d' ammoniac concentré dans ACN [v / v]), et lavage de l' aiguille (50% ACN et 4% ammoniac concentré dans de l' eau déminéralisée [v / v]).
   1. Pour 500 ml de phase mobile A, ajouter 25 ml d'ACN et 1,5 ml d'ammoniaque concentrée à l'eau déminéralisée. Ajuster le volume final à 500 mL avec de l'eau déminéralisée.
   2. Pour 500 ml de phase mobile B, ajouter 500 ul d'ammoniaque concentrée et 25 ml d'eau déminéralisée à ACN. Ajuster le volume final à 500 ml avec ACN.
   3. Préparer 250 ml de lavage de l'aiguille en y ajoutant 120 ml d'ACN et 10 ml d'ammoniaque concentré à de l'eau déminéralisée. Ajuster le volume final à 250 mL avec de l'eau déminéralisée.
   4. Mettez la phase mobile A et B et de lavage de l'aiguille des bouteilles ouvertes dans un bain de sonication pendant 20 minutes avant de l'utiliser avec le système de LC
2. Dissoudre chaque échantillon avec 25 ul de 20% d'ACN et 4% concentrasolution d'ammoniaque ted et les placer sur un agitateur pendant 20 min. Centrifuger bas les échantillons et les placer dans l'échantillonneur automatique (garder à 7 ° C).
3. Injecter 20 ul d'échantillon à raison de 1 x 250 mm ² polystyrènedivinylbenzène (phase inverse) de la colonne monolithique maintenue à 50 ° C.
   1. Utiliser le gradient LC indiqué dans le Tableau 4 avec un débit de 0,3 mL / min. Détourner les deux premiers et les cinq dernières minutes à perdre (post-colonne) en utilisant une vanne de dérivation pour réduire la contamination du spectromètre de masse.

Analyse 8. spectrométrie de masse

REMARQUE: Ces paramètres ont été utilisés pour un spectromètre de masse hybride quadripolaire-Orbitrap équipé avec une source d'ionisation électrospray aheated.

1. Définir les paramètres de la source d'ions conformément au tableau 5.
2. Réglez l'instrument MS pour isoler les 4+ états de charge de Aß natif _1-42 (1,129.48 masse-rapport [m / z] à charge), ¹⁵ NAβ _1-42 (1,143.00 m / z), et ¹³ CAβ _1-42 (1,179.50 m / z) dans la masse quadripolaire analyseur avec une largeur d'isolement de 2,5 m / z.
3. Fragment les peptides isolés dans la cellule de collision avec une énergie de collision normalisée (NCE) de 17,0. Cela pourrait avoir besoin d'être réglé pour chaque instrument, même du même type (et en particulier en cas d'utilisation d'autres types d'instruments, comme un triple quadripôle MS).
4. Enregistrer les spectres de fragments avec une résolution de 17.500, avec une cible de commande automatique de gain de 2 x 10 ⁵ charges et une durée d'injection maximale de 250 ms.

9. Traitement des données

1. Utilisez la somme des ions produits (avec une tolérance de masse de ± 250 unités de masse milli [mmu]) dans le tableau 6 pour calculer les zones chromatographiques pour chaque peptide. Notez que les types et le nombre d'ions ne sont indiqués que pour Aß natif _{ions 1-42 de produits, car ils sont les mêmes pour les ¹⁵ NAβ 1-42 et ¹³ CAβ 1-42.}
2. Déterminer le facteur de réponse moyen des deux échantillons de facteur de réponse en divisant la surface sous la courbe (pic chromatographique) de ¹⁵ NAβ _1-42 avec la zone sous la courbe de natif Aß _1-42.
3. Ajuster la concentration du ¹⁵ NAβ _1-42 utilisée pour l' étalonnage en le multipliant par le facteur de réponse calculé à l' étape 9.2.
4. Construire une courbe d'étalonnage en traçant les rapports de surface de ¹⁵ NAβ _1-42 à ¹³ CAβ _1-42 des deux ensembles de calibrateurs contre la concentration.
5. Calculer la pente et l'ordonnée à l'origine de la courbe d'étalonnage en utilisant une régression linéaire.
6. Calculer le rapport de surface de Aß natif _1-42 à l'étalon interne ⁽¹³ CAβ _1-42) pour nondes échantillons connus.
7. Extrapoler la concentration des échantillons inconnus à partir de la courbe d'étalonnage en utilisant la pente et l'ordonnée à l'origine obtenue à l'étape 9.5.

Résultats

La configuration de la plaque à la figure 1 est utilisé pour une assiette pleine d'échantillons. Si moins d'échantillons inconnus sont à analyser, la deuxième calibrateur, RF, et QC ensembles doit être placé après la première moitié des échantillons inconnus.

Comme on le voit sur la figure 2, les calibrateurs sont proches de la ligne de régression, avec de faibles écarts ...

Discussion

Pour le procédé décrit, au lieu d'utiliser une matrice de substitution, on a utilisé la méthode de remplacement de l' analyte ^{13, 14, 15, 16,} ce qui permet un calibrage dans le LCR humain. L'approche de l'analyte de substitution implique deux normes marqués par des isotopes différents. L' une ⁽¹⁵ NAβ ₁₄₂₎ est utilisé pour générer la courbe d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 0.5 mL	Eppendorf	022431081
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 1.5 mL	Eppendorf	022431081
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL	Eppendorf	022431102
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 5 mL	Eppendorf	0030 108.310
Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plates 96	Eppendorf	951032905
Micronic 0.75 mL polypropylene tubes, V-bottom	Micronic	MPW32071BC3	Tubes used for collecting SPE eluate, but other collection devices can be used such as 96-well plates.
Micronic Split TPE Capcluster for 96 ind. tubes	Micronic	MP53026	Caps for Micronic tubes.
Micronic Loborack-96 white w high cover bar coded	Micronic	MPW51015BC3	Holder for Micronic tubes.
Biohit Optifit tips 1.2 mL	Sartorius	791210	Used to reach all the way to the bottom of the LoBind deepwell plates (96-well). Other narrow tips might work as well.
Waters Oasis MCX 96-well µElution Plate	Waters	186001830BA
Waters Plate manifold reservoir tray	Waters	WAT058942
Waters Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates	Waters	186001831
Ammonium hydroxide solution, puriss. p.a., reag. ISO, reag. Ph. Eur., ~25% NH3 basis	Sigma-Aldrich	30501-1L-D
Acetonitrile, Far UV HPLC Gradient grade, 2.5 L	Fisher Scientific	A/0627/17X
ortho-Phosphoric acid 85%, ACS,ISO,Reag. Ph Eur	Merck Millipore	1005731000
Guanidine Hydrochloride, 500 g	Thermo Scientific	24110
Thermo Scientific Q-exactive Hybrid Quadrupole Orbitrap Mass Spectrometer	Thermo Scientific	IQLAAEGAAPFALGMAZR	With bundled Dionex Ultimate 3000 LC & autosampler.
Dionex ProSwift RP-4H Monolith Column (1.0 x 250mm)	Dionex	066640
Bovine Serum Albumin, lyophilized powder, suitable for (for molecular biology), Non-acetylated	Sigma-Aldrich	B6917
Beta-Amyloid (1-42), Ultra Pure, TFA	rPeptide	A-1002-2
15N Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled	rPeptide	A-1102-2
13C Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled	rPeptide	A-1106-2
Microplate shakers, TiMix 2	Edmund Bühler	6110 000