适用于下一代测序的植物细菌DNA富集方法的优化与比较分析

摘要

提出了两种植物细菌DNA富集方法的比较和优化:传统差速离心和基于甲基化状态的总gDNA分馏。我们评估产生的DNA数量和质量，证明在短读下一代测序中的性能，并讨论长读单分子测序中使用的潜力。

摘要

植物细胞器基因组包含大的重复元件，其可能经历配对或重组以形成复合结构和/或亚基因组片段。细胞器基因组也存在于给定细胞或组织类型（异质性）内的混合物中，并且丰富的亚型可能在整个发育过程中或当处于应力（亚化学计量转移）时）发生变化。需要下一代测序（NGS）技术来更深入地了解细胞器基因组结构和功能。传统的测序研究使用几种方法来获得细胞器DNA:（1）如果使用大量的起始组织，将其均质化并进行差速离心和/或梯度纯化。 （2）如果使用较少量的组织（ 即如果种子，材料或空间有限），则按照（1）所述进行相同的处理，然后进行全基因组扩增以获得足够的DNA。 （3）生物信息学分析可用于分析使用总基因组DNA并解析出细胞器读数。所有这些方法都有固有的挑战和权衡。在（1）中，可能难以获得如此大量的起始组织;在（2）中，全基因组扩增可能引入测序偏倚;在（3）中，核和细胞器基因组之间的同源性可能会干扰组装和分析。在具有大核基因组的植物中，富集细菌DNA以降低生物信息学分析的测序成本和序列复杂度是有利的。在这里，我们将传统的差速离心法与第四种方法（适应性CpG-甲基下拉法）进行比较，将总基因组DNA分离成核和细胞器级分。两种方法为NGS产生足够的DNA，对于细胞器序列高度富集的DNA，尽管在线粒体和叶绿体中具有不同的比例。我们介绍了这些方法对小麦叶组织的优化，并讨论了主要优点和d在样本输入，协议易用性和下游应用的上下文中的每种方法的优点。

引言

基因组测序是解析重要植物性状的潜在遗传基础的有力工具。大多数基因组测序研究集中于核基因组内容，因为大多数基因位于细胞核中。然而，细胞器基因组，包括线粒体（跨真核生物）和质（植物;在特殊形式，叶绿体，工作在光合作用）促进生物发育，应激反应和整体健康至关重要的¹显著的遗传信息。细胞器基因组通常包括在用于核基因组测序的总DNA的提取，虽然方法，以减少前，DNA提取的细胞器号码也采用^2。许多研究已经使用测序结果从总的gDNA提取组装细胞器基因组^3，4，5，外部参照"> ^6,7。然而，当研究的目标是把重点放在细胞器基因组，使用总的gDNA增加了测序成本，因为很多的读取，但‘丢失’的核的DNA序列，特别是在植物具有大核基因组此外，由于重复和传输细胞器序列的进核基因组和细胞器之间，解决测序的正确的映射位置读取到适当的基因组是生物信息学有挑战性^2,8。细胞器基因组的从核基因组的纯化是一个减少这些问题的策略，进一步的生物信息学策略可用于分离映射到线粒体和叶绿体之间同源区域的读数。

虽然来自许多植物物种的细胞器基因组已被测序，但是对于细胞器基因组多样性的广度几乎不了解可用于野生种群或栽培育种池。还知道细胞器基因组是由于重复序列⁹之间的重组而经历显着的结构重排的动态分子。此外，每个细胞器中含有多个拷贝的细胞器基因组，并且每个细胞内都含有多个细胞器。并非所有这些基因组的拷贝都是相同的，这被称为异质性。与"主圈"的规范图相比，现在越来越多的证据表明，细胞基因组结构更复杂，包括亚基因组圆，线性染色体，线性连接子和支链结构¹⁰ 。植物细胞器基因组的组装由于其相对较大的尺寸和大量的反向和直接重复而进一步复杂化。

用于细胞器分离，DNA纯化和随后基因组的传统方案 È测序往往笨重且需要大体积的组织输入的，具有几克到几百个向上必要为起点^{11，12，13，14，15，16，17}克幼叶组织的组成。当组织受限时，这使得细胞器基因组测序不可及。在某些情况下，种子数量有限，例如当需要在代际基础上进行序列或在必须通过杂交维持的雄性不育系中时。在这些情况下，可以纯化细胞器DNA，然后进行全基因组扩增。然而，全基因组扩增可以引入显着的测序偏差，这在评估结构变异，亚基因组结构和异质性水平时是一个特别的问题> 18。用于短读序列技术的图书馆准备工作的最新进展克服了低输入障碍，以避免全基因组扩增。例如，Illumina Nextera XT库制备试剂盒允许使用少至1ng的DNA作为输入¹⁹ 。然而，用于长读取测序应用（如PacBio或Oxford Nanopore测序技术）的标准库制备仍然需要相对较高量的输入DNA，这可能对组织基因组测序构成挑战。最近，新的用户制作，长读测序的协议已被开发，以减少输入量和帮助促进在获得的DNA微克，批量样品的基因组测序是困难的^20，21。然而，获得高分子量纯的细胞器级分以进入这些文库制剂仍是一个挑战。

我们寻求o比较和优化不需要全基因组扩增的适用于NGS的细胞器DNA富集和分离方法。具体来说，我们的目标是确定从有限起始材料（如叶子子样品）中丰富高分子量细胞器DNA的最佳实践。这项工作提供了丰富细胞DNA的方法的比较分析:（1）修改的传统差速离心方案与（2）基于使用市售DNA CpG-甲基结合结构域蛋白质下拉法的DNA分级方案²²施用于植物组织²³ 。我们建议从小麦叶组织中分离细胞叶DNA的最佳实践，这可能容易地扩展到其他植物和组织类型。

研究方案

1.生成用于细胞分离和DNA提取的植物材料

1. 小麦幼苗的标准生长
   1. 在每个角落有4-6个种子的小方形花盆中种植蛭石。转移到温室或生长室，16小时光周期，23ºC/ 18ºC夜间。
   2. 每天浇灌植物。在萌发和发芽后7天，用¼茶匙颗粒状20-20-20 NPK肥料施肥。
2. 小麦幼苗的替代品种
   1. 按照步骤1.1，但将盆置于暗生长室中，23℃16小时/ 18℃8小时。或者，覆盖温室中的植物（ 例如，使用储存容器;但必须保持适当的通风）。
3. 生长和组织收集
   1. 种植植物12-14天。对于大多数小麦基因型s，75-100个幼苗产生约10-12g的组织，这对于使用差速离心法的两种细胞器提取是足够的（第2节）;如果利用基于DNA CpG-甲基化的下拉方法从核DNA中分离细胞器，则仅需要一种植物（第3节）。
   2. 如果使用差速离心法，请将新鲜的组织收集，并立即进行处理样品，如第2节所述。
   3. 如果利用CpG甲基下拉法，将20毫克的年轻叶组织切片收集到微量离心管中（使用标准培养的或蚀刻的组织，见代表性的结果 ）。在液氮上快速冷冻并在-80℃下冷冻直至使用。按照第3节所述进行DNA的下拉分离。

2.方法1:使用差速离心（DC）的DNA提取

注意:erential离心方案从该优化条件来隔离两个细胞器但富集线粒体^17,24两个发布修改。所得到的方案比以前的方法更少时间密集，使用更少的有毒化学品。具体来说，我们对缓冲液和洗涤步骤进行了修改，包括向STE提取缓冲液中加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP），并消除了含有氟化钠（NaF）的NETF缓冲液中的最终洗涤步骤。

注意:STE缓冲液的制备和使用应在化学通风橱下进行，并配有适当的个人防护设备，因为该缓冲液含有2-巯基乙醇（BME）。

1. 开始之前要做的事情
   1. 确保所有设备都非常干净，并对任何可以进行高压灭菌的设备（ 例如，研磨气瓶，高速离心机）进行高压灭菌护眼管等 ）。
      注意:推荐使用过滤嘴，适用于所有需要移液的步骤，以避免交叉污染。
   2. 查看所需设备和试剂的清单，并准备方法＃1（ 表1 ）所需的缓冲液和工作库存。将低温研磨块冷却至-20℃，转子和缓冲液至4℃，将微量离心机置于4℃，然后打开37℃水浴。
2. 细胞器的分离
   1. 收获5克新鲜的纸巾，并在冰冷的无菌水中，在冰上的冷冻烧杯中冲洗。
      注意:在进行离心机，通风橱等的所有操作和运输过程中，始终将样品保持在冰上。或者，如果有足够的空间和设备来执行协议，则可以在冷藏室工作。
   2. 使用剪刀将叶组织切成约1厘米的片，直接装入含有两个陶瓷研磨的50mL管中缸。
      注意:清洁或更换样品之间的剪刀，以避免交叉污染。
   3. 如果没有组织匀浆器，请使用砂浆和杵，然后按照替代步骤2.2.4 - 2.2.9。
      1. 将叶组织切成冰块中的预冷砂浆。在15 mL STE（通风柜）中研磨样品2 - 3 min。
      2. 将缓冲液（留在研钵中的组织）通过一个含有一层预湿无菌滤布（约22至25μm孔径的漏斗）的漏斗倒入另一个50mL管中。向研钵和杵中加入另外10mL的STE，再次匀浆。
      3. 将匀浆的组织和缓冲液倒入同一漏斗。用10mL STE冲洗研钵和杵，倒入漏斗中。将滤布挤压并拧入漏斗，以尽可能多地回收液体。
         注意:在样品之间更换手套以避免交叉污染。继续亲在步骤2.2.10。
   4. 在每个50mL管中加入20mL STE（在通风橱中）。
   5. 将样品放入组织研磨设备中的预冷冻低温研磨块中，并以1,750rpm研磨样品2×30秒。旋转样品位置，将样品放在冰上约1分钟之间。
      注意:在此步骤中可以使用砂浆和研杵，搅拌机或其他组织研磨/均质装置。然而，每种方法都会对不同程度的DNA质量产生影响，因此在继续下游应用前应对DNA长度和质量进行评估。
   6. 将漏斗插入放置在冰中的干净的50mL管。将一层滤布放入漏斗中，并用5 mL STE进行预湿。不要丢弃流通。
   7. 将匀浆的组织倒入漏斗。用15 mL STE冲洗研磨管，重新整理并翻转管子以冲洗墙壁和盖子，并倒入机体埃尔。
   8. 仔细取出陶瓷石头，然后将滤布挤压并拧入漏斗。
      注意:在样品之间更换手套以避免交叉污染。
   9. 用石蜡膜包裹管帽以避免溢出。在4℃下以2,000×g离心10分钟。
   10. 使用血清移液管小心地吸出上清液（避免干扰沉淀），并将其置于50mL高速离心管中（如果管没有紧密的密封垫圈，用石蜡膜包裹管帽以避免溢出）。丢弃颗粒
   11. 使用STET将管平衡至0.1g，并将得到的上清液以18,000xg和4℃离心20分钟。为了平衡管，将一小杯冰块放在天平上，称重秤，并在冰上称重样品以保持冷。或者，在冷藏室使用天平和通风橱。
   12. 丢弃上清液。将1mL的ST加入沉淀中并轻轻重新悬浮一个软的画笔。加入24 mL ST（最终体积为25 mL），混匀/旋转（ 即按下管子侧的油漆刷除去所有液体）。
   13. 使用ST将管平衡至0.1g以内。以18,000 xg和4℃离心20分钟。同时，准备DNaseI溶液（ 参见表1的库存和工作溶液配方）。对于每个样品，将一个200μL等分试样置于1.5 mL管中。
   14. 丢弃上清液，吸干管，并使用柔软的画笔将沉淀物（仍然在高速离心管中）重新悬浮在300μL的ST中。将画笔放在预先制备的含有200μLDNA酶溶液的1.5mL管中，并旋转刷子以除去卡在刷子中的残留丸粒。将DNaseI溶液吸入高速离心管中，轻轻旋转混匀。
   15. 在水浴中在37℃下孵育30分钟（在管的顶部包裹石蜡膜以防止冷凝泄漏g进入帽子）。在孵育过程中轻轻搅拌2次。
   16. 使用具有宽孔口的移液管尖端将小球混合物轻轻移出管内，并将其置于1.5 mL低粘合管中。向高速离心管中加入500μL400 mM EDTA，pH 8.0，轻轻吸管，将所有剩余的颗粒从管中取出。将EDTA转移到与沉淀混合物相同的1.5-mL低粘合管，并通过反转轻轻混合。
   17. 在4℃下以18,000xg离心20分钟。丢弃上清液，吸管，并立即使用DNA分离。如果需要，在-20℃冷冻丸粒，但这可能导致产量降低，因为如果不立即处理，残留的DNA酶I可能降解样品DNA。
3. 使用商业色谱柱方法从分离的细胞器中提取DNA
   注意:有关完整协议²⁵ ，请参阅套件手册，有关修改，请参见下文。镨优选直接从细胞器分离到DNA提取。反复冷冻和解冻将减少DNA片段大小，并导致残留DNA酶I的DNA降解。限制涡旋或剧烈移液，因为它可以剪切DNA。建议使用低结合微量离心管，以最大限度地提高DNA的回收率。
   1. DNA提取程序
      注意:在开始之前，请阅读详细的商业协议²⁵ ，以确保缓冲区已正确生成/存储，并且了解自旋柱程序。
      1. 将缓冲液ATL直接加入到管中，加入沉淀（如果先前冷冻并在台式平台上平衡至室温）。
      2. 在试剂盒手册中的"组织DNA纯化"方案中的步骤3进行，具有以下修改:步骤3中30分钟裂解包括任选的RNA酶A消化，并在3×200μLAE中洗脱每一个成为一个然后组合洗脱液）。
      3. 保存qPCR的等分试样（至少20μL）（参见步骤4.1）。在浓缩前进行定量，另外还需要1μL进行高灵敏度定量。
      4. 如果需要，进行样品浓度。
4. 采用商用过滤器的样品浓度
   注意:有关详细信息，请参阅商业协议²⁶ 。根据下游用途，可能无需进行样品浓度（ 例如，对于终点PCR和qPCR应用）。然而，对于NGS图书馆建设，可能需要浓缩DNA提取后获得的稀释的细胞器DNA。
   1. 浓缩柱程序
      1. 在数字分析天平上的干净的称重纸张上仔细预先称重（ 见表2 ）空滤芯（无管）。记录重量。
      2. 皮将组合洗液转移到过滤器单元中，并重新称重。
         注意:商业手册²⁶说，过滤器最大体积为500μL，但是一次即可添加高达575μL，无溢出。
      3. 小心地将填充的过滤器单元放入管中（随柱提供）。以500 xg离心达到所需时间，达到所需浓缩液体积。对于约575μL的样品体积，20分钟的旋转通常会导致浓缩液体积为15 - 30μL。
      4. 从管中取出过滤器，重新称重。使用表格确定是否已经达到所需的浓缩物体积。如果没有，再次以500 xg的速度离心一段较短的时间并再次称重;重复直到达到所需的浓缩体积。
      5. 将新管（随柱提供）放在过滤器单元的顶部并进行反转。以1,000 xg离心3分钟，以转移浓缩至管。
      6. 确定回收的体积。由于过滤器保留，这通常比计算的体积小约3-5微升。如果过度浓缩，用无菌水或TE稀释以达到所需体积。
      7. 使用高灵敏度定量（根据制造商的说明书）量化DNA。

3.方法2:甲基分馏（MF）从总基因组DNA中丰富细胞DNA的方法

注意:该协议是从用户开发的Genomic Tip Kit DNA提取方案修改植物和真菌²⁷以及商业的Microbiome DNA Enrichment Kit方案²⁸ 。在理论上，可以使用产生高分子量DNA的任何DNA分离方案进行下拉。对于短读序列，产生主要> 15 kb片段的任何提取都足以用于下拉。对于洛ng读取测序，较大的片段可能是期望的。因此，我们优化了该方案以产生高分子量DNA。

1. 总DNA的分离
   注意:请参阅所需的设备和试剂清单，并准备方法＃2所需的缓冲液和工作库存（ 表1 ）。向裂解缓冲液中加入裂解酶以制备裂解缓冲液工作溶液。打开热敏混合器并将其设置为37°C。将水浴打开至50°C，并将QF缓冲液放入浴中。将70％EtOH放入冷冻器中，并将微量离心机置于4℃。
   1. 使用商业DNA提取柱进行总DNA提取
      注意:在开始之前，请阅读商业手册²⁹了解有关使用重力流阴离子交换柱的详细信息。柱可以使用专门的机架设置，或者使用提供的塑料环放置在管上。所有步骤，包括g应该通过重力流动来允许肠系统提示，残留液体不应该被强制通过。
      1. 使用专为2 mL管设计的手持式研杵，在2 mL低粘合管中研磨20 mg液氮中的冷冻组织。
      2. 加入2 mL裂解缓冲液工作溶液（管将非常满）。
      3. 在37℃的温热混合器中孵育1小时，同时以300rpm的温和搅拌。如果不能使用热混合器，则每隔15分钟通过温和的轻拂孵育，并加热混合是一种合适的选择。
      4. 加入4μLRNA酶A（100 mg / mL，终浓度200μg/ mL）。在37℃下，在温热混合器中反复混合并孵育30分钟，在300rpm下轻轻搅拌。
      5. 加入80μL蛋白酶K（20mg / mL，终浓度0.8mg / mL），反转混合，并在50℃下在温热混合器中孵育2小时，在300rpm下轻轻搅拌。
      6. 在4℃和1℃离心20分钟5,000 xg，以沉淀不溶性碎屑。
      7. 当样品离心时，用1 mL缓冲液QBT平衡色谱柱，并通过重力流将色谱柱排空。
      8. 使用大孔移液管尖端将样品（避免沉淀）迅速施加到平衡的柱上，并使其完全流过柱。如果样品变得多云，请在应用于色谱柱之前再次过滤或离心（详见商业手册²⁹ ）。
      9. 样品完全进入树脂后，用4 x 1 mL Buffer QC洗涤柱。
      10. 将柱悬挂在干净的2 mL低结合微量离心管上。用0.8 mL预热温度为50°C的缓冲液QF洗脱基因组DNA。
      11. 通过向洗脱的DNA中加入0.56mL（0.7体积的洗脱缓冲液）的室温异丙醇来沉淀DNA。
      12. 通过倒置（10X）混合，并在15,000 xg和4℃下立即离心20分钟。关心充分去除上清液，不会干扰玻璃状，松散附着的颗粒。
      13. 用1 mL冷的70％乙醇洗涤离心的DNA沉淀。在15,000 xg和4℃下离心10分钟。
      14. 仔细清除上清液（同样要谨慎），而不会干扰沉淀。空气干燥5-10分钟，并将DNA重悬于0.1mL洗脱缓冲液（EB）中。在室温下将DNA溶解过夜。避免移液，这可能剪切DNA。
      15. 使用高灵敏度DNA定量测定（根据制造商说明书）量化样品。
2. 甲基化和非甲基化DNA的基于珠的分馏
   注意:最近的出版物证明了使用市售的试剂盒²⁸ ，其利用使用与人IgG Fc片段（MBD2-Fc蛋白）融合的CpG特异性甲基结合结构域蛋白的下拉方法来分级从核基因组（高甲基化）含量的植物细胞器基因组（未甲基化） ²³ 。以前没有使用这种商业MF试剂盒²⁸测试小麦样品的分馏效率。
   1. 开始之前要做的事情
      1. 新鲜制备80％乙醇（每次反应至少800μL）。设置5x结合/洗涤缓冲液在冰上解冻，并为每个样品（稀释5X缓冲液，无菌，无核酸酶水）准备5 mL 1x缓冲液，并在方案中保持在冰上。
   2. 制备MBD2-Fc蛋白结合磁珠
      1. 准备所需数量的珠套。缩放反应，使用1到2μg的总输入DNA，需要160 - 320μL的珠子。请注意，以下列出的反应用于1μg总输入DNA，因此需要160μL珠粒。根据需要量化反应。
      2. 使用宽孔提示，轻轻吸取蛋白A磁性Bead浆料上下形成均匀的悬浮液。作为替代方案，在4℃下轻轻旋转珠子管15分钟。
         注意:不要涡旋珠。
      3. 按照制造商的说明进行操作²⁸ 。
   3. 捕获甲基化核DNA
      1. 对于每个单独的样品，将1μg输入DNA加入到含有160μLMBD2-Fc结合的磁珠的管中。
      2. 加入5x结合/洗涤缓冲液，给定DNA输入样品的体积，最终浓度为1x（体积为5x的结合/洗涤缓冲液以加入（μL）=输入DNA的体积（μL）/ 4）。将样品上下移动几次，使用宽孔移液器吸头进行混合。
      3. 将管在室温下旋转15分钟。用大口径移液管尖端轻轻吸取样品，并在整个孵化过程中轻拍2-3次，以防止珠粒团聚。
         注意:移液和flicking对于确保甲基化DNA的有效下拉是至关重要的。
   4. 收集富集的，未甲基化的细胞器DNA
      1. 简单旋转含有DNA和MBD2-Fc结合的磁珠混合物的管。将管放置在磁性架上至少5分钟以将珠收集到管侧。解决方案应该清楚。
      2. 使用大口径提示，小心地清除清除的上清液，而不打扰珠子。将上清液（含有未甲基化的富含细胞的DNA）转移到干净，低结合的2 mL微量离心管中。将此样品储存在-20或-80°C，或直接进入步骤3.2.6进行纯化。
   5. 洗脱液从MBD2-Fc结合的磁珠中捕获核DNA
      1. 如果还需要核级分，按照制造商说明书²⁸从MBD2-Fc结合的磁珠中洗脱核DNA;如步骤3.2.7所述进行纯化。
   6. 基于珠的核酸纯化
      1. 确保净化珠在室温下充分混合。按照MF套件手册^28中的说明继续执行协议。
         注意:该样本现在可用于NGS库构建或另一个下游分析。

4.样品定量和质量控制

1. qPCR测定以评估细胞器富集
   注意:此处列出的qPCR反应和测定参数设计用于Roche LightCycler 480，可能需要针对不同的设备和试剂进行调整。如果qPCR不可用，则使用本文所述的相同引物和条件，可以使用琼脂糖凝胶上的端点PCR和可视化作为样品纯度的定性测量。所有引物组的扩增子大小将为〜150 bp。引物序列见表3ces和配对。
   1. qPCR反应设置
      1. 要建立一个单独的20μLqPCR反应，请小心地将以下物质移至96孔qPCR板的一个孔中:10μL2x SYBR Green I Master; 2μL10μM正向和反向引物混合物（最终浓度为0.5μM）; 2μL模板（标准曲线范围内）;和6μL无菌，无核酸酶的H ₂ O.为了减少移液误差，优选与除模板之外的所有反应组分一起制备主混合物。将主混合物添加到qPCR板中，然后将感兴趣的模板添加到每个孔中。应对每个样品进行三次技术重复，以尽量减少移液误差的影响。
         注意:最终，样品之间比较核与细胞定量循环的比例，因此浓度的微小差异是可以接受的。然而，DNA浓度应大致在ea的范围内ch其他。
      2. 用高质量的qPCR密封膜密封板。轻轻旋转样品，注意避免产生任何气泡。在4℃下将板短暂旋转2分钟以收集样品并消除任何小的气泡。
      3. 将板装入机器。按照下列准则运行qPCR程序。
   2. qPCR反应参数
      注意:这些是默认参数，除了放大级的退火循环。调整此设置以适应特定的引物，如果使用的不同于本协议中引用的引物。
      1. 在95℃预孵育5分钟，升温速率为4.4℃/ s。
      2. 进行（1）95℃10秒的45个放大循环，斜率为4.4℃/ s; （2）60℃20s，升温速率为2.2℃/ s;和（3）72℃10秒，斜坡率为4.4℃/ s（在（3）期间获得的数据）。
      3. 使用optio正常熔融曲线循环95°C 5 s，斜坡速率为4.4°C / s; 65℃1分钟，升温速率为2.2℃/ s;和97°C，具有连续采集模式。
      4. 使用40°C的冷却循环30 s，斜率为1.5°C / s。
   3. 测定参数
      1. 选择SYBR模板。检查实验按钮中的程序参数。一旦装载板，可以开始测定，并且可以在测定运行时调整设置。
      2. 使用示例编辑器分配样本。选择Abs Quant作为工作流，并将样品指定为未知，标准或阴性对照。指定复制并填写每个重复的第一个的样本名称。添加浓度和单位到标准。
      3. 设置子集进行分析;这些在子集编辑器中分配。
      4. 要进行分析，请从"创建新分析"列表中选择Abs Quant / 2nd Derivative Max。导入外部保存的标准曲线（如果适用），然后按计算;该报告将包含所选信息。
      5. 要进行准确的绝对定量以确定拷贝数或浓度，请使用代表被检样品的标准曲线（ 例如，从上述方法分离的细菌DNA）。由于准备标准曲线所需的线粒体DNA的量太高，无法用合理数量的组织达到，所以不要使用软件提供的拷贝数计算，而是检查交叉点（Cp）值以确定相对浓度的细胞器与样品中的核DNA相比。将这些相对量与总基因组DNA相比较（见代表性结果 ）。测试来自完全光生长的两周龄小麦幼苗的总基因组DNA的5×10稀释的引物效率（代表性效率报告在th图2的传说）。
2. 脉冲场凝胶电泳（PFGE）
   注意:该协议基于制造商的指导方针，以执行PFGE来解决高分子量DNA。见材料表。
   1. 准备凝胶和样品
      1. 遵循凝胶和样品制备准则，并适应可用的系统。
   2. 运行参数
      1. 按照设置电泳系统的指导原则，使用以下参数:初始切换时间为2秒，最终切换时间为13秒，运行时间为15小时，16分钟，V / cm为6，夹角为120度。
   3. 污渍和成像凝胶
      1. 用选择的染料（ 例如溴化乙锭或合适的替代品）染色凝胶，并使用合适的凝胶文件系统进行成像。
4. 根据制造商的说明书，使用1ng DNA作为DNA Library Prep Kit的输入。
5. 条码并汇总样品进行排序，一次运行。按照制造商的指导进行排序。
   注意:可以根据感兴趣的种类，期望的覆盖水平和用于对文库进行排序的平台来更改池和排序参数。例如，HiSeq通道具有比MiSeq通道更多的输出，因此可以复用更多的样本。序列较小的样本子集，以确定细胞器基因组的覆盖水平是否足以用于下游分析。
6. 使用FastQC ³¹检查读取质量，以确定数据所需的修剪和过滤的程度。
7. 使用Trimmomatic ³²或另一个可比较的程序修剪和过滤原始读取。使用以下设置:ILLUMINACLIP 2:30:10（删除适配器），LEADING 3，TRAILING 3，SLIDINGWINDOW 4:10和MINLEN 100。
8. 映射质量过滤并适配器修剪配对末端（PE）读取到中国春线粒体（NCBI参考序列NC_007579.1 ^33），叶绿体（NCBI参考序列NC_002762.1 ^34），以及使用³⁶ Bowtie2核^35个参考基因组，具有以下设置:-I 0 -X 800 - 敏感。
9. 将sam对齐文件转换为bam格式（samtools）并对bam文件进行排序。使用bam文件来计算基因组范围的覆盖率和床单的覆盖面积。用R绘图功能可视化结果。

结果

本手册中提出的方案描述了从植物组织中丰富细胞器DNA的两种不同的方法。这里提出的条件反映了小麦组织的优化。 图1中描述了协议，组织输入和DNA输出中的关键步骤的比较。我们测试的DC协议的步骤遵循与先前描述的相似的条件（ 图1A ）。收获的组织必须新鲜处理，并进行差速离心和/或梯度以分离完整的细胞器。在细胞器?...

讨论

迄今为止，大多数细胞器测序研究集中于传统的DC方法，以丰富特定的DNA。已经描述了从不同植物中分离细胞器的方法，包括苔藓⁴⁰ ;单子叶植物如小麦¹⁵和燕麦¹¹ ;和双子叶植物如拟南芥¹¹ ，向日葵¹⁷和油菜籽¹⁴ 。大多数协议集中在叶组织

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol (beta-mercaptoethanol; BME)	Sigma Aldrich	M3148-100ml
2-propanol (Isopropyl alcohol/isopropanol), bioreagent	Sigma Aldrich	I9516
agarose, Bio-Rad Cetified Megabase agarose	Bio-Rad	1613108
analytical balance	Mettler Toledo	AB54-S
balance	Mettler Toledo	PB1502-S
bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich	B4287-25G
Ceramic grinding cylinders, 3/8in x 7/8in	SPEX SamplePrep	2183
Cryogenic Blocks compatible with tissue homogenizer for holding 50 mL tubes	SPEX SamplePrep	2664
DNaseI	Sigma	DN25
ethanol, absolute	Decon Laboratories	2716
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), 0.5 M Solution, pH 8.0	Fisher	BP2482-500
gel imaging system
gel stain			Such as GelRed or Ethidium Bromide
grinding pestle, wide tip for 2 mL conical tubes
Guanidine-HCl, 8 M solution	ThermoFisher	24115
LightCycler 480 SYBR Green I Master	Roche	4707516001
liquid nitrogen
Lysing enzymes from Trichoderma harzianum	Sigma	L1412
Magnesium Chloride	G Bioscience	24115
magnetic rack	ThermoFisher	A13346
microcentrifuge tubes, LoBind 1.5 mL	Eppendorf	22431021
microcentrifuge tubes, standard nuclease-free 1.5 mL	Eppendorf
microcentrifuge, refrigerated	Sorvall	Legend X1R	Or equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotors for 50 mL tubes, Oak Ridge tubes, and 1.5 mL tubes
microcentrifuge, room temperature	Eppendorf	5424	Or equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotor for 1.5 mL and 2 mL microcentrifuge tubes
Microcon DNA Fast Flow Centrifugal Filter Units	EMD Millipore	MRCFOR100
Miracloth, 1 square per sample cut to fit funnel	EMD Millipore	475855
NEBNext Microbiome DNA Enrichment Kit	New England Biolabs	E2612L
parafilm	Parafilm M	PM992
plastic pots and trays
polyvinylpyrrolidone (PVP)	Fisher	BP431-100
Proteinase K	Qiagen	19131
Pulsed-Field Gel Electrophoresis rig (e.g. CHEF DR III)	Bio-Rad	1703697
purification beads, Agencourt AMpureXP beads	Beckman Coulter	A63881
QIAamp DNA Mini Kit	Qiagen	51304
Qiagen 20/g Genomic Tip DNA Extraction Kit	Qiagen	10223
Qiagen Buffer EB (elution buffer)	Qiagen	19086
Qiagen DNA Extraction Buffer Set	Qiagen	19060
QiaRack	Qiagen	19015
qPCR machine (e.g. Roche Light Cycler 480)	Roche
qPCR plate sealing film	Roche	4729757001
qPCR plate, 96 well plate	Roche	4729692001
Qubit assay tubes	Life Technologies	Q32856
Qubit Broad Spectrum assay kit	Life Technologies	Q32850
Qubit High Sensitivity assay kit	Life Technologies	Q32851
RNaseA	Qiagen	19101
Serological pipettes (20 mL) and pipet-aid	Fisher	13-678-11
Small funnels, 1 per sample
Sodium Chloride	Ambion	AM9759
Soft paintbrush, 2 per sample
SPEX SamplePrep 2010 Geno/Grinder or another type of tissue homogenizer	SPEX SamplePrep		Or another comparable tissue homogenizer. If you do not have access to a tissue homogenizer, then grinding in a pre-chilled mortar and pestle will suffice (see protocol for details). However, a homogenizer will give more consistent results and total homogenization time is reduced.
Sucrose	Omnipure	8550
TBE
thermomixer
Tris	Sigma	T2819-100ml
Triton X-100	Promega	H5142
tube rotater
tubes, 50 mL conical polypropylene	Corning	352070
tubes, 50 mL high-speed polypropylene	ThermoScientific/Nalgene	3119-0050	e.g. Nalgene Oakridge tubes or equivalent
vermiculite
water bath
water, sterile and certified Nuclease-free	Fisher	1481
water, sterile milliQ