A quantificação absoluta de Ap<sub&gt; 1-42</sub&gt; No CSF ​​Usando um Procedimento Referência medição de massa espectrométrica

Resumo

A reference measurement procedure for the absolute quantification of Aβ_1-42 in human CSF based on solid-phase extraction and liquid chromatography tandem mass spectrometry is described.

Resumo

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disease among the elderly and accounts for 60-80% of all cases of dementia. Currently, the diagnosis of AD is based on cognitive tests and mental state exams, but the peptide amyloid-beta (Aβ) in cerebrospinal fluid (CSF) is increasingly used in clinical trials and settings. As for most protein and peptide biomarkers, quantification is performed using antibody-based techniques, such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). However, intra- and inter-laboratory variability in these assays hamper its use as a diagnostic marker in clinical routine.

An antibody-independent Reference Measurement Procedure (RMP) was developed based on solid-phase extraction (SPE) and liquid chromatography (LC)-tandem mass spectrometry (MS/MS), where stable, isotope-labeled Aβ peptides were used as internal standards, enabling absolute quantification. A high-resolution quadrupole-orbitrap hybrid instrument was used for the measurements. The method allows for the quantification of CSF Aβ_1-42 between 150-4,000 pg/mL.

Introdução

A doença de Alzheimer (DA) é a forma mais comum de demência e afeta cerca de 35 milhões de pessoas em todo o mundo ^1. As características neuropatológicas da doença que se acredita estar no cerne da AD patogênese são emaranhados neurofibrilares intracelulares de proteína tau hiperfosforilada ² e placas extracelulares que consiste em (Ap) peptídeos ³ agregada beta-amilóide. Em consonância com isso, a avaliação da patologia de placa in vivo por biomarcadores foi recentemente incluída nos critérios diagnósticos para pesquisa em ⁴ dC. Para medições de CSF de Ap _1-42, vários imunoensaios estão disponíveis e são utilizados em muitos laboratórios clínicos ^5. A concentração de Ap em CSF _1-42 é, aproximadamente, 50% mais baixa em pacientes com AD do que em pessoas idosas cognitivamente normais, reflectindo a deposição do péptido em placas na BRain ^{6, 7.}

Esses biomarcadores são principalmente analisadas através de imunoensaios (isto é, técnicas à base de anticorpos), mas estes ensaios podem ser influenciadas por efeitos de matriz ^8. O uso de imunoensaios em diferentes plataformas tecnológicas e a falta de ensaio padronização ^{9, 10} torna a introdução de concentrações de corte globais difíceis ^{11, 12.} Um PGR analiticamente validado permitiria a calibração uniforme das diferentes plataformas de ensaio, de preferência, resultando em melhor comparabilidade entre plataformas analíticas e no melhor controle dos fatores que contribuem para a variabilidade global medição.

A quantificação absoluta de Ap _1-42 utilizando o método de LC-MS / MS desenvolvido supera muitos dos problemas associados com Techn à base de anticorpoiques. O método, listado como um PGR pelo Comité Misto de Rastreabilidade na Medicina Laboratorial (JCTLM banco de dados identificação do número C11RMP9), será utilizado para determinar a concentração absoluta de Ap _1-42 em um material de referência certificado (CRM) para harmonizar CSF Ap _{1 -42} medições através de técnicas analíticas e plataformas. O fluxo de trabalho descrito deverá ser de relevância para o desenvolvimento de métodos de referência candidato para peptídeos e proteínas dentro de outras áreas da medicina.

Protocolo

NOTA: Este protocolo requer alíquotas de, pelo menos, 50 ul, com uma concentração de 50 ug / mL para cada péptido Ap, como material de partida. Os peptídeos Ap deve ser dissolvido em 20% de acetonitrilo (ACN) e solução concentrada de amoníaco a 4% em água desionizada (v / v) e armazenadas a 80 ° C.

Cuidado: Ver Tabela 1 para informações de segurança.

1. Preparação das soluções

1. Preparação de 100 mL de 20% de ACN e 4% de solução concentrada de amoníaco em água desionizada (v / v) diluindo 20 mL de ACN e 4 mL de hidróxido de amónio concentrado (~ 25%) em água desionizada. Ajustar o volume final para 100 mL com água desionizada. Faça diariamente.
2. Preparar 50 ml de 5 M de guanidina-hidrocloreto por dissolução de 26,08 g de cloridrato de guanidina-em água de s ionizada para um volume final de 50 mL. Loja a 20 ° C e fazer mensalmente fresco.
3. Preparar 200 ml de ácido fosfórico a 4% em água desionizada (v /v) por diluição de 9,4 ml de ácido fosfórico concentrado (~ 85%) em água desionizada. Ajustar o volume final para 200 mL com água desionizada. Guarde na geladeira e fazer semanal fresco.
4. Preparar 50 ml de 75% de ACN e 10% de solução de amoníaco concentrada (v / v) em água desionizada por diluição de 37,5 mL de ACN e 5 mL de hidróxido de amónio concentrado (~ 25%) em água desionizada. Ajustar o volume final para 50 mL com água desionizada. Faça diariamente.
5. Descongelar, pelo menos, 2,5 mL de CSF humano para os calibradores, obtidos a partir de amostras de sobras identificou-de de análises clínicas de rotina.
6. Prepare CSF artificial contendo Na 150 mM, 3,0 mM de K, Ca 1,4 mM, Mg 0,8 mM, 1,0 P, e Cl 155 mM em água desionizada e adicionar albumina de soro de bovino a uma concentração final de 4 mg / mL. Apenas 1 mL é necessária por análise, mas preparar um grande volume, alíquota e guarde para uso futuro.

2. Preparação dos calibradores

1. Preparar 0,5 ml de 4 ug / ml ¹5 NAβ _1-42 por adição de 40 uL de 50 ug / ml ¹⁵ NAβ _142-0,46 mL de 20% de ACN e 4% de amónia concentrada num tubo de microcentrífuga de 0,5 ml. Misturar num misturador vortex durante 1 min.
2. Preparar 2 mL de 100 ng / mL ¹⁵ NAβ _1-42 por adição de 50 uL da 4 ug / ml ¹⁵ NAβ _142-1,95 mL de 20% de ACN e 4% de amónia concentrada num tubo de microcentrifugação de 2 ml. Misturar num misturador vortex durante 1 min.
3. Prepare seis soluções de calibrador (FA) por mistura dos volumes de cada solução indicada na Tabela 2. Utilizar 0,5, 1,5, e 2 mL tubos de microcentrífuga. Misturar num misturador vortex durante 1 min.
4. Prepare os calibradores finais (em duplicado) em tubos de microcentrífuga de 0,5 ml por adição de soluções de calibração correspondentes e CSF humano de acordo com a Tabela 3. Misturar num misturador vortex durante 1 min.

3. Preparação do padrão interno

1. Preparar 2 mL de 0,8 ug / ml ¹³ CAβ _1-42 através da adição de 32 uL de 50 ug / ml ¹³ CAβ _142-1,968 mL de 20% de ACN e 4% de amónia concentrada num tubo de microcentrifugação de 2 ml. Misturar num misturador vortex durante 1 min.
2. Prepare 5 mL de 16 ng / ml ¹³ CAβ _1-42 por adição de 0,1 mL de 0,8 ug / mL a 4,9 mL de 20% de ACN e 4% de amónia concentrada num tubo de microcentrífuga de 5 mL. Misturar num misturador vortex durante 1 min.

4. Preparação da Amostra Factor de Resposta

NOTA: O factor de resposta (RF) determinação é efectuada para determinar a concentração do péptido marcado utilizado para a calibração ⁽¹⁵ NAβ _1-42). Isto requer que a concentração do péptido nativo Ap _1-42 foi determinado utilizando análise de aminoácidos (AAA). Assim, o volume e concentração de alíquotas de péptidos nativos Ap _1-42precisa para cumprir os requisitos da AAA.

1. Prepare 0,5 mL de 4 ug / mL nativa (não marcado) ^Ap _1-42 por adição de 40 uL de 50 ug / mL de Ap nativo _1-42 para 0,46 mL de 20% de ACN e 4% de amónia concentrada num tubo de microcentrífuga de 0,5 ml. Misturar num misturador vortex durante 1 min.
2. Prepara-se uma 2-ml 40 ng mistura / mL de nativo e ¹⁵ NAβ _1-42 por adição de 20 uL de 4 ug / mL de Ap nativo _1-42 e 20 uL de 4 ug / ml ¹⁵ NAβ _1-42 a 1,96 mL de 20% ACN e 4% de amónia concentrada num tubo de microcentrifuga de 2 mL. Misturar num misturador vortex durante 1 min.
3. Adicionar 20 ul da mistura de 40 ng / mL a 0,38 mL de CSF artificial num tubo de microcentrífuga de 0,5 ml. Prepare duplicados e misturar num misturador vortex durante 1 min.

Preparação 5. Amostra

NOTA: Descongelar as amostras a serem medidas à temperatura ambiente num rolo.

1. Adicionar 0,18 ml de cada calibrador, factor de resposta, e amostra desconhecida (incluindo o controlo de qualidade [QC] amostras, se usado) para uma placa de 96 de poços profundos 1 mL de proteína, de acordo com a Figura 1 (assumindo que uma placa completa é utilizada). Certifique-se adicionar as amostras em, ou perto, o fundo dos poços.
2. Adicionar 20 ul de padrão interno a cada poço (ie, calibradores, factores de resposta, CQs, e desconhecidos); é crucial para libertar a gota no lado do poço perto da superfície da amostra, sem submergir a ponta da pipeta.
3. Adicionar 0,2 mL de 5 M de guanidina-hidrocloreto a cada poço.
4. Colocar a placa da amostra num agitador de microplacas e misturar as amostras durante 45 min a 1100 rpm. A frequência ideal pode variar de acordo com instrumentação. Definir a frequência e a amplitude do misturador de modo a que as soluções são misturadas cuidadosamente, e não há gotas de padrão interno ou CSF não misturados são deixados no lado dos poços.
5. Adicionar 0,2 ml de ácido fosfórico a 4%a cada poço. Vortex misture rapidamente.

6. Extracção em Fase Sólida

NOTA: Em todos os de lavar, de carregamento, e passos de eluição, aplicar o mínimo possível de vácuo após a adição da solução e aumentar gradualmente conforme necessário para carregar ou eluir a solução. Desativar o vácuo entre cada carga e passo de eluição.

1. Coloque uma bandeja reservatório de resíduos debaixo de um modo misto, de troca catiónica, 96 poços de extração em fase sólida (SPE) placa na câmara colector de placa de extracção.
2. Sujeitar o sorvente SPE por adição de 0,2 ml de metanol a cada cavidade.
3. Equilibrar a sorvente por adição de 0,2 ml de ácido fosfórico a 4% a cada poço.
4. Transferir todas as amostras (cerca de 0,62 ml) em cada poço da placa de poços profundos para a placa de SPE. Usar uma pipeta de oito canais ao transferir as amostras a partir da placa de poços profundos para a placa de SPE; Não é crucial para transferir os volumes inteiros ou iguais de todas as amostras, desde que as amostras contêm um internoal padrão que irá compensar as variações.
5. Lavar o sorvente depois de as amostras terem passado através através da adição de 0,2 ml de ácido fosfórico a 4% a cada poço.
6. Após o solvente de lavagem foi eluído a partir do sorvente, substituir o tabuleiro de reservatório com uma placa de recolha ou câmaras de ar.
7. Elui-se a amostra a partir do adsorvente por duas vezes a adição de 50 uL de 75% de ACN / 10% de amónia concentrada, e em atenção que esta solução exige um vácuo muito baixo ao passar através do sorvente. Lembre-se de desativar o vácuo entre cada adição.
   1. OPCIONAL: Selar a placa de coleção ou tubos e congelá-los a -80 ° C. Retire o selo da placa de recolha ou tubos antes de prosseguir para a etapa 6.8.2.
   2. Secam-se os eluatos por centrifugação usando vácuo (sem aplicação de calor); esta pode levar de uma a várias horas, dependendo da centrífuga de vácuo.
   3. Selar os recipientes e congelá-los a -80 ° C.

7. Líquido chromatography

1. Preparar a fase móvel A (5% de ACN e 0,3% de amónia concentrada em água desionizada [v / v]), B (4% de água desionizada e 0,1% de amónia concentrada em ACN [v / v]), e lavagem da agulha (50% de ACN e 4% de amónia concentrada em água desionizada [v / v]).
   1. Para 500 ml de fase móvel A, adicionar 25 mL de ACN e 1,5 mL de amoníaco concentrado para água deionizada. Ajustar o volume final para 500 mL com água desionizada.
   2. Para 500 ml de fase móvel B, adicionar 500 mL de amónia concentrada e 25 ml de água desionizada para ACN. Ajustar o volume final para 500 mL com ACN.
   3. Preparar 250 mL de lavagem da agulha através da adição de 120 mL de ACN e 10 ml de amónia concentrada à água desionizada. Ajustar o volume final para 250 mL com água desionizada.
   4. Coloque a fase móvel A e B e garrafas de lavagem da agulha aberta num banho de ultra-sons durante 20 min antes da utilização com o sistema de CL
2. Dissolve-se cada amostra com 25 ul de 20% ACN, e 4% Concentrasolução de amoníaco ted e colocá-los num agitador durante 20 min. Centrifugar-se as amostras e colocá-los no amostrador automático (mantenha a 7 ° C).
3. Injecte 20 ul de amostra numa coluna monolítico 1 x 250 mm ² de poliestireno-divinilbenzeno (de fase reversa) mantida a 50 ° C.
   1. Utilizar o gradiente LC mostrados na Tabela 4 com um caudal de 0,3 mL / min. Desviar os dois primeiros e os últimos cinco minutos para o lixo (pós-coluna), utilizando uma válvula de desvio para reduzir a contaminação do espectrômetro de massa.

Análise 8. Mass Espectrométrico

NOTA: Estes parâmetros foram utilizados para um espectrómetro de massa de quadrupolo híbrido-Orbitrap equipado com fonte de ionização electrospray aheated.

1. Definir os parâmetros para a fonte de iões de acordo com a Tabela 5.
2. Defina o instrumento MS para isolar os 4+ estados de carga de Ap nativo _1-42 (1,129.48 em massa-a carga rácio [m / z]), ¹⁵ _1-42 NAβ (1,143.00 m / z), e ¹³ CAβ _1-42 (1,179.50 m / z) no analisador de massa de quadrupolo com uma largura de isolamento de 2,5 m / z.
3. Fragmentar os peptídeos isolados na célula de colisão com uma energia de colisão normalizada (NCE) de 17,0. Este pode ter de ser ajustado para cada instrumento, mesmo do mesmo tipo (e especialmente se estiver usando outros tipos de instrumentos, tais como um triplo quadrupolo MS).
4. Grave os espectros fragmento com uma resolução de 17.500, com uma meta de controle automático de ganho de 2 x 10 ⁵ encargos e um tempo máximo de injecção de 250 ms.

9. Processamento de Dados

1. Utilizar a soma dos iões dos produtos (com uma tolerância de ± massa de 250 unidades de massa mili [mmu)] na Tabela 6 para calcular as áreas de cromatografia para cada péptido. Note-se que os tipos de íons e números apenas são mostradas para Aâ nativa _{íons 1-42 de produtos, uma vez que são os mesmos para ambos ¹⁵ NAβ 1-42 e ¹³ CAβ 1-42.}
2. Determinar o factor de resposta média das duas amostras de factor de reacção dividindo a área sob a curva (pico cromatográfico) de ¹⁵ NAβ _1-42 com a área sob a curva de Ap nativo _1-42.
3. Ajustar a concentração do NAβ ¹⁵ _1-42 utilizado para calibração, multiplicando-se com o factor de resposta calculado no passo 9.2.
4. Construir uma curva de calibração locando as razões das áreas de ¹⁵ NAβ _1-42 a ¹³ CAβ _1-42 dos dois conjuntos de calibradores contra a concentração.
5. Calcular a inclinação e intercepção da curva de calibração por meio de regressão linear.
6. Calcular a proporção de Ap nativo _1-42 área para o padrão interno ⁽¹³ CAβ _1-42) para unamostras conhecidas.
7. Extrapolar a concentração de amostras desconhecidas a partir da curva de calibração usando a inclinação e intercepção obtida no passo 9.5.

Resultados

A configuração da placa da Figura 1 é utilizada para um prato de amostras. Se menos amostras desconhecidas estão a ser analisado, o segundo calibrador, conjuntos de RF, e QC deve ser colocado após a primeira metade das amostras desconhecidas.

Como pode ser visto na Figura 2, os calibradores estão perto da linha de regressão, com baixo desvio padrão. Este método tem um nível mais baix...

Discussão

Para o método descrito, em vez de usar uma matriz substituta, foi utilizada a abordagem de substituição analito ^{13, 14, 15, 16,} o que permite a calibração em CSF humano. A abordagem envolve duas analito substituto padrões marcados isotopicamente diferentes. Um ⁽¹⁵ NAβ ₁₄₂₎ é usado para gerar a curva de calibração em CSF humano, enquanto a outra ⁽¹³ CA...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 0.5 mL	Eppendorf	022431081
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 1.5 mL	Eppendorf	022431081
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL	Eppendorf	022431102
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 5 mL	Eppendorf	0030 108.310
Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plates 96	Eppendorf	951032905
Micronic 0.75 mL polypropylene tubes, V-bottom	Micronic	MPW32071BC3	Tubes used for collecting SPE eluate, but other collection devices can be used such as 96-well plates.
Micronic Split TPE Capcluster for 96 ind. tubes	Micronic	MP53026	Caps for Micronic tubes.
Micronic Loborack-96 white w high cover bar coded	Micronic	MPW51015BC3	Holder for Micronic tubes.
Biohit Optifit tips 1.2 mL	Sartorius	791210	Used to reach all the way to the bottom of the LoBind deepwell plates (96-well). Other narrow tips might work as well.
Waters Oasis MCX 96-well µElution Plate	Waters	186001830BA
Waters Plate manifold reservoir tray	Waters	WAT058942
Waters Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates	Waters	186001831
Ammonium hydroxide solution, puriss. p.a., reag. ISO, reag. Ph. Eur., ~25% NH3 basis	Sigma-Aldrich	30501-1L-D
Acetonitrile, Far UV HPLC Gradient grade, 2.5 L	Fisher Scientific	A/0627/17X
ortho-Phosphoric acid 85%, ACS,ISO,Reag. Ph Eur	Merck Millipore	1005731000
Guanidine Hydrochloride, 500 g	Thermo Scientific	24110
Thermo Scientific Q-exactive Hybrid Quadrupole Orbitrap Mass Spectrometer	Thermo Scientific	IQLAAEGAAPFALGMAZR	With bundled Dionex Ultimate 3000 LC & autosampler.
Dionex ProSwift RP-4H Monolith Column (1.0 x 250mm)	Dionex	066640
Bovine Serum Albumin, lyophilized powder, suitable for (for molecular biology), Non-acetylated	Sigma-Aldrich	B6917
Beta-Amyloid (1-42), Ultra Pure, TFA	rPeptide	A-1002-2
15N Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled	rPeptide	A-1102-2
13C Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled	rPeptide	A-1106-2
Microplate shakers, TiMix 2	Edmund Bühler	6110 000