Bioluminescence imagerie de la neuro-inflammation chez des souris transgéniques Après périphériques Ensemencement de l'alpha-synucléine Fibrilles

Résumé

Injection périphérique de fibrilles d'alpha-synucléine dans le péritoine ou de la langue de Tg ^(+/- M83: GFAP -Luc ^+/-) des souris qui expriment l' alpha-synucléine humaine avec la mutation A53T familiale et la luciférase de luciole, peut induire une neuropathologie, y compris la neuroinflammation , dans leur système nerveux central.

Résumé

Pour étudier le comportement de prion de l'alpha-synucléine mal repliées, les modèles de souris sont nécessaires qui permettent une transmission rapide et simple de prionoids alpha-synucléine, qui provoquent neuropathologie dans le système nerveux central (SNC). Nous décrivons ici que intraglossal ou injection intrapéritonéale de fibrilles de l' alpha-synucléine dans Tg bigéniques (M83 ^+/-: GFAP -Luc ^+/-) chez la souris, qui surexpriment l' alpha-synucléine humaine avec la mutation A53T à partir du promoteur de la protéine prion et de la luciférase de luciole le promoteur de la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP), est suffisante pour induire une maladie neuropathologique. Par rapport à Tg homozygote (M83 ^{+ / +)} de souris qui développent des symptômes neurologiques sévères commençant à l'âge de 8 mois, Tg hétérozygote ^(+/- M83: GFAP -Luc ^+/-) les animaux restent indemnes de la maladie spontanée jusqu'à ce qu'ils atteignent un âge de 22 mois. Fait intéressant, l'injection de fibrilles d'alpha-synucléine via le intraperitoneitinéraire al maladie neurologique induite par la paralysie dans quatre des cinq Tg ^(+/- M83: GFAP -Luc ^+/-) chez la souris avec un temps d'incubation médiane de 229 ± 17 jours. Les animaux malades ont montré des dépôts sévères de l'alpha-synucléine phosphorylée dans leur cerveau et la moelle épinière. L'accumulation d'alpha-synucléine ont été Sarkosyl insolubles et colocalisés avec l'ubiquitine et p62, et étaient accompagnées d'une réaction inflammatoire entraîne une gliose astrocytaire et microgliose. De manière surprenante, l'inoculation de fibrilles alpha-synucléine dans la langue était moins efficace dans la maladie avec seulement l'un des cinq animaux injectés présentant une pathologie alpha-synucléine après 285 jours. Nos résultats montrent que l' inoculation par voie intraglossal et plus encore par la voie intrapéritonéale convient pour induire une maladie neurologique avec caractéristiques pertinentes de synucléinopathies Tg ^(+/- M83: GFAP -Luc ^+/-) souris. Cela fournit un nouveau modèle pour l'étude de la pathogenèse comme prion induireD par prionoids alpha-synucléine plus en détail.

Introduction

Il existe des preuves de plus en plus que l'alpha-synucléine a des caractéristiques similaires à celles de la protéine prion, en particulier dans sa capacité à se ressème et se propagent entre les cellules et le mauvais repliement le long des voies neuronales. Cette propriété de l' alpha-synucléine est aussi appelée « prion » ou « prionoid », et est soutenu par des observations dans des expériences de transplantation, ce qui suggère la transmissibilité de l' alpha-synucléine mal repliées de neurones malades aux nouveaux neurones sains transplantés ^{1, 2 , 3, 4.} En outre l' injection directe d'alpha-synucléine dans le cerveau mal repliée ou de la périphérie, par exemple , le muscle du membre postérieur ou de la paroi intestinale, conduit à une propagation de la pathologie alpha-synucléine aux parties distales du système nerveux central ^{5, 6, 7, 8, 9, 10.} Nous avons analysé la transmission de prionoids alpha-synucléine, par des voies périphériques plus en détail et a abordé la question de savoir si l'alpha-synucléine peut neuroinvade misfolded le système nerveux central après une seule injection intrapéritonéale ou intraglossal, une fonction qui avait été montré précédemment pour prion mais pas pour misfolded alpha- synucléine. Après l' injection des prions dans la langue, neuroinvasion du système nerveux central est réalisée par propagation le long du nerf hypoglosse de la languette qui mène vers le noyau du nerf hypoglosse qui se trouve dans le tronc cérébral ^11. En tant que modèle de souris , nous avons choisi Tg ^(+/- M83: GFAP -Luc ^+/-) des souris qui surexpriment le mutant A53T d'alpha-synucléine humaine à partir du promoteur de prion, et la luciférase de luciole sous le contrôle d'un promoteur GFAP pour surveiller l' activation astrocytaire par bioluminescence, comme indiqué précédemment dans le cerveaudes souris infectées par le ^prion-12. Dans nos mains Tg bigéniques (M83 ^+/-: GFAP -Luc ^+/-) des souris n'a pas développé la maladie jusqu'à 23 mois comme cela a été démontré par d' autres ^13. Une seule injection de fibrilles d'alpha-synucléine de l' homme par voie intrapéritonéale ou intraglossal induite par une maladie neurologique avec la pathologie dans le cerveau et la moelle épinière des Tg ^(+/- M83: GFAP -Luc ^+/-) des souris soutenant l'hypothèse que prionoids alpha-synucléine importantes caractéristiques avec ¹⁴ prion.

Protocole

Toutes les procédures y compris les animaux ont été effectuées avec l'approbation du comité de protection des animaux de l'Agence de l'environnement du Nord-Westphalie État de Rhénanie (LANUV). Les animaux ont été logés et soignés en fonction des conditions standard avec une 12 h cycle lumière / obscurité et l'accès libre à la nourriture et de l'eau.

1. Modèle animal

1. Intercross Tg hémizygotes (GFAP -Luc de ^+/-) de souris hémizygotes avec Tg (M83 ^+/-) pour générer des souris Tg hémizygotes bigéniques (M83 ^+/-: GFAP -Luc ^+/-) chez la souris ^{15, 16.}
2. Génotype la descendance avec la PCR en temps réel pour la présence du transgène codant pour l' alpha-synucléine humaine et de PCR standard pour la luciférase de luciole ^{12, 17.}
3. Inoculer les animaux à l'âge de six à huit semaines.

2. Préparation Inoculum

1. préparer moalpha-synucléine humaine recombinante nomeric avec la mutation A53T dans du tampon du tampon Tris salin (TBS) contenant 150 mM de NaCl dans 20 mM Tris-HCl (pH 7,2) comme cela a été décrit précédemment ^14.
2. Préparer l'alpha-synucléine fibrillaire pour inoculations en agitant 3 ug / ul d'alpha-synucléine humaine recombinante monomère dans un agitateur orbital à 800 tpm et 37 ° C pendant 5 jours.
3. Diluer assemblages de fibrilles dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour atteindre une concentration finale de 1 pg / pl pour intraperitoneale ou 2 ug / ul pour inoculations intraglossal.
4. Fragmenter les fibrilles de l'alpha-synucléine avec un sonicateur à tige pendant 1 min (40 impulsions d'une durée de 0,5 avec une pause d'une seconde entre chaque impulsion et une amplitude réglée à 50%) sur de la glace. Pour éviter la contamination croisée par ensemencement. Utiliser des sondes de sonication propres pour préparer un inoculum différent.

3. Injections Intraglossal

1. Anesthésier les animaux avec un intrapeinjection ritoneal de 100 mg / kg de kétamine et 10 mg / kg de xylazine. Pincez l'orteil de l'animal et confirmer qu'il ne retire pas sa patte arrière pour assurer une anesthésie appropriée. Appliquer une pommade vétérinaire sur les yeux de l'animal pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
2. Fixer les animaux anesthésiés avec soin avec du ruban adhésif sur une plaque chauffante dans une position couchée dorsale avec leurs têtes tournées vers l'investigateur.
3. Remplir une 27 seringue hypodermique jetable G avec 5 ul de fibrilles d'alpha-synucléine ou soniquée PBS.
4. Utilisez une pince pouce-nez émoussé avec des pointes en dents de scie pour maintenir la bouche de l'animal ouvert, et une seconde plus petite paire de pinces pour tirer délicatement la langue pour faire la partie inférieure de la langue accessible pour l'injection.
5. Injecter l'aiguille de la seringue dans la partie inférieure droite ou gauche de la languette à proximité du nerf hypoglosse. Injecter lentement l'inoculum après 5 s. rétracter lentement l'aiguille après 5 s pour assurer que l'inoculuma pénétré dans le tissu et ne soit pas perdu pendant la rétraction de l'aiguille.
6. Libérer l'animal de ses fixations et laissez-le sur la plaque chauffante sous surveillance constante jusqu'à la récupération complète.

4. intrapéritonéale Injections

1. Pour les injections intraperitoneales, narcotiser les animaux peu de temps dans une chambre d'anesthésie par inhalation avec de l'isoflurane / oxygène en utilisant un débit de 2 L / min et le vaporisateur fixé à 2%. Pincez l'orteil de l'animal et confirmer qu'il ne retire pas sa patte arrière pour assurer une anesthésie appropriée.
2. Remplir une 27 seringue hypodermique jetable G avec 50 ul de fibrilles d'alpha-synucléine ou soniquée PBS.
3. Injecter directement dans le péritoine de la souris et éviter la pénétration de l'intestin grêle ou le caecum situé derrière la paroi abdominale en tenant l'animal dans une position dorsale avec la tête tournée à l'opposé de l'investigateur et vers le bas à environ 45 °. Surveiller les animaux jusqu'à ce qu'ils aient récupéréde l'anesthésie.

5. bioluminescence Imaging

1. Tg image (M83 ^+/-: GFAP -Luc ^+/-) chez la souris toutes les 2-4 semaines en utilisant un système d'imagerie par bioluminescence.
2. Avant imagerie peu anesthésier les souris dans une chambre isoflurane / oxygène avec un débit de 2 L / min et le vaporisateur fixé à 2%. Pincez l'orteil de l'animal et confirmer qu'il ne retire pas sa patte arrière pour assurer une anesthésie appropriée.
3. Rasez et épilé les têtes des souris avec une crème épilatoire. Colorer les oreilles en noir avec un marqueur non irritant pour bloquer non spécifique bioluminescence.
4. Diluer le sel de potassium de D-luciférine, le substrat de la luciférase, dans du PBS à une solution mère à 30 mg / mL. Conservez ce dans 1 ml aliquotes à -20 ° C. Protéger la D-luciférine dissous de l'exposition à la lumière.
5. Peser les animaux avant l'injection. Calculer le volume exact de D-luciférine pour l'injection de 150 mg / kg de poids corporel. Injecter par voie intraperitoneale D-luciferin et retourner l'animal à la chambre d'anesthésie.
6. Démarrez le logiciel d'imagerie. Après que le système de formation d'images a atteint sa température de fonctionnement initialiser le système en cliquant sur le bouton « Initialiser » dans le panneau de commande.
7. Sélectionnez les boutons de la luminescentes »et « Photo ». Réglez le temps d'exposition à 60 s, le binning à 'moyen', le F / Stop à '1', et le gain EM sur 'Off'.
8. Vérifiez que le filtre d'excitation est réglée sur « bloc » et le filtre d'émission pour « Open » et régler la hauteur de l'objet de 1,50 cm.
9. Dix minutes après l'injection de D-luciférine, placer les animaux sur la plaque de chauffage dans la chambre d'imagerie et de veiller à ce que leurs museaux sont correctement placés dans la sortie de l'anesthésie. Fermer la isoflurane / débit d'oxygène de la chambre d'inhalation et d'ouvrir l'écoulement de la chambre de formation d'image avec un débit de 0,25 L / min et une évaporation de 2%. Fermer la porte de la chambre d'imagerie properly.
10. Cliquez sur le bouton « Acquire » pour mesurer la bioluminescence, qui prend 60 s. Arrêter le flux de isoflurane et de surveiller les animaux jusqu'à ce qu'ils aient complètement récupéré après les retourner à leurs cages.
11. Utiliser le logiciel d'imagerie pour quantifier la bioluminescence. Au sein de la « palette d'outils » sélectionner « Outils de retour sur investissement ». Sous « Type » dans les « Outils de retour sur investissement », sélectionnez « ROI Mesure ».
12. Dans les « Outils de retour sur investissement » cliquez sur l'outil « cercle » et sélectionnez le nombre de régions d'intérêt à tirer dans le menu déroulant - idéalement « 3 » pour trois souris.
13. Dans l'image, cliquez droit sur chaque ROI et sous « Propriétés » ajuster la largeur et la hauteur à 1,25 cm. Placez chaque ROI sur la zone du cerveau qui est quantifié.
14. Dans le coin supérieur gauche de l'image, définir le panneau d'unités de « rayonnement (photons) ».
15. Au sein de la « palette d'outils », sélectionnez « Réglage de l'image » et régler le minimum etle maximum de la « échelle de couleur », par exemple, de 0.20e6 à 1.00e6.
16. Sous « Fichier » enregistrer les données avec « Save ».

6. Analyse Biochemical

1. Isoler le cerveau et la moelle épinière selon des protocoles établis ^{18, 19.}
2. Homogénéiser ensemble du cerveau et des échantillons de moelle épinière séparément dans du PBS en présence d'inhibiteurs de protease et de phosphatase (dilué dans du PBS à 1x) en deux cycles de 30 s à 6000 tours par minute dans un homogénéisateur de tissus. Assurez-vous que le cerveau et les échantillons de la moelle épinière sont homogénéisés à une concentration finale de 20% (poids / volume).
3. Soniquer les échantillons deux fois tout en les maintenant sur la glace avec une impulsion constante de 10 s et une amplitude réglée à 50%.
4. Ajuster les homogénats à 10% dans du PBS et 750 mM de NaCl par dilution 1: 1 avec du NaCl 1,5 M dans du PBS.
5. Pour séparer les débris cellulaires, centrifuger les broyats à 1000 g pendant 5 min à4 ° C. Gardez les surnageants pour les prochaines étapes et jeter les granulés.
6. Mesurer la concentration en protéine dans les homogénats utilisant le dosage de l'acide bicinchoninique (BCA) selon les instructions du fabricant. Incuber 1,0 mg de protéine totale à partir des homogénats de cerveau ou de 0,8 mg à partir d'homogénats de la moelle épinière dans le n-laurylsarcosyl à une concentration finale de 10% (poids / volume) pendant 15 min sur de la glace.
7. Superposer les homogénats sur un coussin de saccharose à 10% (poids / volume) de 3 ml dans de l'eau distillée et les ultracentrifugation à 465000 g pendant 1 h à 4 ° C.
8. Remettre en suspension les pastilles dans un tampon contenant 4% de dodécylsulfate de sodium (SDS), 2% β-mercaptoéthanol, 192 mM de glycine, 25 mM de Tris, et 5% (poids / volume) de saccharose.
9. Faire bouillir les échantillons à 100 ° C pendant 5 min et les charger sur des gels de SDS-polyacrylamide pour l'électrophorèse dans un système de tampon acide morpholineethanesulfonic (MES).
10. Transférer les protéines séparées vers des membranes de difluorure de polyvinylidène (PVDF) dans un MEBiDry système buvard.
11. Incuber les membranes dans 0,4% (vol / vol) une solution de formaline dans du PBS pendant 30 min à température ambiante sur un rotor à 35 tours par minute pour réticuler les protéines avec la membrane.
12. Bloquer les membranes dans du tampon TBS contenant 0,05% (vol / vol) de Tween 20 et 5% (poids / volume) de lait pendant 1 h à température ambiante.
13. Incuber les blots avec l'anticorps primaire dans du tampon de blocage pendant une nuit à 4 ° C.
14. Laver les membranes trois fois dans du tampon TBS et de les incuber avec des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase ou fluorophores dans du TBS pendant 1 h à température ambiante.
15. Visualiser les anticorps secondaires liés par chimioluminescence ou fluorescence selon des protocoles établis ^20.

7. Analyse de Immunofluorescence

1. Déshydrater les cerveaux disséqués et la moelle épinière dans une station de traitement des tissus et de les incorporer dans de la paraffine en utilisant une station de paraffine.
2. Couper le tis dans la paraffinepoursuit en justice avec un microtome à 8 um d'épaisseur des coupes coronales et monter les sections sur des lames de verre.
3. Déparaffiner les coupes de tissu par incubation dans deux bains de xylol séparés pendant 5 à 10 min et de les réhydrater à travers une série de bains d'éthanol à gradient (100%, 90%, 70%, 50%) et finalement avec H ₂ O.
4. Incuber les sections dans 0,01 M de tampon citrate (pH 6,0) pendant 5 min à température ambiante et les faire bouillir pendant 10 minutes de plus dans un four à micro-ondes.
5. Laissez les sections refroidir à la température ambiante et de les incuber avec une solution de peroxyde d'hydrogène à 3% pendant 30 min pour inhiber les peroxydases endogènes.
6. Bloquer les coupes de tissu par incubation avec 20% (vol / vol) de sérum de chèvre normal, 1% (vol / vol) de sérum-albumine bovine (BSA) et 0,5% de Triton X-100 dans du PBS pendant 1 h à température ambiante.
7. Incuber les sections avec l'anticorps primaire dilué dans 1% (vol / vol) de sérum de chèvre normal, 1% (vol / vol) de BSA et 0,25% de Triton X-100 dans du PBS pendant une nuit à 4 ° C.
8. Laver les sections deux fois avec 0,25% (vol / vol) de Triton X-100 dans du PBS et une fois avec du PBS.
9. Colorer les sections avec les anticorps secondaires fluorophores conjugués correspondants et le DAPI colorant nucléaire dilué dans 1% (vol / vol) de sérum de chèvre normal, 1% (vol / vol) de BSA et PBS pendant 1 h à température ambiante.
10. Après avoir lavé deux fois avec 0,25% (vol / vol) de Triton X-100 dans du PBS et une fois avec du PBS, les lames couvre-objet avec un support d'encastrement et de visualiser la coloration avec un microscope à balayage laser confocal.

Résultats

Injection périphérique de prionoids alpha-synucléine par la langue ou la neuropathologie péritoine induite dans le système nerveux central de Tg bigéniques (M83 ^+/-: GFAP -Luc ^+/-) chez la souris (Tableau 1 et Figure 1). Après une seule injection intraperitoneale avec des fibrilles d'alpha-synucléine, quatre des cinq souris ont développé une maladie neurologique avec un temps d'incubation médiane de 229 ?...

Discussion

Injection périphérique de fibrilles d'alpha-synucléine dans le péritoine de Tg ^(+/- M83: GFAP -Luc ^+/-) chez la souris représente une méthode facile pour induire une maladie neurologique accompagnée d' une neuroinflammation de récapituler caractéristiques importantes des synucléinopathies. De même, l'injection de la languette représente une autre voie pour la neuroinvasion par prionoids alpha-synucléine dans les souris transgéniques, mais est moins efficace. Nous ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-actin antibody	Merck Millipore	MAB1501
anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [pSyn#64]	Wako	015-25191
anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [EP1536Y]	Abcam	ab51253
anti-GFAP antibody	Dako	Z0334 01
anti-IBA-1 antibody	Wako	019-19741
anti-Sequestosome-1 (p62) antibody	Proteintech	18420-1-AP
anti-ubiquitin antibody [Ubi-1]	Merck Millipore	MAB1510
Phosphate-buffered saline (PBS)	Invitrogen	14190169
Ketamine	Ratiopharm		100 mg/kg
Xylazine	Ratiopharm		10 mg/kg
27 G syringe	VWR	613-4900
Isoflurane	Piramal Healthcare	PZN  4831850
Depilatory cream	Veet
Secureline lab marker	Neolab	25040
D-luciferin potassium salt	Acris	LK10000	30 mg/mL stock solution
Thermomixer	Eppendorf	5776671
Sonopuls Mini20 sonicator	Bandelin	3648
IVIS Lumina II imaging system	PerkinElmer
Living Image 3.0 Software	PerkinElmer
Tg(M83+/-) mice or B6;C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J mice	The Jackson Laboratory	004479
Standard pattern forceps	Fine Science Tools	11000-16
Narrow pattern forceps	Fine Science Tools	11002-12
N-laurylasarcosyl	Sigma	L5125-100G
Optima Max-XP ultracentrifuge	Beckman Coulter		TLA-110 rotor
Thickwall polycarbonate tubes	Beckman Coulter	362305
NuPAG Novex 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels	Thermo Fisher Scientific	WG1401BOX
HRP conjugated antibody	Cayman	Cay10004301-1
IR Dye 680 conjugated antibody	LI-COR Biosciences	926-68070
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate	Thermo Fisher Scientific	34075
Stella 3200 imaging system	Raytest
Odyssey infrared imaging system	LI-COR Biosciences
Tween 20	MP Biomedicals	TWEEN201
Triton X-100	Sigma	SA/T8787
Immobilon-FL PVDF membrane	Merck Millipore	IPFL00010
Xylol	Sigma	Roth
Hydrogen peroxide	Sigma	SA/00216763/000500	working solution 3%
Bovine serum albumine (BSA)	Thermo Fisher Scientific	A3294-100G
Goat serum	Thermo Fisher Scientific	PCN5000
4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	D1306	working dilution 1:50,000
Fluoromount media	Omnilab	SA/F4680/000025
LSM700 confocal laser scanning microscope	Carl Zeiss
HALT protease and phosphatase inhibitors	Thermo Fisher Scientific	10516495
Precellys 24-Dual homogenizer	Peqlab	91-PCS24D
Alexa Fluor 488 conjugated antibody	Thermo Fisher Scientific	A31619
Alexa Fluor 594 conjugated antibody	Thermo Fisher Scientific	A11005
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	10741395
Microtome RM2255	Leica
LSM700 confocal laser scanning microscope	Carl Zeiss