α-シヌクレイン線維の末梢接種後のトランスジェニックマウスにおける神経炎症の生物発光イメージング

要約

Tgは（M83 ^+/-：GFAP -Luc ^+/-）の腹膜または舌にα-シヌクレイン原線維の末梢注入家族A53T変異ホタルルシフェラーゼでヒトα-シヌクレインを発現するマウスは、神経炎症を含む、神経病理を誘導することができます、その中枢神経系インチ

要約

ミスフォールドα-シヌクレインのプリオンのような挙動を研究するために、マウスモデルは、中枢神経系（CNS）内の神経病理を引き起こすα-シヌクレインprionoids、迅速かつ簡単な伝送を可能にする必要があります。プリオンタンパク質プロモーターからA53T変異を有するヒトα-シヌクレインを過剰発現し、ホタル由来のルシフェラーゼマウス、：ここでは、バイジェニックのTg（GFAP -Luc ^+/- M83 ^+/-）にα-シヌクレイン原線維のintraglossalまたは腹腔内注射を記述しますグリア線維性酸性タンパク質（GFAP）のプロモーターは、神経病理学的疾患を誘導するのに十分です。 8ヶ月の年齢で始まる深刻な神経症状を発症ホモ接合体のTg（M83 ^{+ / +）}マウスと比較して、ヘテロ接合のTg（M83 ^+/-：GFAP -luc ^+/-）、彼らが到達するまでの動物は、自発的な病気の自由なまま22ヶ月の年齢。興味深いことに、intraperitone介しα-シヌクレイン線維の注射229±17日の中央値はインキュベーション時間をマウス：アルルートは4 5のTg（GFAP -luc ^+/- M83 ^+/-）で麻痺と神経疾患を誘発しました。病気にかかった動物は自分の脳や脊髄にリン酸化αシヌクレインの深刻な沈着を示しました。 α-シヌクレインの蓄積は、サルコシル不溶性であり、ユビキチンおよびP62と共局在し、そして星状細胞グリオーシスおよび小膠細胞を生じる炎症応答を伴いました。驚くべきことに、舌へのα-シヌクレイン線維の接種285日後にα-シヌクレイン病理を示す5注射した動物の一方のみで疾患を引き起こすにはあまり効果的でした。マウス。：私達の調査結果は、intraglossal経路を介して接種し、より多くのように腹腔内経路では、Tgのシヌクレイノパチーの関連する顕著な特徴（GFAP -luc ^+/- M83 ^+/-）で神経学的な病気を誘発するのに適していることを示していますこれは、誘導プリオンなどの病因を研究するための新しいモデルを提供しますより詳細にα-シヌクレインprionoidsによってDは

概要

α-シヌクレインは、特に自己シードする能力で、プリオンタンパク質のものと類似しており、細胞間および神経経路に沿ったミスフォールディングを伝搬特性を有することが成長の証拠があります。 α-シヌクレインのこの特性はまた、「プリオン様」または「prionoid」と呼ばれ、罹患ニューロンから新たに移植され、健康なニューロン¹にミスフォールドα-シヌクレインの透過性を示唆している移植実験において観察によって支持され^{、2 、3、4。}また、脳または周囲、 例えば後肢筋肉または腸壁の遠位部分にα-シヌクレイン病理の広がりにおける結果に誤って折り畳まれたα-シヌクレインの直接注入CNS ^{5、6、7、<}SUPクラス= "外部参照"> ^{8、9、10。}我々は、より詳細には、末梢経路を介してα-シヌクレインprionoidsの伝送を分析し、ミスフォールドα-シヌクレインは、単一intraglossalまたは腹腔内注射後にCNSをneuroinvadeできるかどうかを疑問に対処し、以前にプリオンのためではなく、ミスフォールドアルファのために示された機能シヌクレイン。舌へのプリオンの注入後の、CNSの神経侵入は、脳幹¹¹に位置する舌下神経の核につながる舌の舌下神経に沿って伝播を介して達成されます。プリオンプロモーターからのヒトα-シヌクレインのA53T変異体を過剰発現マウス、及びホタルによってアストロサイトの活性化をモニターするために、GFAPプロモーターの制御下でルシフェラーゼ：マウスモデルとして、我々はTgが（GFAP -Luc ^+/- M83 ^+/-）を選択しました生物発光、以前の脳に示すように、プリオン感染マウス^12。我々の手ではバイジェニックTgは（M83 ^+/-：GFAP -luc ^+/-）他¹³で示されているようマウスは生後23ヶ月まで、疾患を発症しませんでした。 α-シヌクレインprionoidsという仮説を支持するマウス：脳及びTgは（GFAP -Luc ^+/- M83 ^+/-）の脊髄での病理と神経疾患を誘発しintraglossalまたは腹腔内経路を介してヒトα-シヌクレイン線維の単回注射プリオン¹⁴との重要な特徴を共有します。

プロトコル

動物を含めたすべての手順は、ノルトライン=ヴェストファーレン州国家環境庁（LANUV）の動物保護委員会の承認を得て行きました。動物を飼育し、12時間の明/暗サイクル、食物および水に自由にアクセスできる標準条件に従って世話しました。

1.動物モデル

1. マウス^15、16：ヘミ接合バイジェニックTgは（GFAP -Luc ^+/- M83 ^+/-）を生成するためにヘミ接合のTg（M83 ^+/-）マウスとの交雑ヘミ接合性Tgは（GFAP -Luc ^+/-）マウス。
2. トランスジーンエンコードヒトα-シヌクレインの存在およびホタルルシフェラーゼ¹²のための標準的な^PCR、17でリアルタイムPCRを用いて子孫を遺伝子型。
3. 6〜8週齢で動物を接種します。

2.接種材料の調製

1. MOを準備20mMのTris-HCl中150mMのNaClを含むトリス緩衝生理食塩水（TBS）緩衝液（pH 7.2）中にA53T変異を有するnomeric組換えヒトα-シヌクレイン以前^14に記載されているように。
2. 5日間800rpmで37℃でオービタルシェーカー中のモノマーの組換えヒトα-シヌクレインの3μg​​の/μLを攪拌することにより接種するための繊維状α-シヌクレインを調製します。
3. 腹腔内またはintraglossal接種のための2μg/μLのために1μg/μLの最終濃度に達するようにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中にフィブリルアセンブリを希釈します。
4. 氷上で1分（0.5秒毎のパルス間1秒のポーズと持続時間と50％に設定された振幅の40個のパルス）用ロッドソニケーターでα-シヌクレイン線維を断片。クロスシーディングによる汚染を避けるために。別の接種物を準備するためにクリーンな超音波処理プローブを使用してください。

3. Intraglossal注射

1. intrapeで動物を麻酔100mg / kgのケタミンおよび10mg / kgのキシラジンのritoneal注射。動物のつま先をつまんで、それが適切な麻酔を確保するために、その後肢を撤回しないことを確認してください。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、動物の目に獣医軟膏を使用してください。
2. 慎重に調査員の方を向いて頭と背臥位での加熱プレート上に粘着テープで麻酔し、動物を修正。
3. 超音波処理α-シヌクレイン原線維またはPBSの5μLと27 G使い捨て皮下注射器を充填します。
4. 動物の口が開いて保持するための鋸歯状の先端を有する1鈍い鼻の親指の鉗子を使用し、鉗子の第二の小さいペアは慎重に注入するための舌の下側にアクセスできるように舌を引き出します。
5. 舌下神経に近接した舌の右または左の下側に注射器の針を注入します。ゆっくりと5秒後に接種材料を注入。ゆっくり接種物ことを保証するために、5秒後に針を引っ込めます組織を貫通した針を後退しながら、失われることはありません。
6. その執着から動物を放し、完全に回復するまでに一定の監視の下で加熱プレート上でそれを残します。

4.腹腔内注射

1. 腹腔内注射のために、2リットル/分の流量及び2％に設定気化器を使用して、イソフルラン/酸素で吸入により麻酔チャンバー内ですぐに動物をnarcotize。動物のつま先をつまんで、それが適切な麻酔を確保するために、その後肢を撤回しないことを確認してください。
2. 超音波処理α-シヌクレイン原線維またはPBS50μlの27 G使い捨て皮下注射器を充填します。
3. 直接マウスの腹膜内に注入し、研究者から離れて面するヘッドと背面位置に動物を保持し、下方に約45°腹壁の背後に位置小腸もしくは盲腸を貫通避けます。彼らが回復するまで動物を監視麻酔から。

5.生物発光イメージング

1. 画像のTg（M83 ^+/-：GFAP -luc ^+/-）マウス生物発光イメージングシステムを用いて、2〜4週間ごと。
2. まもなく撮像2L / minの流量及び2％に設定気化器とイソフルラン/酸素チャンバ内でマウスを麻酔前。動物のつま先をつまんで、それが適切な麻酔を確保するために、その後肢を撤回しないことを確認してください。
3. 脱毛クリームでマウスの頭を剃るとdepilate。非特異的生物発光をブロックする非刺激性マーカーと黒に耳を着色。
4. 30mg / mLのストック溶液をPBS中のD-ルシフェリンカリウム塩、ルシフェラーゼの基質を希釈します。 -20°Cで1 mLのアリコートでこれを保管してください。溶解したD-ルシフェリンは、光への暴露から保護します。
5. 注射前に、動物を計量。 150 mg / kg体重の注入のためのD-ルシフェリンの正確な量を計算します。腹腔Dを注入-luciferinと麻酔室に動物を返します。
6. イメージングソフトウェアを起動します。撮像システムは、その動作温度に達した後、コントロールパネルの「初期化」ボタンをクリックすることによって、システムを初期化します。
7. ボタンの発光」と「写真」を選択します。 、60秒に露光時間を設定して「中」にビニング、F /ストップ「1」に、そして「オフ」にEMゲイン。
8. 励起フィルタを「開く」に「ブロック」と発光フィルタに設定されていることを確認し、1.50 cmの被写体の高さを設定します。
9. D-ルシフェリンの注射後10分で、撮像チャンバ内の加熱プレート上に動物を配置し、それらのグリグリが正しく麻酔出口に配置されていることを確認。吸入室からイソフルラン/酸素の流れを閉じ、0.25リットル/分の流量及び2％の蒸発と撮像チャンバのためのフローを開きます。撮像チャンバPRのドアを閉めますoperly。
10. 60秒を要する生物発光を測定するために「獲得」ボタンをクリックしてください。イソフルランの流れを停止し、彼らは完全に自分のケージに戻ってそれらを戻した後回復するまで動物を監視します。
11. 生物発光を定量化するためにイメージングソフトウェアを使用してください。 「ツールパレット」の中で「ROIツール」を選択します。 「ROIのツール」内の「タイプ」の下に「測定ROI」を選択します。
12. 「ROIのツール」内の「円」ツールをクリックし、プルダウンメニューから描画するROIの数を選択する - 理想的に「3」を3匹のマウスのために。
13. 画像では、各ROIを右クリックして「プロパティ」は1.25センチメートルに幅と高さを調整する下。定量化された脳の領域の上に、各ROIを置きます。
14. 画像の左上に、「放射（光子）」に単位パネルを設定します。
15. 「ツールパレット」の中で、選択し「画像調整」と最小値を調整し、0.20e6から1.00e6に例えば「カラースケール」の最大値。
16. 「ファイル」の下に「保存」を使用してデータを保存します。

6.生化学分析

1. 確立されたプロトコル^18、19による脳と脊髄を分離します。
2. 組織ホモジナイザーで6,000rpmで有する2回の30秒サイクルで（PBS中で1倍に希釈）、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤の存在下でPBSに別々に全脳および全脊髄サンプルを均質化します。脳および脊髄サンプルを20％（重量/体積）の最終濃度に均質化されていることを確認します。
3. 10秒の一定のパルスと50％に設定された振幅と氷上でそれらを維持しながら二回サンプルを超音波処理。
4. PBS中の1.5 M NaClで1：それらの1に希釈することによりPBSおよび750mMのNaCl中10％ホモジネートを調整します。
5. 細胞破片を分離するために、5分で1000×gでホモジネートを遠心4°C。次のステップのために上清を保持し、ペレットを捨てます。
6. 製造業者の指示に従ってビシンコニン酸（BCA）アッセイを用いてホモジネート中のタンパク質濃度を測定します。氷上で15分間、10％（重量/体積）の最終濃度でN-laurylsarcosyl脊髄ホモジネートからの脳ホモジネートからの総タンパク質の1.0ミリグラムまたは0.8ミリグラムをインキュベートします。
7. 蒸留水中の10％（wt / vol）の3mLのスクロースクッション上にホモジネートをオーバーレイし、4℃で1時間、465,000×gでそれらを超遠心。
8. 4％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、2％βメルカプトエタノール、192 mMグリシン、25 mMトリス、5％（重量/容量）のスクロースを含有する緩衝液中にペレットを再懸濁します。
9. 5分間、100℃でサンプルを沸騰およびモルホリンエタンスルホン酸（MES）緩衝液系中での電気泳動のためにSDSポリアクリルアミドゲル上にロードします。
10. SEMにおけるポリビニリデンジフルオリド（PVDF）膜に分離されたタンパク質を転送しますidryブロッティングシステム。
11. 膜と架橋タンパク質に35回転ロータに室温で30分間PBS中の0.4％（vol / vol）のホルマリン溶液中で膜をインキュベートします。
12. 室温で1時間、0.05％（体積/体積）のTween 20および5％（wt / vol）のミルクを含むTBS緩衝液中で膜をブロックします。
13. 4℃で一晩ブロッキング緩衝液中で一次抗体と共にブロットをインキュベートします。
14. TBS緩衝液中で膜を3回洗浄し、室温で1時間、TBS中のペルオキシダーゼまたは蛍光団コンジュゲート二次抗体でそれらをインキュベートします。
15. 確立されたプロトコール²⁰に従って化学発光又は蛍光によって結合した二次抗体を可視化します。

7.免疫蛍光分析

1. 組織処理ステーションでの解剖脳と脊髄を脱水し、パラフィンステーションを使用してパラフィンにそれらを埋め込みます。
2. パラフィン包埋TISをカット厚さ8μmの冠状切片でミクロトームで提訴し、スライドガラス上のセクションをマウントします。
3. 5〜10分間、二つの別々のキシロール浴でそれらをインキュベートすることにより組織切片を脱パラフィン化し、段階的エタノール浴のシリーズを介してそれらを再水和（100％、90％、70％、50％）、そして最後にH ₂ Oで
4. 室温で5分間、0.01 Mクエン酸緩衝液（pH6.0）で切片をインキュベートし、さらに電子レンジで10分間、それらを沸騰。
5. セクションでは、室温まで冷却し、内因性ペルオキシダーゼを阻害する30分間3％過酸化水素溶液でそれらをインキュベートしてみましょう。
6. 室温で1時間PBS中の20％（vol / vol）の正常ヤギ血清、1％（vol / vol）のウシ血清アルブミン（BSA）とのインキュベーションによって、組織切片をブロックし、そして0.5％のTriton X-100。
7. 4℃で一晩、1％に希釈した一次抗体（vol / vol）の正常ヤギ血清でセクションをインキュベートし、1％（体積/体積）BSA、PBS中の0.25％トリトンX-100。
8. PBSで一度0.25％（vol / vol）のPBS中のTriton X-100で二回セクションを洗浄し。
9. 室温で1時間、対応するフルオロフォア結合二次抗体と1％に希釈した核色素DAPI（vol / vol）の正常ヤギ血清、1％（体積/体積）BSA、PBSで切片を染色します。
10. 0.25％（容量/容量）のTriton X-100 PBSで一度PBSで2回洗浄した後、包埋媒体とスライドをカバースリップおよび共焦点レーザー走査顕微鏡で染色を可視化します。

結果

マウス（ 表1及び図1）：舌又はバイジェニックTgはCNS（GFAP -Luc ^+/- M83 ^+/-）で腹膜誘導される神経病理を介してα-シヌクレインprionoidsの周辺注射。 α-シヌクレイン線維を持つ単一の腹腔内注射した後、5匹のマウスの4つが229±17日の中央値はインキュベーション時間と神経疾患を発症しました。驚くべきことに、唯一の5匹?...

ディスカッション

Tgは（M83 ^+/-：GFAP -Luc ^+/-）の腹膜内へのα-シヌクレイン線維の末梢注射したマウスは、シヌクレイノパチーの重要な特性を再現するために、神経炎症を伴う神経疾患を誘発するための容易な方法を表します。同様に、舌の注射は、トランスジェニックマウスにおけるα-シヌクレインprionoidsによって神経侵入のための別のルートを表すが、あまり効率的です。私たちは、?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-actin antibody	Merck Millipore	MAB1501
anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [pSyn#64]	Wako	015-25191
anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [EP1536Y]	Abcam	ab51253
anti-GFAP antibody	Dako	Z0334 01
anti-IBA-1 antibody	Wako	019-19741
anti-Sequestosome-1 (p62) antibody	Proteintech	18420-1-AP
anti-ubiquitin antibody [Ubi-1]	Merck Millipore	MAB1510
Phosphate-buffered saline (PBS)	Invitrogen	14190169
Ketamine	Ratiopharm		100 mg/kg
Xylazine	Ratiopharm		10 mg/kg
27 G syringe	VWR	613-4900
Isoflurane	Piramal Healthcare	PZN  4831850
Depilatory cream	Veet
Secureline lab marker	Neolab	25040
D-luciferin potassium salt	Acris	LK10000	30 mg/mL stock solution
Thermomixer	Eppendorf	5776671
Sonopuls Mini20 sonicator	Bandelin	3648
IVIS Lumina II imaging system	PerkinElmer
Living Image 3.0 Software	PerkinElmer
Tg(M83+/-) mice or B6;C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J mice	The Jackson Laboratory	004479
Standard pattern forceps	Fine Science Tools	11000-16
Narrow pattern forceps	Fine Science Tools	11002-12
N-laurylasarcosyl	Sigma	L5125-100G
Optima Max-XP ultracentrifuge	Beckman Coulter		TLA-110 rotor
Thickwall polycarbonate tubes	Beckman Coulter	362305
NuPAG Novex 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels	Thermo Fisher Scientific	WG1401BOX
HRP conjugated antibody	Cayman	Cay10004301-1
IR Dye 680 conjugated antibody	LI-COR Biosciences	926-68070
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate	Thermo Fisher Scientific	34075
Stella 3200 imaging system	Raytest
Odyssey infrared imaging system	LI-COR Biosciences
Tween 20	MP Biomedicals	TWEEN201
Triton X-100	Sigma	SA/T8787
Immobilon-FL PVDF membrane	Merck Millipore	IPFL00010
Xylol	Sigma	Roth
Hydrogen peroxide	Sigma	SA/00216763/000500	working solution 3%
Bovine serum albumine (BSA)	Thermo Fisher Scientific	A3294-100G
Goat serum	Thermo Fisher Scientific	PCN5000
4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	D1306	working dilution 1:50,000
Fluoromount media	Omnilab	SA/F4680/000025
LSM700 confocal laser scanning microscope	Carl Zeiss
HALT protease and phosphatase inhibitors	Thermo Fisher Scientific	10516495
Precellys 24-Dual homogenizer	Peqlab	91-PCS24D
Alexa Fluor 488 conjugated antibody	Thermo Fisher Scientific	A31619
Alexa Fluor 594 conjugated antibody	Thermo Fisher Scientific	A11005
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	10741395
Microtome RM2255	Leica
LSM700 confocal laser scanning microscope	Carl Zeiss