Aβの絶対定量<sub&gt; 1-42</sub&gt; CSFに質量分析リファレンス測定手順を使用して

要約

A reference measurement procedure for the absolute quantification of Aβ_1-42 in human CSF based on solid-phase extraction and liquid chromatography tandem mass spectrometry is described.

要約

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disease among the elderly and accounts for 60-80% of all cases of dementia. Currently, the diagnosis of AD is based on cognitive tests and mental state exams, but the peptide amyloid-beta (Aβ) in cerebrospinal fluid (CSF) is increasingly used in clinical trials and settings. As for most protein and peptide biomarkers, quantification is performed using antibody-based techniques, such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). However, intra- and inter-laboratory variability in these assays hamper its use as a diagnostic marker in clinical routine.

An antibody-independent Reference Measurement Procedure (RMP) was developed based on solid-phase extraction (SPE) and liquid chromatography (LC)-tandem mass spectrometry (MS/MS), where stable, isotope-labeled Aβ peptides were used as internal standards, enabling absolute quantification. A high-resolution quadrupole-orbitrap hybrid instrument was used for the measurements. The method allows for the quantification of CSF Aβ_1-42 between 150-4,000 pg/mL.

概要

アルツハイマー病（AD）は、認知症の最も一般的な形態であり、全世界で約35万人^1に影響^を与え^ます 。広くADの病因の中心に位置するように考えられて疾患の神経病理学的特徴は、過リン酸化タウ蛋白質²の細胞内神経原線維変化および凝集したアミロイドβ（Aβ）ペプチド³からなる細胞外斑です。これに伴い、バイオマーカーによって、in vivoでのプラーク病変の評価は最近、AD ⁴のための研究診断基準に含まれています。 _Aβ1-42のCSF測定のために、いくつかのイムノアッセイが利用可能であり、多くの臨床検査室⁵で使用されています。 CSF中の_Aβ1-42の濃度は、BRでのプラーク中のペプチドの沈着を反映し、認知正常な高齢者に比べてAD患者では約50％低くなっていますAIN ^6、7。

これらのバイオマーカーは、主に免疫アッセイ（ すなわち、抗体ベースの技術）を用いて分析されているが、これらのアッセイは、マトリックス効果⁸によって影響され得ます。異なるテクノロジプラットフォームイムノアッセイおよびアッセイの標準化⁹の欠如の使用は^{、10は 11、12}困難なグローバルなカットオフ濃度の導入を行います。分析的に検証さRMPは、理想的には、分析プラットフォーム間でより良い比較では、全体的な測定のばらつきの要因のより良好な制御が得られ、異なるアッセイプラットフォームの均一なキャリブレーションを可能にするであろう。

開発されたLC-MS / MS法を用いて_Aβ1-42の絶対的な定量化は、抗体ベースのTECHNに関連する問題の多くを克服しますiques。検査医学（JCTLMデータベース識別番号C11RMP9）におけるトレーサビリティのための合同委員会がRMPとしてリストされている方法は_{、CSFAβ1を}調和させる認証標準物質（CRM）における_Aβ1-42の絶対濃度を決定するために使用されます技術および分析プラットフォーム間_-42測定。説明ワークフローは、医学の他の領域内のペプチドおよびタンパク質のための候補参照方法の開発のための関連性のものでなければなりません。

プロトコル

注：このプロトコルは、出発物質として、各Aβペプチドのために50μg/ mLの濃度で、少なくとも50μLのアリコートを必要とします。 Aβペプチドは、脱イオン水中の20％アセトニトリル（ACN）、4％濃アンモニア溶液（V / V）に溶解し、80℃で保存されるべきです。

注意：安全情報については、 表1を参照してください。

ソリューションの調製

1. 脱イオン水中でACN、濃縮アンモニアの4mLの（〜25％）の20 mLで希釈し、脱イオン水中の20％ACN、4％濃アンモニア溶液（v / v）を100mLのを準備します。脱イオン水で100mLへの最終的な音量を調整します。新鮮な毎日を行います。
2. 50 mLの最終容量まで脱イオン水にグアニジン塩酸塩の26.08グラムを溶解することにより、5 Mグアニジン塩酸50mLのを準備します。 20℃で保存し、新鮮な毎月を作ります。
3. 脱イオン水中の4％リン酸（V / 200mLのを準備v）で脱イオン水中に濃リン酸（〜85％）の9.4 mLで希釈し。脱イオン水で200ミリリットルの最終容量を調整します。冷蔵庫に保管し、新鮮毎週行います。
4. 脱イオン水中でACN 37.5 mL及び濃アンモニア5mLの（〜25％）を希釈して、脱イオン水中で75％ACNおよび10％濃アンモニア溶液50ml（V / V）を調製します。脱イオン水で50 mLで最終容量を調整します。新鮮な毎日を行います。
5. 日常の臨床分析から匿名化された残りの試料から得られたキャリブレータのためのヒトCSFの少なくとも2.5mLのを、解凍します。
6. 150mMのナトリウム、3.0 mMのK、1.4 mMのカルシウム、0.8 mMのマグネシウム、1.0 mMのP、および脱イオン水で155 mMののClを含む人工CSFを準備し、4ミリグラム/ mLの最終濃度にウシ血清アルブミンを追加します。唯一の1 mLを分析ごとに必要ですが、将来の使用のために大容量、一定分量を、およびストアを準備されています。

キャリブレーターの調製

1. 4 / mlの¹の0.5ミリリットルを準備20％のACNおよび0.5 mLのマイクロ遠心チューブ中の4％の濃アンモニアを50μg/ mLの_^15NAβ142 0.46ミリリットルの40μLを添加することにより_{5NAβ1-42ペプチド} 。 1分間ボルテックスミキサーで混合します。
2. 20％ACNおよび2 mLのマイクロ遠心チューブ中で4％の濃アンモニアの1.95 mLに50μLの4μg/ mLの¹⁵の_NAβ142を追加することにより、100ng / mlの_{^15NAβ1-42ペプチド}の2ミリリットルを準備します。 1分間ボルテックスミキサーで混合します。
3. 表2に示した各溶液の体積を混合することにより、6キャリブレーター溶液（AF）を準備します。 0.5、1.5、および2 mLのマイクロ遠心チューブを使用してください。 1分間ボルテックスミキサーで混合します。
4. 1分間ボルテックスミキサーに、表3ミックスに応じて対応するキャリブレーションソリューションと人間のCSFを追加することにより、0.5 mLのマイクロ遠心チューブ中の最終キャリブレータ（二重に）を準備します。

内部標準の調製

1. 20％ACNおよび2 mLのマイクロ遠心チューブ中の4％の濃アンモニアの1.968 mLに32μLを50μg/ mLの¹³の_CAβ142を追加することにより、0.8μgの/ mLの_{^13CAβ1-42ペプチド}の2ミリリットルを準備します。 1分間ボルテックスミキサーで混合します。
2. 5 mLのマイクロ遠心チューブ中の20％ACNおよび4％濃アンモニアの4.9 mLに0.8μgの/ mLの0.1mLのを追加することにより、16 ngの/ mLの^_13CAβ1-42ペプチドの5ミリリットルを準備します。 1分間ボルテックスミキサーで混合します。

レスポンスファクタのサンプルの4準備

注：応答因子（RF）決意を較正するために使用標識ペプチドの濃度_{^{（15NAβ1-42）}を}決定するために実行されます。これは、天然_{Aβ1-42ペプチド}の濃度は、アミノ酸分析（AAA）を用いて決定されていることを必要とします。このように、ボリュームおよびネイティブ_{Aβ1-42ペプチド}のアリコートの濃度AAAの要件を満たす必要があります。

1. 20％のACNおよび0.5 mLのマイクロ遠心チューブ中で4％の濃アンモニアの0.46 mLに50μg/ mlのネイティブ_Aβ1-42の40μLを追加することで、4μgの/ mLのネイティブ（非標識^_）Aβ1-42 0.5mLのを準備します。 1分間ボルテックスミキサーで混合します。
2. 20％の1.96 mLに4μgの/ mLの^_15NAβ1-42の4 / mlのネイティブ_Aβ1-42および20μLの20μLを追加することで、ネイティブと^_15NAβ1-42の2-mLの40 ngの/ mLのミックスを調製ACNおよび4％が2 mLのマイクロ遠心チューブ中のアンモニアを濃縮しました。 1分間ボルテックスミキサーで混合します。
3. 0.5mLのマイクロチューブに人工CSFの0.38 mLに40 ngの/ mLの混合物の20μLを追加します。重複を準備し、1分間ボルテックスミキサーで混ぜます。

5.サンプル調製

注：ローラー上、室温で測定されるサンプルを解凍します。

1. （使用している場合、品質管理を含む[QC]サンプル） 図1（完全版が使用されていると仮定）によると、96ディープウェルプレート1 mLのタンパク質に、各キャリブレータの0.18 mLを加え、応答率、および未知のサンプル。でサンプルを追加してください、またはウェルの底に近いです。
2. 各ウェル（ すなわち、キャリブレータ、応答因子のQC、及び未知数）に内部標準の20μLを追加します。ピペットチップを浸漬することなく、試料の表面に十分に近い側のドロップを解放することが重要です。
3. 各ウェルに0.2 mLと5 Mグアニジン塩酸塩を追加します。
4. マイクロプレートシェーカー上のサンプルプレートを配置し、1100 rpmで45分間サンプルを混ぜます。最適な周波数は、計装に応じて異なる場合があります。ソリューションが完全に混合され、内部標準またはCSFのない滴をウェルの側に混合されていない残っていないように、ミキサーの周波数と振幅を設定します。
5. 4％リン酸0.2 mLを加え各ウェルに。渦を簡単に混ぜます。

6.固相抽出

注：すべての洗浄、ロード、および溶出工程では、溶液を添加した後、可能な限り低い真空を適用し、ロードまたは溶液を溶出するために、必要に応じて徐々に増加します。各ローディングおよび溶出工程の間に真空を無効にします。

1. 混合モード下での廃棄物のための貯蔵トレーを入れ、抽出プレートマニホールド室における陽イオン交換、96ウェル固相抽出（SPE）プレート。
2. 各ウェルにメタノール0.2mLのを追加することにより、SPE吸着剤を調整します。
3. 各ウェルに、4％のリン酸を0.2mLを添加することにより吸着剤を平衡化します。
4. SPEプレートにディープウェルプレートから全てのサンプル（各ウェル中に約0.62ミリリットル）を転送します。 SPEプレートにディープウェルプレートからサンプルを転送するときに8チャンネルピペットを使用します。サンプルはインターンが含まれているため、すべてのサンプルの全体または同等のボリュームを転送することが重要ではありません変動を補償しますアル標準。
5. サンプルを各ウェルに4％リン酸を0.2mLを添加することによって通過した後の吸着剤を洗浄します。
6. 洗浄溶媒は、吸着剤から溶出した後、捕集板や管をリザーバートレイを交換してください。
7. 二回75％ACN / 10％濃アンモニアの50μLを添加することにより、吸着剤から試料を溶出し、そしてこの溶液が吸着剤を通過することは非常に低真空を必要とすることに注意してください。各添加の間に真空を無効にすることを忘れないでください。
   1. オプション：コレクションプレートまたはチューブを密封し、-80℃でそれらを凍結。 6.8.2に進む前に、コレクションプレートまたはチューブからシールを取り外します。
   2. （熱を加えることなく）真空遠心分離を使用して溶出液を乾燥させます。これは、真空遠心分離に応じて、数時間に1から取ることができます。
   3. 容器を密封し、-80℃でそれらを凍結。

7.液体クロマトグラフィー

1. 、およびニードル洗浄（50％ACN（ACN [V / V]で4％の脱イオン水および0.1％濃アンモニア）、B（脱イオン水[V / V]中の5％ACNおよび0.3％濃アンモニア）移動相Aを準備4％の脱イオン水にアンモニアを濃縮[v / v]）。
   1. 移動相Aの500ミリリットルのために、脱イオン水にACNの25mLの濃アンモニアの1.5 mLを加え。脱イオン水で500 mLで最終容量を調整します。
   2. 移動相Bの500ミリリットルのために、濃アンモニアの500μLとACNへの脱イオン水25 mLを加え。 ACNと500ミリリットルへの最終的な音量を調整します。
   3. ACN 120mLの脱イオン水に濃アンモニアの10ミリリットルを追加することにより、ニードル洗浄の250ミリリットルを準備します。脱イオン水で250 mLで最終容量を調整します。
   4. LCシステムで使用する前に20分間の超音波処理浴中にオープン移動相AとBとニードル洗浄瓶を入れて
2. 20％のACNの25μLと、4％concentraで各サンプルを溶解テッドアンモニア溶液と20分間シェーカー上に置きます。遠心分離機のサンプルダウンして、オートサンプラーに配置します（7℃に保ちます）。
3. 50℃に維持し、1×250ミリメートル²ポリスチレン-ジビニルベンゼン（逆相）モノリシックカラム上のサンプルの20μLを注入します。
   1. 0.3 mL /分の流速を用いて、表4に示すLC勾配を使用します。質量分析計の汚染を低減するために迂回バルブを使用して（ポストカラム）を無駄に2最初と最後の5分をそらします。

8.質量分析

注：これらのパラメータはaheatedエレクトロスプレーイオン化源を備えた四重極オービトラップハイブリッド質量分析計のために使用しました。

1. 表5に記載のイオン源のパラメータを設定します。
2. （ネイティブ_Aβ1-42の4+充電状態を分離するために1,129.48質量をMS機器を設定します2.5メートル/ zのの分離幅と四重極型質量分析計における電荷比[ のm / _z]）、1-42 ^{15NAβ（1,143.00} のm / z）、および^{_{13CAβ1-42（1,179.50}} のm / z）。
3. 17.0の正規化衝突エネルギー（NCE）との衝突セル内の単離されたペプチドを断片化します。 （このようなトリプル四重極MSなどの器具の他のタイプを、使用している場合は特に）であっても、同じタイプのこれは、各楽器に合わせて調整する必要がある場合があります。
4. 2×10 ⁵の電荷の自動利得制御対象と250ミリ秒の最大噴射時間で、17.500の分解能でフラグメントスペクトルを記録します。

9.データ処理

1. 各ペプチドのためのクロマトグラフィーの領域を計算するために、 表6に（±250ミリ質量単位[MMU]の質量公差）プロダクトイオンの合計を使用してください。イオンの種類と数は、ネイティブAβのために示されていることに注意してください _{1-42プロダクトイオン、彼らは^15NAβ1-42と^13CAβ1-42の両方で同じであるため。}
2. ネイティブ_Aβ1-42の曲線下面積を持つ^_15NAβ1-42の曲線（クロマトグラフピーク）の下の領域を分割して2つの応答因子サンプルの平均応答係数を決定します。
3. ステップ9.2で算出された応答因子でそれを掛けることによって、キャリブレーションのために使用される^_15NAβ1-42の濃度を調整します。
4. 濃度に対するキャリブレータの2セットから^_13CAβ1-42に^_15NAβ1-42の面積比をプロットして検量線を作成します。
5. 線形回帰を用いて検量線の傾きと切片を計算します。
6. アンのための内部標準^{_{（13CAβ1-42）}}にネイティブ_Aβ1-42の面積比を計算します既知のサンプル。
7. ステップ9.5で得られた傾きと切片を用いて、検量線から未知のサンプルの濃度を外挿する。

結果

図1のプレート設定は、サンプルの完全版のために使用されます。少数の未知の試料を分析する場合は、第二校正器、RF、およびQCセットは未知サンプルの前半の後に配置する必要があります。

図2に見られるように、校正器は、低い標準偏差を用いて、回帰直線に近いです。この方法は、150 pg / ml...

ディスカッション

記載された方法のために、代わりに代理母材を使用して、我々は、ヒトCSF中にキャリブレーションを可能にする、代用分析物アプローチ^{13、14、15、16を}用います。サロゲートの検体のアプローチは、二つの異なる同位体標識された規格を必要とします。別の_{^{（13CAβ142）}を}内部標準?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 0.5 mL	Eppendorf	022431081
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 1.5 mL	Eppendorf	022431081
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL	Eppendorf	022431102
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 5 mL	Eppendorf	0030 108.310
Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plates 96	Eppendorf	951032905
Micronic 0.75 mL polypropylene tubes, V-bottom	Micronic	MPW32071BC3	Tubes used for collecting SPE eluate, but other collection devices can be used such as 96-well plates.
Micronic Split TPE Capcluster for 96 ind. tubes	Micronic	MP53026	Caps for Micronic tubes.
Micronic Loborack-96 white w high cover bar coded	Micronic	MPW51015BC3	Holder for Micronic tubes.
Biohit Optifit tips 1.2 mL	Sartorius	791210	Used to reach all the way to the bottom of the LoBind deepwell plates (96-well). Other narrow tips might work as well.
Waters Oasis MCX 96-well µElution Plate	Waters	186001830BA
Waters Plate manifold reservoir tray	Waters	WAT058942
Waters Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates	Waters	186001831
Ammonium hydroxide solution, puriss. p.a., reag. ISO, reag. Ph. Eur., ~25% NH3 basis	Sigma-Aldrich	30501-1L-D
Acetonitrile, Far UV HPLC Gradient grade, 2.5 L	Fisher Scientific	A/0627/17X
ortho-Phosphoric acid 85%, ACS,ISO,Reag. Ph Eur	Merck Millipore	1005731000
Guanidine Hydrochloride, 500 g	Thermo Scientific	24110
Thermo Scientific Q-exactive Hybrid Quadrupole Orbitrap Mass Spectrometer	Thermo Scientific	IQLAAEGAAPFALGMAZR	With bundled Dionex Ultimate 3000 LC & autosampler.
Dionex ProSwift RP-4H Monolith Column (1.0 x 250mm)	Dionex	066640
Bovine Serum Albumin, lyophilized powder, suitable for (for molecular biology), Non-acetylated	Sigma-Aldrich	B6917
Beta-Amyloid (1-42), Ultra Pure, TFA	rPeptide	A-1002-2
15N Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled	rPeptide	A-1102-2
13C Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled	rPeptide	A-1106-2
Microplate shakers, TiMix 2	Edmund Bühler	6110 000