Imagem de bioluminescência de Neuroinflammation em Ratinhos Transgénicos Após inoculação periférica de alfa-sinucleína fibrilas

Resumo

Injecção periférica de fibrilas-sinucleína alfa no peritoneu ou língua de Tg (M83 ^+/-: GFAP -Luc ^+/-) ratos, que expressam alfa-sinucleína humana com a mutação A53T familiar e a luciferase do pirilampo, pode induzir a neuropatologia, incluindo neuroinflamao , em seu sistema nervoso central.

Resumo

Para estudar o comportamento de prião de tipo de enrolamento incorrecto alfa-sinucleína, são necessários modelos de murganho que permite a transmissão rápida e simples de prionoids alfa-sinucleína, que causam neuropatologia no interior do sistema nervoso central (SNC). Aqui descrevemos que intraglossal ou injecção intraperitoneal de fibrilas-sinucleína em alfa bigenic Tg (M83 ^+/-: GFAP -Luc ^+/-) ratos, que sobre-expressam alfa-sinucleína humana com a mutação A53T a partir do promotor da proteína prião e a luciferase do pirilampo de o promotor para a proteína ácida fibrilar glial (GFAP), é suficiente para induzir doença neuropatológica. Em comparação com Tg homozigótica (M83 ^{+ / +)} ratinhos que desenvolvem sintomas neurológicos graves começam com uma idade de 8 meses, heterozigótica Tg (M83 ^+/-: GFAP -Luc ^+/-) animais permanecem livres da doença espontânea até atingirem um idade de 22 meses. Interessantemente, a injeco de fibrilas-sinucleína alfa através da intraperitoneal rota induzida doença neurológica com paralisia em quatro de cinco Tg (M83 ^+/-: GFAP -Luc ^+/-) ratos com um tempo de incubação médio de 229 ± 17 dias. animais doentes mostrou depósitos graves de fosforilada alfa-sinucleína em seus cérebros e medulas espinhais. Acumulações de alfa-sinucleína foram sarcosil-insolúvel e co-localizada com ubiquitina e p62, e foram acompanhados por uma resposta inflamatória que resulta em gliose de astrócitos e microgliose. Surpreendentemente, a inoculação de fibrilas-sinucleína alfa para a língua era menos eficaz em causar doença com apenas um dos cinco animais injectados mostrando alfa-sinucleína patologia após 285 dias. Nossos resultados mostram que a inoculação por via intraglossal e mais ainda através da via intraperitoneal é adequado para induzir doença neurológica com características relevantes da sinucleinopatias em Tg (M83 ^+/-: GFAP -Luc ^+/-) camundongos. Isto fornece um novo modelo para estudar prion-como patogênese induzird por prionoids alfa-sinucleína em maior detalhe.

Introdução

Existe evidência crescente de que o alfa-sinucleína tem características que são semelhantes às da proteína prião, em particular na sua capacidade de se auto-propagam semente e enrolamento incorrecto entre as células e ao longo de caminhos neuronais. Esta propriedade de alfa-sinucleína é também referido como 'prião de tipo' ou 'prionoid', e é suportada por observações em experiências de transplantação, o que sugere a transmissibilidade do enrolamento incorrecto alfa-sinucleína a partir de neurónios doentes para recém-transplantados neurónios saudáveis ^{1, 2 , 3, 4.} Também injecção directa de enrolamento incorrecto alfa-sinucleína no cérebro ou da periferia, por exemplo, o músculo do membro posterior ou parede intestinal, resulta numa disseminação da patologia alfa-sinucleína a partes distais do SNC ^{5, 6, 7, 8, 9, 10. Analisou-se a transmissão de prionoids alfa-sinucleína por vias periféricas em mais detalhe e dirigiu-se à questão de saber se misfolded alfa-sinucleína pode neuroinvade do SNC após uma única injecção intraperitoneal ou intraglossal, uma característica que tinha sido previamente demonstrado para priões, mas não para alfa- misfolded sinucleína. Após a injecção de priões para a língua, neuroinvasão do SNC é alcançada através de propagação ao longo do nervo hipoglosso da lingueta que conduz para o núcleo do nervo hipoglosso, que está localizado no tronco cerebral 11. Como um modelo de ratinho que escolheu Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) murganhos que sobre-expressam o mutante A53T de alfa-sinucleína humano a partir do promotor do prião, e luciferase de pirilampo sob o controlo de um promotor GFAP para monitorizar a activação de astrócitos pela bioluminescência, como mostrado anteriormente no cérebro deprião-infectados ratinhos 12. Em nossas mãos bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) ratos não desenvolveram a doença até 23 meses de idade, como tem sido demonstrado por outros 13. Uma única injecção de fibrilas-sinucleína alfa humanos através da rota ou intraglossal induzida doença neurológica intraperitoneal com patologia nos cérebros e medulas espinhais de Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) murganhos que suportam a hipótese de que prionoids alfa-sinucleína compartilham características importantes com priões 14.}

Protocolo

Todos os procedimentos, incluindo animais foram realizados com a aprovação da comissão de proteção animal de Rhine-Westphalia Agência Norte Estadual do Meio Ambiente (LANUV). Os animais foram alojados e tratados de acordo com condições padrão com um 12 h ciclo de luz / escuro e acesso livre a alimento e água.

1. Modelo Animal

1. Intercross hemizigótica Tg (GFAP -Luc ^+/-) ratinhos com ratinhos hemizigótica Tg (M83 ^+/-) para gerar hemizigótica bigenic Tg (M83 ^+/-: GFAP -Luc ^+/-) ratos ^{15, 16.}
2. Genótipo a descendência com PCR em tempo real para a presença do transgene que codifica alfa-sinucleína humana e com a PCR padrão para a luciferase de pirilampo ^{12, 17.}
3. Inocular os animais em uma idade de seis a oito semanas.

2. Preparação do inóculo

1. Prepare monomeric alfa-sinucleína recombinante humana com a mutação A53T em solução salina tamponada com Tris (TBS) contendo 150 mM de NaCl em Tris-HCl 20 (pH 7,2) como foi anteriormente descrito ^14.
2. Prepare fibrilar alfa-sinucleína para inoculações, por agitação de 3? G /? L de alfa-sinucleína monomérica humana recombinante num agitador orbital a 800 rpm e 37 ° C durante 5 dias.
3. Dilui-se conjuntos de fibrilas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) para atingir uma concentração final de 1 ug / mL para intraperitoneal ou 2 ug / mL para inoculações intraglossal.
4. Fragmentar as fibrilas-sinucleína alfa com um sonicador de haste durante 1 min (40 impulsos de duração de 0,5 s com uma pausa de um segundo entre cada pulso e uma amplitude definida como 50%) em gelo. Para evitar a contaminação por cross-sementeira. Utilizar sondas de sonicação limpas para preparar inoculo diferente.

3. Injeções Intraglossal

1. Anestesiar os animais com uma intraperitoneal injecção de 100 mg / kg de cetamina e 10 mg / kg de xilazina. Beliscar dedo do pé do animal e confirmar que ele não retirar a pata traseira para garantir anestesia adequada. Use vet pomada sobre os olhos do animal para evitar a secura sob anestesia.
2. Fix animais narcotizados cuidadosamente com fita adesiva sobre uma placa de aquecimento numa posição de decúbito dorsal com as cabeças viradas para o investigador.
3. Encher uma seringa hipodérmica descartável 27 G com 5 mL de fibrilas-sinucleína alfa sonicadas ou PBS.
4. Use uma pinça polegar sem corte de nariz com pontas serrilhadas para manter a boca do animal aberta, e um par segunda menor de pinça para retirar cuidadosamente a língua para fazer a parte de baixo da língua acessível para injeção.
5. Injectar a agulha da seringa no lado inferior direito ou esquerdo da língua em proximidade com o nervo hipoglosso. Lentamente injectar o inoculo após 5 s. Lentamente retrair a agulha depois de 5 segundos para assegurar que o inoculotenha penetrado no tecido e não é perdida durante a retracção da agulha.
6. Solte o animal de suas fixações e deixá-lo na placa de aquecimento sob monitoramento constante até a recuperação completa.

4. injeção intraperitoneal

1. Para injecções intraperitoneais, narcotizar os animais em breve numa câmara de anestesia por inalao com isoflurano / oxigénio utilizando um caudal de 2 L / min e o vaporizador ajustado para 2%. Beliscar dedo do pé do animal e confirmar que ele não retirar a pata traseira para garantir anestesia adequada.
2. Encher uma seringa hipodérmica descartável 27 G com 50 uL de fibrilas-sinucleína alfa sonicadas ou PBS.
3. Injectar directamente no peritoneu do rato e evitar a penetração do intestino delgado ou ceco localizado por trás da parede abdominal, mantendo o animal numa posição dorsal, com a cabeça virada para longe do investigador e para baixo a cerca de 45 °. Monitorar os animais até que tenham recuperadoda anestesia.

5. A bioluminescência imagem

1. Imagem Tg (M83 ^+/-: GFAP -Luc ^+/-) ratos cada 2-4 semanas, utilizando um sistema de imagem de bioluminescência.
2. Antes da imagiologia, pouco anestesiar os ratos numa câmara de isoflurano / oxigénio com uma taxa de fluxo de 2 L / min e o vaporizador ajustado para 2%. Beliscar dedo do pé do animal e confirmar que ele não retirar a pata traseira para garantir anestesia adequada.
3. Raspar e depilar as cabeças dos ratinhos com um creme depilatório. Colorir as orelhas em preto com um marcador não irritante para bloquear a bioluminescência inespecífica.
4. Dilui-se o sal de potássio de D-luciferina, o substrato da luciferase, em PBS a uma solução estoque de 30 mg / mL. Conserva-se a em aliquotas de 1 ml a -20 ° C. Proteger o D-luciferina dissolvido da exposição à luz.
5. Pesar os animais antes da injecção. Calcular o volume exacto de D-luciferina para injecção de 150 mg / kg de peso corporal. Intraperitonealmente injectar D-luciferin e retornar o animal à câmara de anestesia.
6. Inicie o software de imagem. Depois que o sistema de imagem atingiu sua temperatura de funcionamento inicializar o sistema, clicando no botão 'Inicializar' no painel de controle.
7. Selecione os botões 'luminescentes' e 'Photograph'. Defina o tempo de exposição a 60 s, o binning de 'Medium', o F / Stop para '1', e o ganho EM para 'Off'.
8. Confirme se o filtro de excitação é definido como 'bloco' eo filtro de emissão para 'Open' e definir a altura sujeita a 1,50 cm.
9. Dez minutos após a injecção com D-luciferina, colocar os animais sobre a placa de aquecimento na câmara de imagiologia e assegurar que os focinhos estão correctamente colocados na saída de anestesia. Fechar o fluxo de isoflurano / oxigénio a partir da câmara de inalação e abrir o fluxo para a câmara de imagem com um caudal de 0,25 L / min e uma evaporação de 2%. Feche a porta do pr câmara de imagemoperly.
10. Clique no botão 'Adquirir' para medir a bioluminescência, que leva 60 s. Parar o fluxo de isoflurano e monitorar os animais até que tenham recuperado completamente depois devolvê-los de volta às suas gaiolas.
11. Use o software de imagem para quantificar a bioluminescência. Dentro do 'Tool Palette' selecionar 'Ferramentas de ROI'. Em 'Tipo' dentro 'Ferramentas de ROI' selecionar 'Medição ROI'.
12. Dentro das ferramentas de ROI 'clique na ferramenta "círculo" e selecione o número de ROIs para desenhar a partir do menu suspenso - idealmente '3' por três ratos.
13. Na imagem, clique com o botão direito em cada ROI e sob 'Propriedades' ajustar a largura e altura para 1,25 cm. Posicionar cada ROI sobre a área do cérebro que é quantificado.
14. No canto superior esquerdo da imagem, definir o painel de unidades de 'radiância (fotões)'.
15. Dentro do 'Tool Palette', selecione 'Ajuste de Imagem' e ajustar o mínimo ea máxima do 'escala de cores', por exemplo, a partir 0.20e6 para 1.00E6.
16. Em 'File' salvar os dados com 'Save'.

6. A análise bioquímica

1. Isolar os cérebros e medulas espinhais de acordo com protocolos estabelecidos ^{18, 19.}
2. Homogeneizar o cérebro inteiro e amostras da medula espinal inteiros separadamente em PBS na presença de inibidores de protease e fosfatase (diluídos até 1x em PBS) em dois ciclos de 30 s com a 6000 rpm num homogeneizador de tecidos. Assegure-se que o cérebro e na medula espinhal amostras são homogeneizados a uma concentração final de 20% (peso / vol).
3. Sonicar as amostras duas vezes, mantendo-os em gelo com um impulso constante de 10 s e uma amplitude definida como 50%.
4. Ajustar os homogenatos a 10% em PBS e NaCl 750 mM, por diluição com 1: 1 com NaCl 1,5 M em PBS.
5. Para separar os detritos celulares, centrifugar os homogenatos a 1000 xg durante 5 min a4 ° C. Mantenha os sobrenadantes para os próximos passos e descartar os pellets.
6. Medir a concentração da proteína nos homogeneizados usando o ensaio de ácido bicinconínico (BCA) de acordo com as instruções do fabricante. Incubar 1,0 mg de proteína total a partir de homogenatos de cérebro ou de 0,8 mg a partir de homogenatos de medula espinhal de N-laurylsarcosyl a uma concentração final de 10% (p / vol) durante 15 min em gelo.
7. Sobrepor os homogeneizados numa almofada de sacarose a 3 mL de 10% (p / vol) em água destilada e ultracentrífuga-los em 465.000 xg durante 1 h a 4 ° C.
8. Ressuspender as pastilhas numa solução tampão contendo 4% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 2% β-mercaptoetanol, glicina 192 mM, Tris 25 mM, e 5% (p / v) de sacarose.
9. Ferver as amostras a 100 ° C durante 5 min e carregá-los no géis de SDS-poliacrilamida para electroforese em um sistema tampão de ácido morpholineethanesulfonic (MES).
10. Transferir as proteínas separadas para difluoreto de polivinilideno (PVDF) em membranas de uma SEMiDry sistema de mata-borrão.
11. Incubar as membranas em 0,4% (vol / vol) de solução de formalina em PBS durante 30 min à temperatura ambiente em um rotor com 35 rpm para reticular as proteínas com a membrana.
12. Bloquear as membranas em tampão TBS contendo 0,05% (vol / vol) de Tween 20 e 5% (p / v) de leite durante 1 h à temperatura ambiente.
13. Incubar as manchas com o anticorpo primário em tampão de bloqueio durante a noite a 4 ° C.
14. Lavam-se as membranas três vezes em tampão de TBS e incube-as com anticorpos secundários peroxidase ou fluoróforos em TBS durante 1 h à temperatura ambiente.
15. Visualizar os anticorpos secundários ligados por quimioluminesccia ou fluorescência de acordo com protocolos estabelecidos ^20.

Análise 7. Imunofluorescência

1. Desidratar os cérebros dissecados e medulas espinhais de uma estação de processamento de tecidos e incorporá-los em parafina usando um banho de parafina.
2. Cortar o tis embebidos em parafinasues com um micrótomo em 8 mm cortes coronais de espessura e montar as secções sobre lâminas de vidro.
3. Desparafinar as secções de tecido, incubando-as em dois banhos separados xilol durante 5 a 10 minutos e re-hidratar-los através de uma série de banhos de etanol graduadas (100%, 90%, 70%, 50%) e finalmente com H ₂ O.
4. Incubar as secções em 0,01 M de tampão de citrato (pH 6,0) durante 5 min à temperatura ambiente e, adicionalmente, ferve-las durante 10 min num forno de microondas.
5. Deixe as secções de arrefecer até à temperatura ambiente e incube-as com uma solução de peróxido de hidrogénio a 3% durante 30 minutos para inibir as peroxidases endógenas.
6. Bloquear as secções de tecido, por incubação com 20% (vol / vol) de soro de cabra normal a 1% (vol / vol) de albumina de soro bovino (BSA) e 0,5% de Triton X-100 em PBS durante 1 h à temperatura ambiente.
7. Incubar as secções com o anticorpo primário diluído em 1% (vol / vol) de soro de cabra normal a 1% (vol / vol) de BSA, e 0,25% de Triton X-100 em PBS durante a noite a 4 ° C.
8. Lavar as secções duas vezes com 0,25% (vol / vol) Triton X-100 em PBS e uma vez com PBS.
9. Corar as secções com anticorpos secundários conjugados com fluoróforo correspondentes e o corante nuclear DAPI diluída em 1% (vol / vol) de soro de cabra normal a 1% (vol / vol) de BSA e PBS durante 1 h à temperatura ambiente.
10. Depois de lavar duas vezes com 0,25% (vol / vol) Triton X-100 em PBS e uma vez com PBS, as lâminas com lamela meios de embebimento e visualizar a coloração com um microscópio confocal de varrimento laser.

Resultados

Injecção periférica de prionoids alfa-sinucleína através da língua ou no peritoneu induzida neuropatologia no CNS de Tg bigenic (M83 ^+/-: GFAP -Luc ^+/-) murganhos (Tabela 1 e Figura 1). Após uma única injecção intraperitoneal com fibrilas-sinucleína alfa, quatro de cinco ratinhos desenvolveram uma doença neurológica com um tempo de incubação médio de 229 ± 17 dias. Surpreendentemente, apenas um de cinco rat...

Discussão

Injecção periférica de fibrilas-sinucleína alfa no peritoneu de Tg (M83 ^+/-: GFAP -Luc ^+/-) ratinhos representa um método fácil para induzir a doença neurológica acompanhada por neuroinflamao recapitular características importantes de sinucleinopatias. Da mesma forma, a injecção língua representa uma outra via para neuroinvasão por prionoids alfa-sinucleína em ratinhos transgénicos, mas é menos eficiente. Escolhemos para terminar nossas experiências em 420 dias após a inj...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-actin antibody	Merck Millipore	MAB1501
anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [pSyn#64]	Wako	015-25191
anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [EP1536Y]	Abcam	ab51253
anti-GFAP antibody	Dako	Z0334 01
anti-IBA-1 antibody	Wako	019-19741
anti-Sequestosome-1 (p62) antibody	Proteintech	18420-1-AP
anti-ubiquitin antibody [Ubi-1]	Merck Millipore	MAB1510
Phosphate-buffered saline (PBS)	Invitrogen	14190169
Ketamine	Ratiopharm		100 mg/kg
Xylazine	Ratiopharm		10 mg/kg
27 G syringe	VWR	613-4900
Isoflurane	Piramal Healthcare	PZN  4831850
Depilatory cream	Veet
Secureline lab marker	Neolab	25040
D-luciferin potassium salt	Acris	LK10000	30 mg/mL stock solution
Thermomixer	Eppendorf	5776671
Sonopuls Mini20 sonicator	Bandelin	3648
IVIS Lumina II imaging system	PerkinElmer
Living Image 3.0 Software	PerkinElmer
Tg(M83+/-) mice or B6;C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J mice	The Jackson Laboratory	004479
Standard pattern forceps	Fine Science Tools	11000-16
Narrow pattern forceps	Fine Science Tools	11002-12
N-laurylasarcosyl	Sigma	L5125-100G
Optima Max-XP ultracentrifuge	Beckman Coulter		TLA-110 rotor
Thickwall polycarbonate tubes	Beckman Coulter	362305
NuPAG Novex 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels	Thermo Fisher Scientific	WG1401BOX
HRP conjugated antibody	Cayman	Cay10004301-1
IR Dye 680 conjugated antibody	LI-COR Biosciences	926-68070
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate	Thermo Fisher Scientific	34075
Stella 3200 imaging system	Raytest
Odyssey infrared imaging system	LI-COR Biosciences
Tween 20	MP Biomedicals	TWEEN201
Triton X-100	Sigma	SA/T8787
Immobilon-FL PVDF membrane	Merck Millipore	IPFL00010
Xylol	Sigma	Roth
Hydrogen peroxide	Sigma	SA/00216763/000500	working solution 3%
Bovine serum albumine (BSA)	Thermo Fisher Scientific	A3294-100G
Goat serum	Thermo Fisher Scientific	PCN5000
4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	D1306	working dilution 1:50,000
Fluoromount media	Omnilab	SA/F4680/000025
LSM700 confocal laser scanning microscope	Carl Zeiss
HALT protease and phosphatase inhibitors	Thermo Fisher Scientific	10516495
Precellys 24-Dual homogenizer	Peqlab	91-PCS24D
Alexa Fluor 488 conjugated antibody	Thermo Fisher Scientific	A31619
Alexa Fluor 594 conjugated antibody	Thermo Fisher Scientific	A11005
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	10741395
Microtome RM2255	Leica
LSM700 confocal laser scanning microscope	Carl Zeiss