使用Cpf1的C-Brick DNA标准装配的方案

摘要

CRISPR相关蛋白Cpf1可以由专门设计的CRISPR RNA（crRNA）引导，以在所需位点切割双链DNA，产生粘性末端。基于此特点，建立了DNA组装标准（C-Brick），并详细介绍了其使用方法。

摘要

CRISPR相关蛋白Cpf1在CRISPR RNA（crRNA）的指导下切割双链DNA，产生粘性末端。由于这个特点，Cpf1已被用于建立称为C-Brick的DNA装配标准，其具有长识别位点和短瘢痕的优点。在标准C-Brick载体上，有四个Cpf1识别位点 - 前缀（T1和T2位点）和后缀（T3和T4位点） - 侧翼生物DNA部分。 T2和T3位点的切割产生互补的粘性末端，这允许用T2和T3位点组装DNA部分。同时，组装后部件之间产生短暂的"GGATCC"疤痕。由于新形成的质粒再次含有四个Cpf1切割位点，所以该方法允许DNA部分的迭代装配，这与BioBrick和BglBrick标准相似。概述使用C-Brick标准来组装DNA部分的程序在这里描述。 C-Brick标准可以被科学家，研究生和本科生甚至业余爱好者广泛使用。

引言

DNA生物部件的标准化对合成生物学的发展至关重要¹ 。 DNA组装过程的发展可以取代特设实验设计，并消除在遗传组分装配到更大系统中时出现的许多意想不到的结果。 BioBrick标准（BBF RFC 10）是最早提出的DNA装配标准之一。它使用前缀序列（含有EcoRI和XbaI切割位点）和后缀序列（含SpeI和PstI切割位点） ^2,3 。由于XbaI和SpeI具有互补性，所以用XbaI和SpeI切割的BioBrick DNA部件可以连接在一起，生成一个新的BioBrick，用于进一步的迭代装配。

已经使用BioBrick标准鉴定了一些缺陷⁴ 。例如，它产生8-bp的瘢痕在DNA部分之间，其不允许构建融合蛋白。此外，上述四种类型的6-bp限制性位点必须从DNA部分中去除，这是非常不方便的。 BglBrick标准是为了解决第一个问题而建立的。它产生6-bp"GGATCT"瘢痕，产生Gly-Ser并允许多个蛋白质或蛋白质结构域的融合。 iBrick被开发来处理第二个问题⁶ 。它使用识别长DNA序列的归巢内切核酸酶（HE）。由于HE识别位点在天然DNA序列中很少存在，所以iBrick标准可用于直接构建iBrick部分而不修改其DNA序列。然而，iBrick标准在DNA部分之间留下了21bp的瘢痕，这可能是其不受欢迎的原因。

近年来，群集定期交织的短回文重复序列（CRISPR）系统发展迅速^7,8 。在CRISPR相关（Cas）蛋白中，来自化脓性链球菌的 Cas9核酸内切酶现在被广泛使用。它主要引入具有钝端的双链DNA断裂（DSB） ⁹ 。

2015年，张和同事首次以Cpf1（来自Prevotella和Francisella 1的CRISPR）为特征。属于2类V型CRISPR-Cas系统，是CRISRP RNA（crRNA）引导型核酸内切酶¹⁰ 。与Cas9不同，Cpf1引入了具有4或5 nt 5'突出端的DSB ¹⁰ 。基于此特征，Cpf1用于开发DNA组装标准C-Brick ⁴ 。在C-Brick标准载体上，四个具有前缀T1 / T2和后缀T3 / T4的Cpf1靶位点位于生物部位的侧面;这与BioBrick标准相似。随着T2和T3位点的切割p导致互补的粘性末端，可以在部件之间产生"GGATCC"疤痕的同时执行DNA部件的迭代装配。值得注意的是，C-Brick标准有两个主要优点:识别长目标序列并留下短疤痕。由C-Brick产生的6bp"GGATCC"瘢痕编码Gly-Ser，其允许构建融合蛋白。此外，C-Brick标准也与BglBrick和BioBrick标准部分兼容。

研究方案

1.制备crRNA

1. 制备crRNA模板
   1. 将无RNase的水中的单个寡核苷酸（ 表1 ）重新悬浮至10μM的浓度。
   2. 加入22.5μL顶链寡核苷酸（ 表1中 T7-F），22.5μL底链寡核苷酸（ 表1 ）和5μL10x退火缓冲液至0.2mL PCR管。确保总体积为50μL。
      注意: 表1中显示了六种不同的底链寡核苷酸，每种寡核苷酸应与顶链T7-F单独配对。 表1中的小写字母表示要转录为crRNA指导序列的序列。可以使用10x Taq PCR缓冲液代替10x退火缓冲液。
   3. 将PCR管放入热循环仪中。
   4. 执行退火程序:95℃下初始变性5分钟，然后冷却从95-20℃，热循环仪每分钟降低1℃。
      注意:立即使用样品进行步骤1.2.1。
2. 转录和纯化的crRNA
   1. 加入38μL无RNase的水，8μL来自步骤1.1.4的模板，20μL5x T7转录缓冲液，20μLNTP混合物（10μM），4μL重组RNA酶抑制剂（RRI）和10μl μLT7 RNA聚合酶到1.5 mL微量离心管中。确保总体积为100μL。
   2. 将微量离心管放入37°C水浴过夜（约16 h）。
   3. 使用RNA清除和浓缩试剂盒来纯化转录的RNA;遵循制造商的协议。
   4. 用UV-Vis分光光度计定量RNA，并将RNA稀释至10μM浓度。立即使用样品或将其储存在-80°C。
      注意:crRNA序列s列于表2 。

2. C-Brick零件的构造（ 即将生物零件插入C砖标准矢量）

注意:此步骤有三个子步骤。对于短生物部分（ 如启动子和终止子），最好使用直接PCR方法将生物部位插入C-Brick标准载体⁴ 。整个矢量序列显示在补充数据中，前缀和后缀序列如图1所示 （下面的步骤2.1）。对于可以通过PCR容易获得的生物部位（ 例如，使用基因组DNA，质粒或从头合成的DNA序列的模板），最好使用无缝组装方法将生物部位插入C-Brick标准载体（下面的步骤2.2）。对于从BioBrick和BglBrick标准获得的那些部件，限制酶介导的消化和T4 DNA连接酶介导的连接可用于将生物部位插入C-Brick标准载体（下文的步骤2.3）。

1. 通过直接PCR扩增构建
   1. 设计和订购PCR扩增的寡核苷酸。
      注意:寡核苷酸的5'末端含有DNA部分的序列，寡核苷酸的3'末端含有载体序列（ 即，前向3'末端的"GGATCCACTAGTCTCTAGCTCG"和"GGATCCTTTCTCCTCTTTCTAG"在反向链中）。可以在寡核苷酸的5'端设计无突出端或〜20-bp突出端。具体的例子可以在以前的研究中找到。
   2. 将超纯水中的单个寡核苷酸重新悬浮至10μM的浓度。
   3. 在0.2 mL PCR管中，在冰上设置PCR反应:加入18μL超纯水，25μL2x PCR缓冲液，1μLdNTP（10μM），2.5μL来自步骤2.1.2的正向和反向引物（10μM），0.5μL作为模板的C-Brick标准载体（50ng）和0.5μL的高保真DNA聚合酶。确保总体积为50μL。
   4. 将管直接放入热循环仪中，启动热循环仪程序。立即使用样品或将其冷冻保存在-20°C。
   5. 热循环程序:98℃一个循环3分钟; 98℃30秒，55℃20秒，72℃2秒;在72℃下循环10分钟。将样品保持在16°C。
   6. 将9μL步骤2.1.4的混合物加入到1.5 mL微量离心管中。
   7. 加入1μLDpnI，并在37°C水浴中孵育1 h。
      注意:如果引物没有重叠序列，加入0.5μLT4多核苷酸激酶（PNK）和0.5μLT4 DNA连接酶，并孵育22°C水浴1 h。否则，如果引物含有〜20nt的重叠序列，则将DpnI处理的产物直接转化到大肠杆菌 （DH10B）感受态细胞中（步骤2.4）。线性化PCR产物将通过宿主中的重组系统进行环化。
   8. 立即使用样品或将其储存在-20°C。
2. 通过无缝组装施工
   1. 设计和订购PCR扩增的寡核苷酸。
      注意:寡核苷酸的3'末端含有DNA部分的末端序列，寡核苷酸的5'末端包含线性化C-Brick标准载体序列的末端（ 即 "CTAGAAAGAGGAGAAAGGATCC"为5'前端的末端和反义链5'端的"CGAGCTAGAGACTAGTGGATCC"）。具体的例子可以在以前的研究中找到。
   2. 重新挂起个人在超纯水中的寡核苷酸浓度为10μM。
   3. 在0.2 mL PCR管中，在冰上设置PCR反应:加入18μL超纯水，25μL2x PCR缓冲液，1μLdNTP（10μM），2.5μL正向和反向引物（10μM ），0.5μL的模板（20-500ng）和0.5μL的高保真DNA聚合酶。确保总体积为50μL。
   4. 将管直接放入热循环仪中，运行热循环仪程序。立即使用样品或将其冷冻保存在-20°C。
      注意:将热循环仪程序设置为:在98℃下一个循环3分钟;在98℃下30秒，55℃20秒（根据引物的退火温度）和在72℃下1分钟（根据生物部分的长度）30个循环;在72℃下循环10分钟。将样品保持在16°C。
   5. 使用PCR清理系统纯化PCR产物工具箱遵循制造商的协议。
   6. 用BamHI消化C-Brick标准载体:向微量离心管中加入34μL超纯水，10μL质粒（1μg），5μL10x缓冲液和1μLBamHI。在37℃下在水浴中孵育2小时。
   7. 使用凝胶清理系统套件净化上述产品;遵循制造商的协议。
   8. 加入2μL来自步骤2.2.7的线性化载体（50ng），5μL来自步骤2.2.4的片段（200ng），2μL5x无缝组装缓冲液和1μL无缝组装酶的无缝组装酶至1.5 mL微量离心管。确保总体积为10μL。
   9. 将其放在37°C水浴中30分钟。立即使用样品或将其冷冻保存在-20°C。
3. 通过限制酶介导的消化和T4 DNA连接酶介导的连接进行构建。
   注意:对于从BioBrick（步骤2.3.4-2.3.7）和BglBrick（步骤2.3.1-2.3.3）标准品获得的那些部分，可以使用限制酶介导的消化和T4 DNA连接酶介导的连接来插入生物部位成为C-Brick标准载体。
   1. 用BamHI和BglII对BglBrick标准品进行消化:向微量离心管中加入34μL超纯水，10μL质粒（2μg），5μL10x缓冲液3，0.5μLBamHI和0.5μLBglII。在37°C水浴中孵育2小时。
   2. 进行1％琼脂糖凝胶电泳，并使用凝胶清理系统试剂盒纯化该片段。
   3. 将片段和C-Brick标准载体连接:将2μL来自步骤2.1.12的线性化载体（50ng）和6μL来自步骤2.3.3的片段（200ng）加入到1.5mL微量离心管中。加入1μL10 x T4 DNA连接酶缓冲液和1μLT4 DNA连接酶。在22°C孵育2小时。立即使用样品或冻结e并将其储存在-20°C。
   4. 用XbaI和SpeI对BioBrick标准件进行摘录:向微量离心管中加入34μL超纯水，10μL质粒（2μg），5μL10x缓冲液，0.5μLXbaI和0.5μLSpeI。在37°C水浴中孵育2小时。
   5. 用XbaI和SpeI对C-Brick标准载体进行消化:向微量离心管中加入34μL超纯水，10μL质粒（1μg），5μL10x缓冲液，0.5μLXbaI和0.5μLSpeI 。在37°C水浴中孵育2小时。
   6. 进行1％琼脂糖凝胶电泳，并用凝胶清洗系统试剂盒纯化步骤2.3.4的片段和来自步骤2.3.5的线性化载体;遵循制造商的协议。
   7. 将片段和C-Brick载体连接:将2μL来自步骤2.3.5的线性化载体（50ng）和6μL来自步骤2.3.4的片段（200ng）加入到1.5mL微量离心管中。广告d 1μL10×T4 DNA连接酶缓冲液和1μLT4 DNA连接酶。在22°C孵育2小时。立即使用样品或将其冷冻保存在-20°C。
4. 加入10μL产品，步骤2.1.8,2.2.9,2.3.3或2.3.7进行大肠杆菌感受态细胞化学转化 （DH10B）。
5. 将几个克隆接种到5-mL液体Luria-Bertani（LB）管中，并在37℃下在振荡器（220rpm）上孵育过夜。
6. 使用质粒制备试剂盒提取质粒;遵循制造商的协议。
7. 通过Sanger测序鉴定正确的克隆¹¹ 。

3. C砖装配（ 图2 ）

1. 用Cpf1消化C-Brick载体
   1. 加入22.5μL不含RNase的水，4μL10x Cpf1缓冲液，10μL来自步骤2.6（1μg）的质粒，0.5μLRRI和1μl＃181;将Cpf1（5μM）的L加到1.5-mL微量离心管中。
      注意:Cpf1可以在以前的研究中按照协议在商业上购买或纯化⁴ 。
   2. 为了将外源DNA片段插入到T1和T2位点，加入1μL的crRNA-T2（10μM），并在37℃的水浴中孵育30分钟。 将 ddl crRNA-T1（10μM）和Cpf1（5μM）另外30分钟。
      注意:另外，为了将外源DNA片段插入T3和T4位点，加入1μL的crRNA-T3（10μM），并在37℃的水浴中孵育30分钟。再加入1μL的crRNA-T4（10μM）30分钟。
   3. 加入1μL热敏碱性磷酸酶，并将管在37°C水浴中孵育另外1 h。
   4. 进行琼脂糖凝胶电泳，并使用凝胶清理系统试剂盒纯化载体。立即使用样品或将其冷冻保存在-20°C。
2. 用Cpf1消化DNA片段
   1. 向1.5 mL微量离心管中加入21.5μL无RNase的水，4μL10x Cpf1缓冲液，10μL质粒，步骤2.6（2μg），0.5μLRRI和2μLCpf1（5μM）。
   2. 要将外来DNA片段插入T1和T2位点，加入1μL的crRNA-T1（10μM）和1μL的crRNA-T3（10μM），并在37℃的水浴中孵育2小时。
      注意:或者，加入1μL的crRNA-T2（10μM）和1μL的crRNA-T4（10μM），并在37℃的水浴中孵育2小时。
   3. 运行琼脂糖凝胶电泳，并使用凝胶清理系统套件纯化该片段。立即使用样品或将其冷冻保存在-20°C。
3. C砖组装和进一步验证
   1. 连接外来DNA片段和C-Brick载体:加入2μL线性化载体（50ng）和6μL来自步骤3.2.3的DNA片段（200ng）至1.5mL微量离心管。加入1μL10×T4 DNA连接酶缓冲液和1μLT4 DNA连接酶。在22°C孵育2小时。立即使用样品或将其冷冻保存在-20°C。
   2. 加入10μL连接产物（步骤3.3.1）进行大肠杆菌 （DH10B）感受态细胞的化学转化。
   3. 将几个克隆添加到5 mL液体LB管中，并在振荡器上以220 rpm和37°C孵育过夜。
   4. 使用质粒制备试剂盒提取质粒;遵循制造商的协议。
   5. 通过Sanger测序鉴定正确的克隆¹¹ 。
4. 执行新一轮C-Brick装配。步骤3.3.4中的正确克隆可以用作新的C-Brick向量或DNA部分，用于进一步迭代C-砖装配，遵循步骤3.1-3.3中相同的协议。
   注意:T2'和T3'它被设计为T2和T3站点的备份（ 图1a ）。对于从步骤2.3.7获得的质粒，只有T2'和T3'可用于C-Brick标准组装。

结果

该协议证明了三种生色蛋白盒（cjBlue（BBa_K592011），eforRed（BBa_K592012）和amilGFP（BBa_K592010））的组装。首先，将上述三种基因和终止子的编码序列分别克隆到C-Brick标准载体中。将短DNA部分，启动子和终止子通过PCR扩增引入到C-Brick载体中，使用在5'末端含有短DNA部分的引物。之后是自连接方法。首先从头合成三种染色体编码序列，然后通过无缝组装克隆到C-Bric...

讨论

该协议描述了DNA组装标准C-Brick的程序。该协议中最重要的一步是C-Brick标准向量的线性化;载体的不完全切割可能严重影响成功率。另外，虽然Cpf1主要以"18-23"切割模式切割目标DNA序列，但也检测到两个碱基附近的不准确的切割，这可能在DNA组装后引起少量突变。因此，需要Sanger测序来验证组装的构建体。

C-Brick组件的效率低于以前研究中已经描述的传统限制酶和连接方法

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Comercial Oligonucleotide	Sangon Biotech
10x Taq PCR Buffer	Transgen	#J40928
Ultra Pure Distilled Water	Invitrogen	10977-015
5x RNA Transcription Buffer	Thermo Scientific	K0441
T7 RNA polymerase	Thermo Scientific	#EP0111
NTP mixture	Sangon	#ND0056
RRI (Recombinant RNase Inhibitor)	Takara	2313A
RNA Clean & Concentrator-5	Zymo Research	R1015
UV-Vis Spectrometer	Thermo Scientific	Nano-Drop 2000c
2x Phanta Max Buffer	Vazyme	PB505	PCR buffer
dNTPs	Transgen	AD101
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase	Vazyme	P505-d1
Ezmax for One-step Cloning	Tolobio	24303-1	seamless assembly kit
5x Buffer for Ezmax One-step Cloning	Tolobio	32006
BamHI	NEB	#R0136L
BamHI-HF	NEB	#R3136L
BglII	NEB	#R0144L
XbaI	NEB	#R0145L
SpeI	NEB	#R3133L
10x Buffer 3	NEB	#B7003S
10x CutSmart Buffer	NEB	B7204S
10x T4 DNA ligase Buffer	Tolobio	32002
T4 PNK	Tolobio	32206
T4 DNA ligase	Tolobio	32210
DpnI	NEB	#R01762
SV Gel and PCR clean-up system	Promega	A9282
Plasmid Mini Kit I	Omega	D6943-02	plasmid preparation kit
thermosensitive alkaline phosphatase	Thermo Scientific	#EF0651	FastAP
10x Cpf1 buffer	Tolobio	32008
Cpf1	Tolobio	32105	FnCpf1
thermocycler	Applied Biosystems	veriti 96 well
C-Brick standard vector	Tolobio	98101
E. coli [DH10B]	Invitrogen	18297010
Luria-Bertani media (tryptone)	Oxoid	LP0042
Luria-Bertani media (yeast extract)	Oxoid	LP0021
Luria-Bertani media (NaCl)	Sangon Biotech	B126BA0007