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摘要

外周注射的α-突触核蛋白原纤维进入的Tg的腹膜或舌的（M83 +/-:GFAP -luc +/-）小鼠，表达人α-突触核蛋白与家族性A53T突变和萤火虫萤光素酶，可诱发神经病理学，包括神经炎症在他们的中枢神经系统。

摘要

为了研究错误折叠的α-突触核蛋白的朊病毒样行为，小鼠模型是需要的允许α-突触核蛋白prionoids，其对中枢神经系统（CNS）内的神经病理学快速和简单的传输。在这里，我们描述了α-突触核蛋白原纤维的那intraglossal或腹膜内注射入bigenic的Tg（M83 +/-:GFAP -luc +/-）小鼠中，过表达人类α-突触核蛋白与朊病毒蛋白启动子的突变A53T和萤火虫萤光所述启动子为胶质纤维酸性蛋白（GFAP），足以诱导神经病理学疾病。相较于纯合子TG（M83 + / +）小鼠发展在8个月，杂TG（M83 +/-:GFAP -Luc +/-）一岁开始严重的神经系统症状的动物，直到他们达到一个保持自由自发的疾病22个月的年龄。有趣的是，经由intraperitoneα-突触核蛋白原纤维的注射人路线诱导神经系统疾病与麻痹5的Tg（M83 +/-:GFAP -luc +/-）的四只小鼠用229±17天的中位数的温育时间。患病动物表现出磷酸化α突触核蛋白的严重存款在他们的大脑和脊髓。 α-突触核蛋白的累积是十二烷基肌氨酸钠不溶性且与泛素和P62共定位，并且伴随着导致星形细胞神经胶质增生和小神经胶质细胞的炎症反应。令人惊讶地，α-突触核蛋白原纤维进入舌的接种是引起疾病只有五组注射的动物示出后285天α-突触核蛋白病理的一个不太有效。我们的研究结果表明，通过经由腹膜内途径的intraglossal路线，更使接种是合适的，以诱导神经系统疾病与突触核蛋白病有关的标志中的Tg（M83 +/-:GFAP -luc +/-）小鼠。这为研究朊病毒样发病诱发的新模式由α-突触核蛋白prionoids更细节D。

引言

有越来越多的证据表明，α-突触核蛋白具有类似于那些朊病毒蛋白，特别是在其能力，以自种子和细胞之间，并沿着神经通路传播错误折叠特性。 α-突触核蛋白的这个属性也被称为"朊病毒状"或"prionoid"，并通过观察在移植实验，这表明从患病神经元错误折叠的α-突触核蛋白的传递率支撑到新移植健康的神经元1,2 ，3，4。还直接注射错误折叠的α-突触核蛋白的进入大脑或周围， 例如后肢肌肉或肠壁，导致α-突触核蛋白病理到的远端部分的扩展的CNS 5，6，7，<SUP类= "外部参照"> 8，9，10。我们分析了通过外周途径α-突触核蛋白prionoids的传输中更详细和处理的问题的错误折叠的α-突触核蛋白是否可以在单个intraglossal或腹膜内注射后neuroinvade CNS中，先前已被证明为朊病毒但不能用于错折叠的α-特征突触核蛋白。朊病毒于舌的注射后，CNS的神经侵染经由传播沿着通向舌下神经，它位于脑干11的细胞核中的舌片的舌下神经实现。作为小鼠模型，我们选择的Tg（M83 +/-:GFAP -luc +/-）小鼠过表达来自朊病毒启动子的人α-突触核蛋白的A53T突变体，和下GFAP启动子控制萤火虫萤光监测由星形胶质细胞活化生物发光，如先前在大脑中所示朊病毒感染的小鼠12。在我们的手中bigenic TG（M83 +/-:GFAP -Luc +/-）如已被他人13所示的小鼠没有发生疾病直到晚上11个月的年龄。经由intraglossal或腹膜内途径诱导的神经学疾病与大脑病理学和Tg为脊髓人类α-突触核蛋白原纤维的单次注射（M83 +/-:GFAP -luc +/-）支持这一假设小鼠α-突触核蛋白prionoids分享朊病毒14的重要特征。

研究方案

所有的程序，包括动物与北莱茵 - 威斯特伐利亚州环境局（LANUV）的动物保护委员会批准执行。动物饲养和照顾根据具有12小时光照/黑暗周期和食物和水自由进入的标准条件。

1.动物模型

  1. 相互交叉的Tg半合子（GFAP -luc +/-）小鼠与半合子的Tg（M83 +/-）小鼠来生成半合子bigenic的Tg（M83 +/-:GFAP -luc +/-）小鼠15,16。
  2. 基因型与实时PCR后代对于转基因编码的人类α-突触核蛋白的，并用标准的PCR存在下萤火虫萤光素酶12,17。
  3. 在六到八周的年龄接种动物。

2.接种物制备

  1. 莫准备nomeric重组人α-突触核蛋白在含有150mM NaCl的20mM的Tris-盐酸（pH7.2）中作为已经Tris缓冲盐水（TBS）缓冲液的A53T突变先前描述的14。
  2. 通过在800rpm和37℃下5天搅拌单体重组人α-突触核蛋白的3微克/μL在定轨摇床中制备原纤维α-突触核蛋白为接种。
  3. 稀释在磷酸盐缓冲盐水（PBS）原纤维组件，以达到1微克/微升的最终浓度为腹膜内或2微克/μL为intraglossal接种。
  4. 片段与杆超声波仪的α-突触核蛋白原纤维进行1分钟（0.5秒的持续时间的40个脉冲，每个脉冲和振幅设定为50％之间的一第二暂停）在冰上。为了避免交叉污染播种。用干净的超声探头准备不同的接种。

3. Intraglossal注射

  1. 麻醉动物用intraperitoneal注射100mg / kg的氯胺酮和10mg / kg的甲苯噻嗪。捏动物的脚趾，并确认它不撤回其后肢，以确保适当的麻醉。使用对动物的眼睛兽医药膏，以防止干燥而麻醉下。
  2. 固定narcotized动物小心地用胶带上与它们对研究者面对头背卧位的加热板。
  3. 填充超声处理的α-突触核蛋白原纤维或PBS的5μL一个27克的一次性皮下注射器。
  4. 使用带锯齿的提示一个钝头镊子拇指持有动物的嘴打开，第二小钳子小心地拔出舌头，使舌底侧注射访问。
  5. 注入注射器的针头插入接近舌的左侧或右侧底端到舌下神经。 5秒后缓缓注入接种。慢慢地缩回针之后5秒以确保接种已经渗透组织，同时缩回针不会丢失。
  6. 从它的注视释放动物和离开它在持续监测加热板，直到完全恢复。

4.腹腔注射

  1. 对于腹膜内注射，通过吸入使用的2升/分钟的流速和蒸发器设定为2％异氟烷/氧不久narcotize动物在麻醉室中。捏动物的脚趾，并确认它不撤回其后肢，以确保适当的麻醉。
  2. 填充超声处理的α-突触核蛋白原纤维或PBS的50μL一个27克的一次性皮下注射器。
  3. 直接注射到小鼠的腹膜内，并避免通过与来自研究者背向头保持动物处于仰卧位和向下大约45°穿透小肠或盲肠位于腹壁后面。监控动物，直到他们恢复从麻醉。

5.生物发光成像

  1. 图像的Tg（M83 +/-:GFAP -luc +/-）小鼠每2-4周使用生物发光成像系统。
  2. 在成像之前不久在异氟烷/氧气室以2升/分钟的流速和蒸发器设定为2％麻醉小鼠。捏动物的脚趾，并确认它不撤回其后肢，以确保适当的麻醉。
  3. 刮脸和用脱毛膏脱毛的老鼠的头。颜色黑耳用无刺激性标记以封闭非特异性的生物发光。
  4. 稀D-荧光素钾盐，萤光素酶的底物，在PBS中的30mg / mL的储备溶液。在-20℃1个毫升等分试样存储此。保护免于暴露溶解D-荧光素发光。
  5. 前称量动物注射。计算D-荧光素为150毫克/公斤体重注射的准确体积。腹腔注射Ð-luciferin和动物恢复到麻醉室。
  6. 启动成像软件。成像系统已经达到后其操作温度通过点击在控制面板的"初始化"按钮初始化系统。
  7. 选择按钮"发光"和"照片"。曝光时间设置为60秒，分级为"中等"，在F /停止"1"，而EM增益为"关闭"。
  8. 确认该激发滤光片被设置为"阻止"和发射滤波器，以"打开"，并且对象的高度设定至1.50公分。
  9. 注射D-萤光素后十分钟，将动物在上成像室的加热板，并确保它们的枪口都正确放置在麻醉出口。关闭从吸入室中的异氟烷/氧气流，并打开用于成像室的流动以0.25 L / min的流速和2％的蒸发。关闭成像室PR的门operly。
  10. 点击"捕获"按钮来衡量生物发光，这需要60秒。停止异氟醚流和监控动物，直到他们返回他们回到笼子后完全恢复。
  11. 使用图像处理软件，量化生物发光。在该"工具选项板"选择"ROI工具"。根据"投资回报工具"中的"类型"选择"测量投资回报率。
  12. 在该"投资回报工具"点击"圆"工具，选择投资回报率的数量从下拉菜单画 - 理想"3"三只老鼠。
  13. 在图像中，右击每个ROI和下"属性"的宽度和高度调整至1.25公分。在被量化的大脑区域中的每个ROI的位置。
  14. 在图像的左上角，所述单元面板设置为"辐射（光子）"。
  15. 在该"工具面板"，选择"图像调整"和调整最低和最大的"色阶"，例如，距离0.20e6到1.00e6。
  16. 在"文件"保存"保存"的数据。

6.生化分析

  1. 根据已建立的方案18,19隔离脑和脊髓。
  2. 均质化全脑和整个脊髓样品分别在PBS中在蛋白酶和磷酸酶抑制剂（在PBS中稀释至1×）的两个30秒周期的存在下与在组织匀浆器6000转。确保脑和脊髓样品均质化至20％（重量/体积）的最终浓度。
  3. 声处理样品的两倍，而以10个s的恒定脉冲和振幅设定为50％使它们保持在冰上。
  4. 1用1.5M NaCl的PBS:通过稀释它们1调整到匀浆在PBS和750mM的NaCl的10％。
  5. 为了分离细胞碎片，离心匀浆物在1,000×g于5分钟4℃。保持下一个步骤的上清液并丢弃颗粒。
  6. 测量根据制造商的说明书，使用二辛可宁酸（BCA）测定法匀浆中的蛋白质浓度。以10％（重量/体积）在冰上15分钟的最终浓度从孵育的脑匀浆1.0毫克总蛋白或从在N- laurylsarcosyl脊髓匀浆0.8毫克。
  7. 叠加到匀浆在蒸馏水中的10％（重量/体积）3mL的蔗糖垫，并在4℃以465000×g下超速离心它们1个小时。
  8. 重悬粒料在含4％十二烷基硫酸钠（SDS），2％β巯基乙醇，192 100mM甘氨酸，25毫摩尔Tris，和5％（重量/体积）蔗糖的缓冲液。
  9. 煮沸样品在100℃下5分钟，并将它们加载到SDS-聚丙烯酰胺凝胶用于在吗啉乙磺酸（MES）缓冲系统电泳。
  10. 转移分离的蛋白质以聚偏二氟乙烯（PVDF）膜中的SEMidry印迹系统。
  11. 孵育所述膜在0.4％（体积/体积）甲醛在室温下在PBS中的溶液30分钟，在转子与35rpm下以交联与膜蛋白质。
  12. 方框在含有0.05％（体积/体积）的TBS缓冲液吐温20和在室温下1个小时5％（重量/体积）奶粉的膜。
  13. 孵育与初级抗体的印迹在4℃过夜封闭缓冲液。
  14. 洗涤该膜三次在TBS缓冲液中，并用在室温下1个小时，在TBS过氧化物酶或荧光团偶联的二级抗体孵育它们。
  15. 根据已建立的方案20通过化学发光或荧光显现结合的二次抗体。

7.免疫荧光分析

  1. 脱水解剖脑和脊髓组织中的加工工位，并且使用石蜡站将它们嵌入到石蜡中。
  2. 切石蜡包埋TIS在8个微米厚的冠状切片切片机起诉并安装在载玻片上的章节。
  3. 通过在两个单独的二甲苯浴5将它们孵育至10分钟Deparaffinize的组织切片，并通过一系列梯度乙醇浴（100％，90％，70％，50％），最后用H 2 O再水化它们
  4. 孵育在0.01M柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）的部分，在室温下5分钟，并另外煮沸用于在微波炉中10分钟。
  5. 让部冷却到室温，并用30分钟3％过氧化氢溶液抑制内源性过氧化物酶孵育它们。
  6. 用20％（体积/体积）正常山羊血清，1％（体积/体积）牛血清白蛋白（BSA）和0.5％的Triton X-100的PBS在室温下1个小时阻断由孵化的组织切片。
  7. 孵育切片用1％（体积/体积）正常山羊血清，1％（体积/体积）BSA，和0.25％Triton在PBS X-100过夜，在4℃稀释一级抗体。
  8. 用0.25％（体积/体积）的Triton X-100的PBS并用PBS洗涤一次的部分两次。
  9. 染色与相应的荧光团偶联的二级抗体和在1％稀释的核染料DAPI（体积/体积）正常山羊血清，1％（体积/体积）BSA和PBS中于室温下1个小时的章节。
  10. 用0.25％（体积/体积）的Triton X-100的PBS并用PBS洗涤一次两次后，盖玻片嵌入媒体的幻灯片和可视化用共焦激光扫描显微镜的染色。

结果

小鼠（ 表1和图1）:通过舌或bigenic的Tg的CNS（GFAP -luc +/- M83 +/-）腹膜诱导神经病理学α-突触核蛋白prionoids的外周注射。一个单次腹腔注射与α-突触核蛋白原纤维后，五只小鼠的4开发神经疾病具有229±17天的中位数的温育时间。出人意料的是，五只小鼠的一个开发CNS疾病intraglossal注射后285天α-突触核蛋白原纤维后。接种PBS没有?...

讨论

外周注射的α-突触核蛋白原纤维的成的Tg（M83 +/-:GFAP -luc +/-）的小鼠腹膜表示简便方法来诱导神经系统疾病伴有神经炎症概括突触核蛋白病的重要特征。类似地，舌注射表示在转基因小鼠为神经侵染另一个路径由α-突触核蛋白prionoids但效率较低。我们选择在注射后420天终止我们的实验，我们不能排除多个或所有的纤维注射的小鼠可在稍后的时间点已经发展疾病的可能性。另?...

披露声明

作者什么都没有透露。

致谢

作者感谢奥尔加·沙玛，特丽萨·亨特和的DZNE显微镜和动物设施的技术支持人员。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
anti-actin antibodyMerck MilliporeMAB1501
anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [pSyn#64]Wako015-25191
anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [EP1536Y]Abcamab51253
anti-GFAP antibodyDakoZ0334 01
anti-IBA-1 antibodyWako019-19741
anti-Sequestosome-1 (p62) antibodyProteintech18420-1-AP
anti-ubiquitin antibody [Ubi-1]Merck MilliporeMAB1510
Phosphate-buffered saline (PBS)Invitrogen14190169
Ketamine Ratiopharm100 mg/kg
XylazineRatiopharm10 mg/kg
27 G syringeVWR613-4900
Isoflurane Piramal HealthcarePZN  4831850
Depilatory creamVeet
Secureline lab marker Neolab25040
D-luciferin potassium saltAcrisLK1000030 mg/mL stock solution
ThermomixerEppendorf5776671
Sonopuls Mini20 sonicatorBandelin3648
IVIS Lumina II imaging systemPerkinElmer
Living Image 3.0 SoftwarePerkinElmer
Tg(M83+/-) mice or B6;C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J miceThe Jackson Laboratory004479
Standard pattern forcepsFine Science Tools11000-16
Narrow pattern forcepsFine Science Tools11002-12
N-laurylasarcosylSigmaL5125-100G
Optima Max-XP ultracentrifuge Beckman CoulterTLA-110 rotor 
Thickwall polycarbonate tubesBeckman Coulter362305
NuPAG Novex 4-12% Bis-Tris Midi Protein GelsThermo Fisher ScientificWG1401BOX
HRP conjugated antibodyCaymanCay10004301-1
IR Dye 680 conjugated antibody LI-COR Biosciences926-68070
SuperSignal West Dura Extended Duration SubstrateThermo Fisher Scientific34075
Stella 3200 imaging systemRaytest
Odyssey infrared imaging system LI-COR Biosciences
Tween 20 MP BiomedicalsTWEEN201
Triton X-100SigmaSA/T8787
Immobilon-FL PVDF membraneMerck MilliporeIPFL00010
XylolSigmaRoth
Hydrogen peroxideSigmaSA/00216763/000500working solution 3%
Bovine serum albumine (BSA) Thermo Fisher ScientificA3294-100G
Goat serumThermo Fisher ScientificPCN5000
4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Thermo Fisher ScientificD1306working dilution 1:50,000
Fluoromount media OmnilabSA/F4680/000025
LSM700 confocal laser scanning microscopeCarl Zeiss
HALT protease and phosphatase inhibitorsThermo Fisher Scientific 10516495
Precellys 24-Dual homogenizer Peqlab91-PCS24D
Alexa Fluor 488 conjugated antibodyThermo Fisher ScientificA31619
Alexa Fluor 594 conjugated antibodyThermo Fisher ScientificA11005
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Fisher Scientific10741395
Microtome RM2255Leica
LSM700 confocal laser scanning microscopeCarl Zeiss

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