JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ההשוואה ואופטימיזציה של שתי שיטות העשרה DNA DNA organellar צמח מוצגים: צנטריפוגה ההפרש הדיפרנציאלי ואת החלוקה של gDNA הכולל מבוסס על מצב מתילציה. אנו מעריכים את כמות הדנ"א וכתוצאה מכך, מדגימים ביצועים ברצף של הדור הבא, וקוראים את הפוטנציאל לשימוש ברצף המולקולה החד-פעמית.

Abstract

גנומים צמחיים מכילים רכיבים גדולים וחוזרים על עצמם, שעשויים לעבור זיווג או רקומבינציה ליצירת מבנים מורכבים ו / או קטעים גנומיים. גנומים של Organellar קיימים גם בתוספות בתוך תא נתון או סוג רקמות (heteroplasmy), ושפע של תת-סוגים עשויים להשתנות במהלך הפיתוח או כאשר נמצאים תחת לחץ (תת-סטויצ'יומטרי). הדור הבא רצף (NGS) טכנולוגיות נדרשים כדי להשיג הבנה עמוקה יותר של מבנה הגנום organellar ותפקוד. מחקרי רצף מסורתיים משתמשים במספר שיטות כדי להשיג DNA DNA: (1) אם נעשה שימוש בכמות גדולה של רקמה מתחילה, הוא הומוגני ונתון לצנטריפוגה דיפרנציאלית ו / או לטיהור הדרגתי. (2) אם נעשה שימוש בכמות קטנה יותר של רקמות ( כלומר, אם הזרעים, החומר או החלל מוגבלים), אותו תהליך מבוצע כמו (1), ולאחר מכן הגברה של הגנום כולו כדי להשיג מספיק DNA. (3) ניתוח ביואינפורמטיקה ניתן להשתמש כדי seqאת הדנ"א הגנומי הכולל ולנתח את הקריאה. לכל השיטות הללו יש אתגרים ופריצות. ב (1), זה יכול להיות קשה להשיג כזה כמות גדולה של רקמת החל; ב (2), הגברה הגנום כולו יכול להציג הטיה רצף; (3), הומולוגיה בין גנומים גרעיניים ו organellar יכול להפריע הרכבה וניתוח. במפעלים עם גנומים גרעיניים גדולים, זה יתרון להעשיר עבור DNA organellar כדי להפחית את עלויות הרצף ואת המורכבות רצף עבור ניתוחים ביואינפורמטיקה. כאן, אנו משווים שיטת צנטריפוגה דיפרנציאלית מסורתית בשיטה הרביעית, שיטה מתואמת CpG-methyl הנפתחת, כדי להפריד בין ה- DNA הגנומי הכולל לשברים גרעיניים ואורגניים. שתי השיטות מניבות די-אן-אי מספיק ל- NGS, DNA המועשר מאוד עבור רצפים אורגניים, אם כי ביחסים שונים במיטוכונדריה ובצ'לורופלסטים. אנו מציגים את האופטימיזציה של שיטות אלה עבור רקמות עלה חיטה ולדון היתרונות העיקריים דחסרונות של כל גישה בהקשר של קלט המדגם, קלות הפרוטוקול, ואת היישום במורד הזרם.

Introduction

רצף הגנום הוא כלי רב עוצמה לנתח את הבסיס הגנטי הבסיסי של תכונות המפעל חשוב. רוב מחקרי הגנום-רצף מתמקדים בתוכן הגנום הגרעיני, שכן רוב הגנים נמצאים בגרעין. עם זאת, גנומים אורגנואר, כולל המיטוכונדריה (על פני eukaryotes) ופלסטידים (בצמחים, הצורה המקצועית, הכלורופלסט, עובד בפוטוסינתזה) לתרום מידע גנטי משמעותי חיוני לפיתוח אורגניזמים, תגובת מתח, ואת הכושר הכללי 1 . גנומים של Organellar כלולים בדרך כלל בחריצות דנ"א הכוללות רצף גנומי גרעיני, למרות ששיטות להפחתת מספר האורגנים לפני החילוץ של דנ"א מועסקים גם 2 . מחקרים רבים השתמשו תוצאות רצף מתוך סך gDNA חילוץ להרכיב genelles organellar 3 , 4 , 5 ,Xref "> 6 , 7. עם זאת, כאשר המטרה של המחקר היא להתמקד genomes organellar, באמצעות gDNA הכולל מגדילה את עלויות רצף כי רבים קורא" אבודים "רצפי DNA גרעיני, במיוחד צמחים עם גנומים גרעיניים גדולים יתר על כן, בשל שכפול והעברת רצפים organellar לתוך הגנום הגרעיני בין האברונים, פתרון המיקום הנכון מיפוי של רצף קורא לגנום הנכון הוא מאתגר ביואינפורמטית 2 , 8. טיהור genomes organellar מן הגנום הגרעיני הוא אחד אסטרטגיות ביואינפורמטיקה נוספות ניתן להשתמש כדי להפריד קורא את המפה לאזורים של הומולוגיה בין המיטוכונדריה ו chloroplasts.

בעוד גנומים organellar ממין צמחים רבים כבר רצף, מעט ידוע על רוחב של מגוון גנום organellarזמין באוכלוסיות בר או בבריכות גידול מעובדות. גנומים Organellar ידועים גם להיות מולקולות דינמיות שעוברות סידור מבניים משמעותי עקב רקומבינציה בין רצפים חוזרים 9 . יתר על כן, עותקים מרובים של הגנום organellar כלולים בתוך כל אברון, ואת האברונים מרובים נמצאים בתוך כל תא. לא כל העותקים של גנומים אלה זהים, הידועה בשם הטרופלסמי. בניגוד לתמונה הקאנונית של "חוגי אב", יש כיום ראיות גוברות לתמונה מורכבת יותר של מבני גנום, כולל חוגים תת-גנומיים, כרומוזומים ליניאריים, קונקאמרים לינאריים ומבנים מסועפים 10 . ההרכבה של הגנום צמח organellar הוא מסובך עוד יותר על ידי גדלים גדולים יחסית שלהם חוזר משמעותי הפוך ישיר.

פרוטוקולים מסורתיים לבידוד organellar, טיהור דנ"א, ואת הגנום הבאים רצף דואר הם לעתים קרובות מסורבל ודורשים כמויות גדולות של קלט רקמות, עם כמה גרם כלפי מעלה של מאות גרם של רקמת עלה צעיר צורך כנקודת התחלה 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . זה עושה רצף הגנום organellar נגיש כאשר הרקמה מוגבלת. במצבים מסוימים, כמויות זרע מוגבלות, כגון כאשר יש צורך רצף על בסיס דורי או בקווים סטריליים זכרים כי צריך להישמר דרך חציית. במצבים אלה, DNA יכול להיות מטוהרים ולאחר מכן חשוף הגברה של הגנום כולו. עם זאת, הגברה שלמה הגנום יכול להציג הטיה רציף רצף, אשר היא בעיה מסוימת בעת הערכת וריאציה מבנית, מבנים גנומיים, ורמות heteroplasmy22 ההתקדמות האחרונה בהכנה לספריה לטווחים קצרים לקריאה של טכנולוגיות יש להתגבר על חסמי כניסה נמוכים כדי למנוע הגברה של הגנום כולו. לדוגמה, ערכת הכנה של ספריית NXTERA XT של Illumina XT מאפשרת מעט כמו 1 ng של DNA שישמש כקלט 19 . עם זאת, ההכנות הספריות סטנדרטיים עבור יישומים רצף לקרוא ארוך, כגון PacBio או אוקספורד Nanopore טכנולוגיות רצף, עדיין דורשים כמות גבוהה יחסית של ה- DNA קלט, אשר יכול להוות אתגר עבור רצף הגנום organellar. לאחרונה, חדש שפותח על ידי המשתמש, ארוך לקרוא פרוטוקולי רצף פותחו כדי להפחית את כמויות קלט כדי לעזור להקל על רצף הגנום בדגימות שבו קבלת מיקרוגרם כמויות של DNA קשה 20 , 21 . עם זאת, קבלת משקל מולקולרי גבוה, שברים organellar טהור להאכיל את ההכנות הספרייה הזאת נותרה אתגר.

חיפשנו לאO להשוות לייעל DNA העשרה organelar ושיטות בידוד מתאים NGS ללא צורך הגברה של הגנום כולו. באופן ספציפי, המטרה שלנו היתה לקבוע את שיטות העבודה המומלצות להעשרת עבור DNA גבוהה מולקולרית משקל organellar מחומרים החל מוגבל, כגון תת המדגם של עלה. עבודה זו מציגה ניתוח השוואתי של שיטות להעשיר עבור DNA organellar: (1) פרוטוקול צנטריפוגה דיפרנציאלית מסורתית שונה לעומת (2) פרוטוקול חלוקה DNA מבוסס על השימוש של דנ"א זמין מסחרית CpG-methyl- מחייב תחום גישה הנפתח חלבון 22 הוחל על רקמת הצמח 23 . אנו ממליצים על שיטות עבודה מומלצות לבידוד דנ"א אורגני מחיידק עלה חיטה, אשר ניתן להרחיב בקלות צמחים אחרים ורקמות סוגים.

Protocol

1. הדור של חומרים צמחיים בידוד Organellar ו - DNA החילוץ

  1. גידול סטנדרטי של שתילי חיטה
    1. זרעי הצמח vermiculite קטן, מרובע סירים עם 4 - 6 זרעים לפינה. העברה לחממה או תא צמיחה עם מחזור אור 16 שעות, 23 מעלות צלזיוס יום / 18 מעלות צלזיוס.
    2. להשקות את הצמחים בכל יום. לדשן את הצמחים עם כפית ¼ של דשן 20-20-20 NPK גרעיני על נביטה ב 7 ימים לאחר נביטה.
  2. אלטרנטיבי אלטרנטיבי של שתילי חיטה
    1. בצע את שלב 1.1, אבל במקום את הסירים בתא צמיחה כהה, 23 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות / 18 מעלות צלזיוס במשך 8 שעות. לחלופין, לכסות את הצמחים בחממה ( למשל, עם מיכל אחסון, עם זאת, אוורור ראוי חייב להישמר).
  3. גידול וגידול רקמות
    1. לגדל את הצמחים עבור 12 - 14 ימים. עבור רוב גנוטיפ חיטהS, 75-100 שתילים תשואה סביב 10 - 12 גרם של רקמה, אשר מספיקה עבור שני extractellar לחלץ בשיטת צנטריפוגה ההפרש (סעיף 2); רק מפעל אחד הוא הכרחי אם ניצול דנ"א CpG- מתילציה מבוסס הנפתח גישה organellar מפוצל מ DNA גרעיני (סעיף 3).
    2. אם באמצעות גישת צנטריפוגה ההפרש, לאסוף רקמות טריות ולהמשיך מיד לעיבוד דגימות, כמתואר בסעיף 2.
    3. אם ניצול הגישה CpG-methyl הנפתח, הקציר 20 מ"ג סעיפים של רקמת עלה צעיר לתוך צינורות microcentrifuge (להשתמש גם רגיל או גדל רקמה etiolated, לראות את תוצאות נציג ). הצמד להקפיא על חנקן נוזלי להקפיא ב -80 מעלות צלסיוס עד לשימוש. המשך לפריצה הנפתחת של דנ"א, כמתואר בסעיף 3.

2. שיטה # 1: מיצוי DNA באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית (DC)

הערה: הבדלפרוטוקול צנטריפוגה erential שונה משני פרסומים כי אופטימיזציה התנאים לבודד את שני האברונים אבל להעשיר עבור המיטוכונדריה 17 , 24 . הפרוטוקול שנוצר הוא פחות זמן אינטנסיבי ומשתמש בכימיקלים רעילים פחות מאשר בשיטות הקודמות. באופן ספציפי, עשינו שינויים במאגר ו לשטוף צעדים, כולל תוספת של polyvinylpyrrolidone (PVP) למאגר החילוץ STE ואת חיסול השלב לשטוף הסופי במאגר NETF, המכיל פלואוריד נתרן (NaF).

זהירות: הכנה ושימוש במאגר STE צריך להתבצע מתחת למכסה קטר כימי עם ציוד הגנה אישי ראוי, כמו מאגר זה מכיל 2-mercaptoethanol (BME).

  1. דברים לעשות לפני שמתחילים
    1. ודא כי כל הציוד הוא נקי מאוד, החיטוי כל הציוד שניתן autoclaved ( למשל, צילינדרים שחיקה, מהירות גבוהה centriצינורות fuge, וכו ' ).
      הערה: עצות סינון מומלצות לכל השלבים המחייבים את pipetting כדי למנוע זיהום צולב.
    2. ראה רשימה של הציוד הנדרש ריאגנטים ולהכין את המאגרים הנדרשים ומלאי עבודה לשיטה # 1 ( טבלה 1 ). צינת בלוקים שחיקה קריוגני כדי -20 מעלות צלזיוס ואת הרוטורים מאגרים ל 4 מעלות צלזיוס, להגדיר את microcentrifuge ל 4 מעלות צלזיוס, ולהפעיל על אמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
  2. בידוד האברונים
    1. קציר 5 גרם של רקמות טריות ולשטוף אותו במים קרים, סטרילי בכוס צונן על הקרח.
      הערה: תמיד לשמור על דגימות על הקרח במהלך כל פעולות הובלות אל וממנו צנטריפוגות, ברדסים ברדסים, וכו ' לחילופין, לעבוד בחדר קר אם יש גישה מספיק מקום וציוד לבצע את הפרוטוקול.
    2. באמצעות מספריים, לחתוך רקמת עלה לתוך ~ 1 ס"מ חתיכות ישירות לתוך צינור 50 מ"ל המכיל שני שחיקה קרמיצילינדרים.
      הערה: נקה או שנה את המספריים בין דגימות כדי למנוע זיהום צולב.
    3. אם אין homogenizer רקמות, להשתמש מרגמה העלי ועקוב אחר צעדים 2.2.4 - 2.2.9.
      1. חותכים את רקמת העלה לתוך מרגמה טרום צונן על הקרח. טוחנים את הדגימות עבור 2 - 3 דקות ב 15 מ"ל של STE (במנדף קטר).
      2. יוצקים את המאגר (להשאיר את הרקמה של מרגמה) דרך משפך המכיל שכבה אחת של בד טרום רטוב, סטרילי סינון (~ ~ 25 עד 25 מיקרומטר גודל הנקבוביות, לראות את הפרוטוקול העיקרי לפרטים) לתוך צינור אחר 50 מ"ל . מוסיפים עוד 10 מ"ל של STE על המלט ואת העלי ו homogenize שוב.
      3. יוצקים את הרקמה הומוגנית למאגר לתוך משפך זהה. שוטפים את המלט ואת העלי עם 10 מ"ל של STE ושופכים אותו לתוך משפך. לחץ וסחט את בד הסינון לתוך המשפך כדי לשחזר כמה שיותר נוזלים.
        הערה: לשנות כפפות בין דגימות, כדי למנוע זיהום צולבות. המשך עם המקצועTocol at שלב 2.2.10.
    4. הוסף 20 מ"ל של STE (במנדף קטר) לכל צינור 50 מ"ל.
    5. מניחים את דגימות לתוך טרום צוננים חוסם cryogenic בלוקים במנגנון רקמה שחיקה לטחון דגימות עבור 2 x 30 s ב 1,750 סל"ד. סובב את עמדות המדגם במקום דגימות על הקרח במשך דקות 1 ~ בין grinds.
      הערה: ניתן להשתמש בשלב זה במכתש ועלי, בלנדר או מכשיר אחר לטחנת רקמות / הומוגניות. עם זאת, כל שיטה ישפיע על איכות ה- DNA שנוצר מעלות שונות, ולכן אורך DNA ואיכות צריך להיות מוערך לפני המשך עם יישומים במורד הזרם.
    6. הכנס משפך לתוך צינור נקי 50 מ"ל להציב בקרח. מניחים שכבה אחת של בד סינון לתוך המשפך מראש רטוב עם 5 מ"ל של STE. אל תשליך את הזרימה.
    7. יוצקים את הרקמה הומוגנית לתוך משפך. שוטפים את הצינור שחיקה עם 15 מ"ל של STE, לסכם ולהפוך את הצינור לשטוף את הקירות ואת המכסה, ושופכים לתוך funnEl.
    8. בזהירות להסיר את אבני החרס ולאחר מכן לסחוט ולסחוט את בד הסינון לתוך המשפך.
      הערה: לשנות כפפות בין דגימות, כדי למנוע זיהום צולבות.
    9. לעטוף את פקקי צינור עם parafilm כדי למנוע שפיכה. צנטריפוגה ב 2000 xg במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
    10. בזהירות לשאוב supernatant באמצעות פיפטה סרולוגית (למנוע הפרעה גלולה) ומניחים אותו צינור צנטריפוגה 50 מ"ל במהירות גבוהה (אם צינורות אין אטמים אטום הדוק, לעטוף את כובעי צינור עם parafilm כדי למנוע שפיכה). מחק את כדורי.
    11. מאזן את צינורות לתוך 0.1 גרם באמצעות STE ו צנטריפוגה וכתוצאה מכך supernatant עבור 20 דקות ב 18,000 xg ו 4 מעלות צלזיוס. כדי לאזן את הצינורות, במקום כוס קטנה של קרח על האיזון, טרה את קנה המידה, ולשקול את הדגימות על הקרח כדי לשמור על הקור. לחלופין, להשתמש באיזון ואת ברדס קטר בחדר קר.
    12. מחק את supernatant. הוסף 1 מ"ל של ST כדי גלולה מחדש להשעות בעדינות אותנומכחול רך. הוסף 24 מ"ל של ST (נפח סופי של 25 מ"ל) ומערבבים / מערבולת ( כלומר, לחץ על מכחול בצד הצינור כדי להסיר את כל נוזל).
    13. לאזן את הצינורות בתוך 0.1 גרם באמצעות ST. צנטריפוגה במשך 20 דקות ב 18,000 XG ו 4 מעלות צלזיוס. בינתיים, להכין פתרון DNaseI (ראה טבלה 1 עבור מלאי פתרונות פתרון עבודה). עבור כל מדגם, לעשות אחד 200 aliquot μL בצינור 1.5 מ"ל.
    14. מחק supernatant, כתם את הצינור, מחדש להשעות את גלולה (עדיין צינור צנטריפוגה במהירות גבוהה) ב μL 300 של ST באמצעות מכחול רך. מניחים את מכחול בצינור מוכן 1.5 מ"ל לשעבר המכיל 200 μL של פתרון DNaseI ו מערבולת מכחול כדי להסיר כל גלולה שיורית תקועה במברשת. פיפטה הפתרון DNaseI בחזרה לתוך צינור צנטריפוגות במהירות גבוהה בעדינות מערבולת לערבב.
    15. דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות באמבט מים (לעטוף parafilm סביב החלק העליון של הצינור כדי למנוע עיבוי leakinG לתוך מכסה). מערבבים בעדינות על ידי סחרור 2 פעמים במהלך הדגירה.
    16. בעדינות פיפטה תערובת גלולה מתוך הצינור באמצעות קצה פיפטה עם פתח רחב ומניחים אותו צינור 1.5 מ"ל נמוך לאגד. הוסף 500 μL של 400 מ"מ EDTA, pH 8.0, כדי צינור צנטריפוגה במהירות גבוהה פיפטה בעדינות כדי לקבל את כל גלולה שיורית מתוך הצינור. מעבירים את EDTA לאותו 1.5 מ"ל, נמוך לאגד צינור כמו תערובת גלולה בעדינות לערבב על ידי היפוך.
    17. צנטריפוגה ב XG 18,000 במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. מחק את supernatant, כתם את הצינור, ולהשתמש בבת אחת עבור בידוד DNA. אם יש צורך, להקפיא pellets ב -20 מעלות צלזיוס, אבל זה עלול לגרום להפחתת התשואה, כמו DNaseI שיורית עלול להשפיל את הדנ"א מדגם אם זה לא מעובד מיד.
  3. מיצוי דנ"א מאורגנים מבודדים תוך שימוש בגישה מסחרית המבוססת על עמודות
    הערה: עיין במדריך הערכה עבור הפרוטוקול המלא 25 , וראה להלן שינויים. יחסי ציבורOceeding ישירות מבידוד organellar כדי מיצוי ה- DNA הוא העדיף. הקפאה חוזרת ונשנית והפשרה תפחית את גודל הדגימה של ה- DNA ותוביל להשפלה של דנ"א על ​​ידי DNaseI שיורי. הגבלת vortexing או pipetting נמרץ, כמו זה יכול לגזום את ה- DNA. השימוש צינורות microcentrifuge נמוכה לאגד מומלץ למקסם את התאוששות ה- DNA.
    1. מיצוי דנ"א
      הערה: קרא את הפרוטוקול המסחרי המפורט 25 לפני שתתחיל לוודא כי המאגרים נעשים כראוי / מאוחסנים וכי הליכי טור ספין מובנים.
      1. הוסף 180 μL של ATL חיץ ישירות לתוך הצינור עם גלולה (מופשר אם בעבר קפוא equilibrated לטמפרטורת החדר על benchtop).
      2. המשך שלב 3 בפרוטוקול "טיהור דנ"א מ רקמות" בספר הדרכה Kit, עם השינויים הבאים: 30 דקות תמוגה בשלב 3, כולל עיכול אופציונלי RNase א, elute ב 3 x 200 μL של AE ( כל אחד לתוך seצינור parate ולאחר מכן לשלב את elutions).
      3. שמור aliquot (לפחות 20 μL) עבור qPCR (ראה שלב 4.1). כדי לכמת לפני ריכוז, לשמור עוד 1 μL עבור כימות רגישות גבוהה.
      4. אם תרצה, להמשיך עם ריכוז המדגם.
  4. ריכוז לדוגמה עם יחידות מסנן מסחרי
    הערה: עיין בפרוטוקול המסחרי 26 לקבלת פרטים נוספים. בהתאם לשימוש במורד הזרם, ייתכן שלא יהיה צורך לבצע ריכוז מדגם ( למשל, עבור נקודות קצה PCR ויישומים qPCR). עם זאת, עבור NGS ספריית הבנייה, זה יהיה כנראה יהיה צורך לרכז דנ"א organellar שהושג לאחר החילוץ DNA.
    1. תהליך ריכוז עמודה
      1. בזהירות שקול מראש (ראה טבלה 2 ) יחידת מסנן ריק (ללא צינור) על פיסת נייר שקילה על מאזן אנליטי דיגיטלי. רשום את המשקל.
      2. פאימקפלים את ה elutes המשולב לתוך יחידת המסנן ושוקלים בזהירות.
        הערה: המדריך המסחרי 26 אומר כי נפח יחידת הסינון המקסימלי הוא 500 μL, אבל עד 575 μL ניתן להוסיף ליחידה בבת אחת ללא הצפת.
      3. בזהירות במקום יחידת מילוי מלא לתוך צינור (מסופק עם העמודות). צנטריפוגה ב XG 500 עבור הזמן הרצוי כדי להשיג את נפח להתרכז הנדרש. עבור נפח מדגם של ~ 575 μL, ספין 20 דקות בדרך כלל התוצאה נפח להתרכז של μL 15 - 30.
      4. הסר את יחידת הסינון מהצינור ושקול שוב. השתמש בטבלה כדי לקבוע אם נפח הריכוז הרצוי הושג. אם לא, צנטריפוגה שוב ב 500 xg למשך זמן קצר יותר ולשקול שוב; חזור עד להופעת נפח הריכוז הרצוי.
      5. מניחים צינור חדש (מסופק עם העמודות) מעל החלק העליון של יחידת המסנן ולהפוך. צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 1000 xg להעביר את שיתוףNcentrate אל הצינור.
      6. לקבוע את עוצמת הקול התאושש. זה יהיה בדרך כלל ~ 3 - 5 μL פחות נפח מחושב, עקב שימור מסנן. אם יתר מרוכז, לדלל עם מים סטריליים או TE להשיג את עוצמת הקול הרצויה.
      7. לכמת את ה- DNA באמצעות כימות רגישות גבוהה (לפי הוראות היצרן).

3. שיטה מס '2: Methyl-Fractionation (MF) גישה להעשרת DNA של Organellar מתוך סך DNA גנומי

הערה: פרוטוקול זה שונה מן המשתמש פיתחה גנומי עצה קיט DNA פרוטוקול החילוץ עבור צמחים ופטריות 27 ו Microbiome DNA העשרה פרוטוקול Kit העשרה 28 . בתיאוריה, כל פרוטוקול בידוד דנ"א אשר מניב DNA גבוה משקל מולקולרית עשוי לשמש הנפתח. עבור רצף קריאה קצר, כל מיצוי החילוץ ברובו> 15 קילו שברי הוא מתאים לשימוש הנפתח. עבור loרצף קריאה ng, שברי גדול עשוי להיות רצוי. לכן, אנו אופטימיזציה זה פרוטוקול להניב דנ"א משקל מולקולרי גבוה.

  1. בידוד של ה- DNA הכולל
    הערה: ראה רשימה של הציוד הנדרש ריאגנטים ולהכין את המאגר הנדרש מניות עבודה עבור שיטה מס '2 ( טבלה 1 ). הוסף lysing אנזימים מלאי מאגר תמוגה כדי להפוך את הפתרון תמוגה חיץ פתרון. הפעל את thermomixer ולהגדיר אותו 37 מעלות צלזיוס. הפעל את אמבט המים ל 50 מעלות צלזיוס במקום חיץ QF באמבטיה. מקום 70% EtOH במקפיא ולהגדיר את microcentrifuge ל 4 מעלות צלזיוס.
    1. סה"כ מיצוי DNA באמצעות עמודות מסחריות של דנ"א
      הערה: לפני שתתחיל, קרא את המדריך המסחרי 29 לקבלת מידע מפורט אודות השימוש בעמודות חילופי אניות זרימת הכבידה. העמודות ניתן להגדיר באמצעות מתלה מיוחד או להציב מעל צינורות באמצעות טבעות פלסטיק המסופקים. כל השלבים, כולל gטיפים אטומיים, יש לאפשר להמשיך על ידי זרימת הכבידה, נוזל שיורי לא צריך להיות כפוי דרך.
      1. טוחנים 20 מ"ג של רקמה קפואה בחנקן נוזלי בצינור 2-mL נמוך לאגד באמצעות יד שחיקה טירות המיועד צינורות 2 מ"ל.
      2. הוסף 2 מ"ל של תמיסת תמיסה חיץ פתרון (צינורות יהיה מלא מאוד).
      3. דגירה thermomixer ב 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות עם תסיסה עדינה בסל"ד 300. אם thermomixer אינו זמין, incubating על בלוק חום ערבוב ידי עדין מהבהב כל 15 דקות היא חלופה מתאימה.
      4. הוסף 4 μL של RNase A (100 מ"ג / מ"ל, ריכוז סופי של 200 מיקרוגרם / מ"ל). הפוך לערבב דגירה thermomixer במשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס, עם תסיסה עדינה בסל"ד 300.
      5. הוסף 80 μL של proteinase K (20 מ"ג / מ"ל, ריכוז סופי של 0.8 מ"ג / מ"ל), להפוך לערבב, ו דגירה thermomixer עבור 2 שעות ב 50 מעלות צלזיוס, עם תסיסה עדינה ב 300 סל"ד.
      6. צנטריפוגה במשך 20 דקות ב 4 ° C ו 15,000 xg כדי גלולה פסולת מסיס.
      7. בעוד הדגימות צנטריפוגה, לאזן את העמודות עם 1 מ"ל של QBT הצפת ולאפשר את הטור לרוקן על ידי זרימת הכבידה.
      8. השתמש קצה פיפטה רחב נשא מיד ליישם את המדגם (למנוע את גלולה) אל עמוד equilibrated ולאפשר לו לזרום באופן מלא דרך העמודה. אם המדגם הופך מעונן, לסנן או צנטריפוגה שוב לפני היישום לעמודה (עיין במדריך מסחרי לפרטים 29 ).
      9. לאחר המדגם נכנס לחלוטין שרף, לשטוף את העמודה עם 4 x 1 מ"ל של QC חיץ.
      10. להשעות את הטור מעל נקי, 2 מ"ל, צינור נמוך microcentrifuge לאגד. Elute את הדנ"א הגנומי עם 0.8 מ"ל של prefmed QF חיץ ב 50 מעלות צלזיוס.
      11. לזרז את ה- DNA על ידי הוספת 0.56 מ"ל (0.7 כרכים של חיץ elution) של טמפרטורת החדר isopropanol כדי DNA eluted.
      12. מערבבים על ידי היפוך (10X) ו צנטריפוגות מיד 20 דקות ב 15,000 xg ו 4 ° C. לְטַפֵּלמלא להסיר את supernatant מבלי להפריע את גלולה, גלולה מצורף רופף.
      13. שטפו את צנטריפוגה דנ"א גלולה עם 1 מ"ל של אתנול 70% קר. צנטריפוגה במשך 10 דקות ב XG 15,000 ו 4 ° C.
      14. בזהירות להסיר את supernatant (להיות זהירים עם צעד זה גם כן) מבלי להפריע גלולה. אוויר יבש במשך 5-10 דקות ו resuspend את ה- DNA ב 0.1 מ"ל של חיץ elution (EB). ממיסים את הדנ"א בן לילה בטמפרטורת החדר. הימנע pipetting, אשר עשוי לגזום את ה- DNA.
      15. לכמת את דגימות באמצעות assay גבוהה רגישות כימות DNA (לפי הוראות היצרן).
  2. פיצול מבוסס חרוז של דנ"א methylated ו unmethylated
    הערה: פרסום שפורסם לאחרונה הוכיח את השימוש בערכה זמינה מסחרית 28 המנצלת את הגישה הנפתחת באמצעות CpG ספציפי חלבונים מתיל מחייב תחום התמזגו לחלק האדם IgG FC (חלבון MBD2-Fc) לשבראכלו צמח הגנום organellar (unmethylated) מ הגנום הגרעיני (מתילציה) תוכן 23 . יעילות הפיצול בדגימות חיטה לא נבדקה קודם לכן באמצעות ערכת MF המסחרית 28 .
    1. דברים לעשות לפני שמתחילים
      1. טריים להכין 80% אתנול (לפחות 800 μL לכל תגובה). בחר 5x לאגד / לשטוף חיץ להפשיר על הקרח ולהכין 5 מ"ל של חיץ 1x לכל מדגם (לדלל 5X חיץ עם מים סטרילי, nuclease ללא ולשמור על הקרח במהלך הפרוטוקול).
    2. הכן MBD2-FC חרוזים מגנטיים מחויב
      1. הכינו את המספר הדרוש של ערכות חרוזים. קנה המידה את התגובות להשתמש בין 1 ו 2 מיקרוגרם של ה- DNA קלט הכולל, הדורש 160-1300 μL של חרוזים. שים לב כי התגובות המפורטות להלן הם עבור 1 מיקרוגרם של ה- DNA קלט הכולל, ולכן הם דורשים 160 μL של חרוזים. סולם את התגובות בהתאם לצרכים.
      2. שימוש רחב נשא טיפים, בעדינות פיפטה את חלבון מגנטי BEad slurry למעלה ולמטה כדי ליצור השעיה הומוגנית. כחלופה, בעדינות לסובב את הצינור של חרוזים במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
        הערה: אל מערבולת החרוזים.
      3. המשך בהוראות לפי הוראות היצרן 28 .
    3. לכידת DNA גרעיני מתיל
      1. עבור כל מדגם בודדים, להוסיף 1 מיקרוגרם של ה- DNA קלט לצינור המכיל 160 μL של חרוזים מגנטיים MBD2-Fc- מגנטי.
      2. הוסף 5x לאגד / לשטוף חיץ לפי הצורך בהתחשב בנפח הדגימה קלט דנ"א לריכוז סופי של 1x (נפח של 5x לאגד / לשטוף חיץ להוסיף (μL) = נפח ה- DNA קלט (μL) / 4). פיפטה המדגם למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לערבב באמצעות קצה פיפטה רחב נשא.
      3. סובב את הצינורות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. בעדינות פיפטה דגימות עם קצה פיפטה נשא רחב להעיף את הדגימות 2 - 3 פעמים לאורך הדגירה כדי למנוע clumping חרוז.
        הערה: pipetting ו flickiNg הוא קריטי כדי להבטיח הנפתח יעיל של ה- DNA methylated.
    4. איסוף דנ"א organellar מועשר, unmethylated
      1. בקצרה לסובב את הצינור המכיל את ה- DNA ו MBD2-Fc כבול תערובת חרוז מגנטי. מניחים את הצינור על מתלה מגנטי במשך לפחות 5 דקות לאסוף את החרוזים בצד הצינור. הפתרון צריך להיראות ברור.
      2. בעזרת טיפים רחבים, להסיר בזהירות supernatant לנקות ללא הפרעה חרוזים. מעבירים את supernatant (מכיל unmethylated, DNA מועשר organellar) כדי נקי, נמוך לאגד, 2 מ"ל microcentrifuge צינור. חנות מדגם זה -20 או -80 מעלות צלזיוס, או להמשיך ישירות לשלב 3.2.6 לטיהור.
    5. Elute שנתפסו DNA גרעיני מן MBD2-Fc חרוזים מגנטיים
      1. אם חלק הגרעין הוא גם הרצוי, בצע את הוראות היצרן 28 כדי elute DNA גרעיני מן חרוזים מגנטיים MBD2-Fc- מגנטי; לטהר כמתואר בשלב 3.2.7.
    6. חומצה המבוססת על טיהור חומצות גרעין
      1. ודא חרוזי טיהור הם בטמפרטורת החדר מעורבבים היטב. המשך בפרוטוקול בהתאם להוראות במדריך למשתמש MF 28 .
        הערה: המדגם יכול כעת לשמש לבניית ספריית NGS או ניתוח נוסף במורד הזרם.

4. כימות לדוגמא בקרת איכות

  1. QPCR assay להעריך להעשיר organellar
    הערה: התגובה qPCR ופרמטרים assay המפורטים כאן נועדו לשימוש על Roche LightCycler 480 וייתכן שיהיה צורך להתאים עבור ציוד שונים ריאגנטים. אם qPCR אינו זמין, נקודות קצה PCR ויזואליזציה על ג'ל agarose עשוי לשמש מדד איכותי של טוהר המדגם, תוך שימוש primers אותו התנאים המתוארים כאן. גדלי Amplicon יהיה ~ 150 BP עבור כל ערכות פריימר. ראה טבלה 3 עבור רצף פריימרCes ו זיווגים.
    1. QPCR תגובה התגובה
      1. כדי להגדיר תגובה בודדת qPCR 20 μL, בזהירות פיפטה הבא לתוך באר אחת של צלחת qPCR 96 גם: 10 μL של 2x SYBR ירוק אני מאסטר; 2 μL של 10 מיקרומטר קדימה תערובת פריימר הפוך (עבור ריכוז סופי של 0.5 מיקרומטר); 2 μL של תבנית (בטווח של עקומה סטנדרטית); ו 6 μL של סטרילית, nuclease ללא H 2 O. כדי להפחית את השגיאות pipetting, עדיף לעשות תערובת הורים עם כל רכיבי התגובה למעט התבנית. הוסף את התמהיל הראשי לצלחת qPCR ולאחר מכן להוסיף את התבנית של עניין כל טוב. שלושה משכפל טכני עבור כל מדגם צריך להתבצע כדי למזער את ההשפעות של שגיאת pipetting.
        הערה: בסופו של דבר, היחס בין מחזורי כימות לאורגנילאר משווים בין דגימות, ולכן הבדלים קלים בריכוז מקובלים. עם זאת, ריכוז ה- DNA צריך להיות בערך בטווח של eaCh אחר.
      2. חותם את הצלחת עם איכות גבוהה qPCR איטום הסרט. בעדינות מערבולת דגימות, נזהר כדי למנוע את היצירה של כל הבועות. בקצרה לסובב את הצלחת למטה במשך 2 דקות ב 4 ° C כדי לאסוף את המדגם ולמנוע כל בועות קטנות.
      3. טען את הצלחת לתוך המכונה. הפעל את התוכנית qPCR לפי ההנחיות המפורטות להלן.
    2. Q פרמטרים התגובה
      הערה: אלה הם פרמטרים המשמשים כברירת מחדל, למעט מחזור החישול של שלב ההגברה. התאם הגדרה זו כדי להתאים פריימרים ספציפיים אם אלה המשמשים שונים פריימרים המוצגים בפרוטוקול זה.
      1. טרום דגירה על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, עם שיעור הרמפה של 4.4 מעלות צלזיוס / s.
      2. ביצוע 45 מחזורים הגברה של (1) 95 מעלות צלזיוס במשך 10 s, עם שיעור הרמפה של 4.4 מעלות צלזיוס / s; (2) 60 מעלות צלזיוס במשך 20 s, עם שיעור הרמפה של 2.2 מעלות צלזיוס / s; ו (3) 72 מעלות צלזיוס במשך 10 s, עם שיעור הרמפה של 4.4 מעלות צלזיוס (נתונים שנרכשו במהלך (3)).
      3. השתמש באופטיוNal עקום מחזור עקומת של 95 מעלות צלזיוס במשך 5 s, עם שיעור הרמפה של 4.4 מעלות צלזיוס / s; 65 מעלות צלזיוס למשך 1 דקות, עם שיעור הרמפה של 2.2 מעלות צלזיוס / s; ו 97 ° C, עם מצב הרכישה מתמשך.
      4. השתמש במחזור קירור של 40 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, עם קצב הרמפה של 1.5 ° C / s.
    3. פרמטרים Assay
      1. בחר את תבנית ה- SYBR. בדוק את הפרמטרים של התוכנית בלחצן הניסוי. לאחר צלחת נטען, assay ניתן להתחיל, ואת ההגדרות עשוי להיות מותאם בזמן assay פועל.
      2. הקצה דוגמאות באמצעות עורך המדגם. בחר ABS כמות כמו זרימת העבודה ואת לייעד את דגימות כמו ידוע, סטנדרטים, או שולטת שלילית. לייעד משכפל ולמלא את שמות המדגם של הראשון של כל לשכפל. הוסף ריכוזים ויחידות לתקנים.
      3. הגדרת קבוצות משנה לניתוח; אלה מוקצים בעורך המשנה.
      4. לניתוח, בחר Abs Quant / 2nd נגזרת מקס מתוך "יצירת ניתוח חדש" רשימה.ייבוא ​​עקומת תקן שנשמר חיצונית (אם רלוונטי) ולאחר מכן פגע לחשב; הדוח יכיל את המידע שנבחר.
      5. כדי לבצע כימות מוחלטת מדויקת לקביעת מספר העותק או הריכוז, יש להשתמש בעקומה סטנדרטית המייצגת את המדגם הנבדק ( לדוגמה, DNA של ה- organellar המבודד מהשיטות לעיל). מאחר שכמות הדנ"א המיטוכונדריאלי הנדרשת להכנת עקומה סטנדרטית גבוהה מדי להשגה עם כמות סבירה של רקמות, אל תשתמש בחישובי מספרי העותקים המסופקים על-ידי התוכנה, אלא נבחן את ערכי נקודת המעבר (Cp) כדי לקבוע את העשרה היחסית של organellar לעומת DNA גרעיני בדגימות. השווה אלה כמויות יחסית לאלה של הדנ"א הגנומי הכולל (ראה תוצאות נציג ). מבחן היעילות פריימר על חמש דילולים 1:10 של הדנ"א הגנומי הכולל מ מבוגר קל, שתילי חיטה בן שבועיים (יעילות נציג דיווחו בE האגדה של איור 2 ).
  2. ג'ל אלקטרופורזה פעימה בשדה (PFGE)
    הערה: פרוטוקול זה מבוסס על הנחיות היצרן לבצע PFGE כדי לפתור גבוהה DNA משקל מולקולרי. ראה טבלת החומרים.
    1. הכנת הג'ל ודגימות
      1. בצע את ההנחיות להכנת ג'ל והדוגמה ולהתאים אותם למערכת זמינה.
    2. הפעל את הפרמטרים
      1. בצע את ההנחיות להקמת מערכת אלקטרופורזה ולהשתמש בפרמטרים הבאים: זמן מתג התחלתי של 2 שניות, זמן מתג סופי של 13 שניות, זמן ריצה של 15 שעות ו- 16 דקות, V / cm של 6, וזווית כלולה של 120 ° .
    3. הכתם ואת התמונה ג'ל
      1. כתם ג'ל עם צבע של בחירה ( למשל, ethidium bromide או חלופה מתאימה) ואת התמונה עם מערכת תיעוד ג'ל מתאים.
  3. NGS וניתוח
    1. השתמש 1 ng של DNA כמו קלט עבור ערכת ה- DNA Prep Kit, לפי הוראות היצרן.
    2. ברקוד הבריכה דגימות עבור רצף בריצה אחת. בצע רצף בהתאם להנחיות היצרן.
      הערה: ניתן לשנות את הפרמטרים של בריכה ורצף בהתאם למין האינטרס, רמת הכיסוי הרצויה והפלטפורמה המשמשת לרצף הספריות. לדוגמה, נתיב HiSeq יש תפוקה גדולה יותר מאשר נתיב MiSeq, כך דוגמאות רבות יותר ניתן multiplexed. רצף קבוצה קטנה יותר של דגימות כדי לקבוע אם רמות הכיסוי של genomes organellar נאותים עבור ניתוח במורד הזרם.
    3. בדוק את איכות הקריאה באמצעות FastQC 31 כדי לקבוע את מידת הגזירה והסינון הדרושים לנתונים.
    4. חתוך ולסנן את הגלם קורא באמצעות Trimmomatic 32 או תוכנית דומה אחרת. השתמש בהגדרות הבאות: ILLUMINACLIP 2:30:10 (כדי להסיר מתאמים), מוביל 3, TRAILING 3, SLIDINGWINDOW 4:10, ו MINLEN 100.
    5. מפה את איכות מסוננים מתוחכם גזוז- end (PE) קורא את המינגוכונדריה הסינית האביבית (NCBI הפניה רצף NC_007579.1 33 ), chloroplast (NCBI הפניה רצף NC_002762.1 34 ), ואת הגרעין 35 התייחסות גנומים באמצעות Bowtie2 36 , עם ההגדרות הבאות: -I 0 -X 800 - רגיש.
    6. המרת קבצי יישור סם בפורמט bam (samtools) ומיין את קבצי bam. השתמש בקבצי בם כדי לחשב כיסוי גנום רחב כיסוי לכל בסיס עם bedtools. לדמיין את התוצאות עם פונקציה R- העלילה.

תוצאות

הפרוטוקולים המוצגים בכתב יד זה מתארים שתי שיטות שונות להעשרת דנ"א אורגני מהרקמה הצמחית. התנאים המוצגים כאן משקפים אופטימיזציה של רקמת החיטה. השוואה של שלבים עיקריים בפרוטוקולים, קלט רקמות נדרש, פלט ה- DNA מתוארים באיור 1 . השלבים של ?...

Discussion

עד כה, רוב מחקרים ברצף organellar מרכז בשיטות DC המסורתית להעשיר עבור DNA ספציפיים. שיטות לבודד אורגנים ממגוון צמחים תוארו, כולל מוס 40 ; מונוקולטים כגון חיטה 15 ו שיבולת שועל 11 ; ו dicots כגון arabidopsis 11 , חמניות 17 , ו rapes...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.

אזכור שמות מסחריים או מוצרים מסחריים בפרסום זה נועד אך ורק לצורך מתן מידע ספציפי ואינו מרמז על המלצה או אישור על ידי משרד החקלאות האמריקאי. USDA היא הזדמנות שווה ספק ומעסיק.

Acknowledgements

ברצוננו להודות במימון של מחלקת החקלאות של ארצות הברית - החקלאות שירות המחקר ו מן הקרן הלאומית למדע (IOS 1025881 ו IOS 1361554). אנו מודים ר 'Caspers עבור תחזוקת החממה טיפול הצמח. אנו מודים גם על אוניברסיטת מינסוטה גנומיקה מרכז, שם ההכנות הספרייה Illumina ורצף בוצעו. אנו גם אסירי תודה על הערות עורכי היומן וארבעה מבקרים אנונימיים שחיזקו עוד יותר את כתב היד שלנו. אנו גם מודים ל- OECD על מלגה ל- SK לשלב פרוטוקולים אלה לפרויקטים משותפים עם עמיתים ביפן.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2-mercaptoethanol (beta-mercaptoethanol; BME)Sigma AldrichM3148-100ml
2-propanol (Isopropyl alcohol/isopropanol), bioreagentSigma AldrichI9516
agarose, Bio-Rad Cetified Megabase agaroseBio-Rad1613108
analytical balanceMettler ToledoAB54-S
balanceMettler ToledoPB1502-S
bovine serum albumin (BSA)Sigma AldrichB4287-25G
Ceramic grinding cylinders, 3/8in x 7/8inSPEX SamplePrep2183
Cryogenic Blocks compatible with tissue homogenizer for holding 50 mL tubesSPEX SamplePrep2664
DNaseISigmaDN25
ethanol, absoluteDecon Laboratories2716
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), 0.5 M Solution, pH 8.0FisherBP2482-500
gel imaging system
gel stainSuch as GelRed or Ethidium Bromide
grinding pestle, wide tip for 2 mL conical tubes
Guanidine-HCl, 8 M solutionThermoFisher24115
LightCycler 480 SYBR Green I MasterRoche4707516001
liquid nitrogen
Lysing enzymes from Trichoderma harzianumSigmaL1412
Magnesium ChlorideG Bioscience24115
magnetic rackThermoFisherA13346
microcentrifuge tubes, LoBind 1.5 mL Eppendorf22431021
microcentrifuge tubes, standard nuclease-free 1.5 mLEppendorf
microcentrifuge, refrigeratedSorvall Legend X1ROr equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotors for 50 mL tubes, Oak Ridge tubes, and 1.5 mL tubes
microcentrifuge, room temperatureEppendorf5424Or equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotor for 1.5 mL and 2 mL microcentrifuge tubes
Microcon DNA Fast Flow Centrifugal Filter UnitsEMD MilliporeMRCFOR100
Miracloth, 1 square per sample cut to fit funnelEMD Millipore475855
NEBNext Microbiome DNA Enrichment KitNew England BiolabsE2612L
parafilmParafilm MPM992
plastic pots and trays
polyvinylpyrrolidone (PVP)FisherBP431-100
Proteinase KQiagen19131
Pulsed-Field Gel Electrophoresis rig (e.g. CHEF DR III)Bio-Rad1703697
purification beads, Agencourt AMpureXP beadsBeckman CoulterA63881
QIAamp DNA Mini KitQiagen51304
Qiagen 20/g Genomic Tip DNA Extraction KitQiagen10223
Qiagen Buffer EB (elution buffer)Qiagen19086
Qiagen DNA Extraction Buffer SetQiagen19060
QiaRackQiagen19015
qPCR machine (e.g. Roche Light Cycler 480)Roche
qPCR plate sealing filmRoche4729757001
qPCR plate, 96 well plateRoche4729692001
Qubit assay tubesLife TechnologiesQ32856
Qubit Broad Spectrum assay kitLife TechnologiesQ32850
Qubit High Sensitivity assay kitLife TechnologiesQ32851
RNaseAQiagen19101
Serological pipettes (20 mL) and pipet-aidFisher13-678-11
Small funnels, 1 per sample
Sodium ChlorideAmbionAM9759
Soft paintbrush, 2 per sample
SPEX SamplePrep 2010 Geno/Grinder or another type of tissue homogenizerSPEX SamplePrepOr another comparable tissue homogenizer. If you do not have access to a tissue homogenizer, then grinding in a pre-chilled mortar and pestle will suffice (see protocol for details). However, a homogenizer will give more consistent results and total homogenization time is reduced.
SucroseOmnipure8550
TBE
thermomixer
TrisSigmaT2819-100ml
Triton X-100PromegaH5142
tube rotater
tubes, 50 mL conical polypropyleneCorning352070
tubes, 50 mL high-speed polypropylene ThermoScientific/Nalgene3119-0050e.g. Nalgene Oakridge tubes or equivalent
vermiculite
water bath
water, sterile and certified Nuclease-free Fisher1481
water, sterile milliQ

References

  1. Liberatore, K. L., Dukowic-Schulze, S., Miller, M. E., Chen, C., Kianian, S. F. The role of mitochondria in plant development and stress tolerance. Free Radic Biol Med. 100, 238-256 (2016).
  2. Samaniego Castruita, J. A., Zepeda Mendoza, M. L., Barnett, R., Wales, N., Gilbert, M. T. Odintifier--A computational method for identifying insertions of organellar origin from modern and ancient high-throughput sequencing data based on haplotype phasing. BMC Bioinformatics. 16 (232), 1-13 (2015).
  3. Zhang, T., Zhang, X., Hu, S., Yu, J. An efficient procedure for plant organellar genome assembly, based on whole genome data from the 454 GS FLX sequencing platform. Plant Methods. 7 (38), 1-8 (2011).
  4. Wambugu, P. W., Brozynska, M., Furtado, A., Waters, D. L., Henry, R. J. Relationships of wild and domesticated rices (Oryza AA genome species) based upon whole chloroplast genome sequences. Sci Rep. 5 (13957), 1-9 (2015).
  5. Iorizzo, M., et al. De novo assembly of the carrot mitochondrial genome using next generation sequencing of whole genomic DNA provides first evidence of DNA transfer into an angiosperm plastid genome. BMC Plant Biol. 12 (61), 1-17 (2012).
  6. Park, S., et al. Complete sequences of organelle genomes from the medicinal plant Rhazya stricta (Apocynaceae) and contrasting patterns of mitochondrial genome evolution across asterids. BMC Genomics. 15 (405), 1-18 (2014).
  7. Skippington, E., Barkman, T. J., Rice, D. W., Palmer, J. D. Miniaturized mitogenome of the parasitic plant Viscum scurruloideum is extremely divergent and dynamic and has lost all nad genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (27), E3515-E3524 (2015).
  8. Wicke, S., Schneeweiss, G. M., Hörandl, E., Appelhans, M. Chapter 1. Next Generation Sequencing in Plant Systematics. , (2015).
  9. Sloan, D. B. One ring to rule them all? Genome sequencing provides new insights into the 'master circle' model of plant mitochondrial DNA structure. New Phytol. 200 (4), 978-985 (2013).
  10. Woloszynska, M. Heteroplasmy and stoichiometric complexity of plant mitochondrial genomes--though this be madness, yet there's method in't. J Exp Bot. 61 (3), 657-671 (2010).
  11. Ahmed, Z., Fu, Y. B. An improved method with a wider applicability to isolate plant mitochondria for mtDNA extraction. Plant Methods. 11 (56), 1-11 (2015).
  12. Ejaz, M., et al. Comparison of small scale methods for the rapid and efficient extraction of mitochondrial DNA from wheat crop suitable for down-stream processes. Genet Mol Res. 13 (4), 10320-10331 (2014).
  13. Eubel, H., Heazlewood, J. L., Millar, A. H. Isolation and subfractionation of plant mitochondria for proteomic analysis. Methods Mol Biol. 355, 49-62 (2007).
  14. Hao, W., Fan, S., Hua, W., Wang, H. Effective extraction and assembly methods for simultaneously obtaining plastid and mitochondrial genomes. PLoS One. 9 (9), e108291 (2014).
  15. Pomeroy, M. K. Studies on the respiratory properties of mitochondria isolated from developing winter wheat seedlings. Plant Physiol. 53 (4), 653-657 (1974).
  16. Taylor, N. L., Stroher, E., Millar, A. H. Arabidopsis organelle isolation and characterization. Methods Mol Biol. 1062, 551-572 (2014).
  17. Triboush, S. O., Danilenko, N. G., Davydenko, O. G. A method for isolation of chloroplast DNA and mitochondrial DNA from Sunflower. Plant Mol Biol Rep. 16 (2), 183-189 (1998).
  18. Pinard, R., et al. Assessment of whole genome amplification-induced bias through high-throughput, massively parallel whole genome sequencing. BMC Genomics. 7 (216), 1-21 (2006).
  19. Lamble, S., et al. Improved workflows for high throughput library preparation using the transposome-based Nextera system. BMC Biotechnol. 13 (104), 1-10 (2013).
  20. Raley, C., et al. Preparation of next-generation DNA sequencing libraries from ultra-low amounts of input DNA: Application to single-molecule, real-time (SMRT) sequencing on the Pacific Biosciences RS II. bioRxiv. , (2014).
  21. Tsai, Y. C., et al. Resolving the Complexity of Human Skin Metagenomes Using Single-Molecule Sequencing. MBio. 7 (1), e01948 (2016).
  22. Feehery, G. R., et al. A method for selectively enriching microbial DNA from contaminating vertebrate host DNA. PLoS One. 8 (10), e76096 (2013).
  23. Yigit, E., Hernandez, D. I., Trujillo, J. T., Dimalanta, E., Bailey, C. D. Genome and metagenome sequencing: Using the human methyl-binding domain to partition genomic DNA derived from plant tissues. Appl Plant Sci. 2 (11), 1-6 (2014).
  24. Noyszewski, A. K., et al. Accelerated evolution of the mitochondrial genome in an alloplasmic line of durum wheat. BMC Genomics. 15 (67), 1-16 (2014).
  25. . QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook Available from: https://www.qiagen.com/ch/resources/ (2016)
  26. . User developed protocol: Isolation of genomic DNA from plants and filamentous fungi using the QIAGEN Genomic-tip - (EN) Available from: https://www.qiagen.com/ch/resources/ (2001)
  27. . QIAGEN Genomic DNA Handbook Available from: https://www.qiagen.com/ch/resources/ (2012)
  28. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  29. Ogihara, Y., et al. Structural dynamics of cereal mitochondrial genomes as revealed by complete nucleotide sequencing of the wheat mitochondrial genome. Nucleic Acids Res. 33 (19), 6235-6250 (2005).
  30. Ogihara, Y., et al. Structural features of a wheat plastome as revealed by complete sequencing of chloroplast DNA. Mol Genet Genomics. 266 (5), 740-746 (2002).
  31. International Wheat Genome Sequencing Consortium (IWGSC). A chromosome-based draft sequence of the hexaploid bread wheat (Triticum aestivum) genome. Science. 345 (6194), (2014).
  32. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  33. Bendich, A. J. Why do chloroplasts and mitochondria contain so many copies of their genome?. Bioessays. 6 (6), 279-282 (1987).
  34. Kumar, R. A., Oldenburg, D. J., Bendich, A. J. Changes in DNA damage, molecular integrity, and copy number for plastid DNA and mitochondrial DNA during maize development. J Exp Bot. 65 (22), 6425-6439 (2014).
  35. Ma, J., Li, X. Q. Organellar genome copy number variation and integrity during moderate maturation of roots and leaves of maize seedlings. Curr Genet. 61 (4), 591-600 (2015).
  36. Lang, E. G., et al. Simultaneous isolation of pure and intact chloroplasts and mitochondria from moss as the basis for sub-cellular proteomics. Plant Cell Rep. 30 (2), 205-215 (2011).
  37. Tobin, A. K. Subcellular fractionation of plant tissues. Isolation of chloroplasts and mitochondria from leaves. Methods Mol Biol. 59, 57-68 (1996).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

125ChloroplastDNA organola

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved