Cpf1を用いたC-ブリックDNA標準アセンブリのプロトコール

要約

CRISPR関連タンパク質Cpf1は、特別に設計されたCRISPR RNA（crRNA）によって導かれ、所望の部位で二本鎖DNAを切断し、粘着末端を生成する。この特性に基づいて、DNAアセンブリ標準（C-Brick）が確立され、その使用方法を詳述したプロトコルがここに記載されている。

要約

CRISPR関連タンパク質Cpf1は、CRISPR RNA（crRNA）の誘導下で二本鎖DNAを切断し、粘着末端を生成する。この特徴のために、Cpf1は、長い認識部位および短い傷跡の利点を有するC-ブリックと呼ばれるDNAアセンブリ標準の確立に用いられてきた。標準的なC-Brickベクターには、接頭部（T1およびT2部位）および接尾部（T3およびT4部位） - 隣接する生物学的DNA部分の4つのCpf1認識部位がある。 T2およびT3部位の切断は相補的な粘着末端を生成し、T2およびT3部位を有するDNA部分のアセンブリを可能にする。一方、組立後に部品間に短い「GGATCC」傷が発生する。新たに形成されたプラスミドが再び4つのCpf1切断部位を含むので、この方法は、BioBrickおよびBglBrick標準のものと同様のDNA部分の反復的組み立てを可能にする。 DNA部品を組み立てるためのC-Brick標準の使用法の概要ここで説明します。 C-Brick標準は、科学者、大学院生、学部生、さらにはアマチュアでも広く使用できます。

概要

DNA生物学的部分の標準化は、合成生物学の発展にとって重要である¹ 。 DNAアセンブリ手順の開発は、 臨機応変な実験設計に取って代わることができ、遺伝的構成要素をより大きなシステムに組み立てる際に生じる予想外の結果の多くを除去することができる。 BioBrick標準（BBF RFC 10）は、最も初期に提案されたDNAアセンブリ標準の1つでした。これは接頭配列（EcoRIおよびXbaI切断部位を含む）および接尾配列（SpeIおよびPstI切断部位を含む） ^{2,3を使用する} 。 XbaIとSpeIは相補的な凝集末端を有するため、XbaIとSpeIで切断されたBioBrick DNA部分を結合して、さらなる反復アセンブリのための新しいBioBrickを生成することができる。

BioBrick標準を使用していくつかの欠陥が確認されています⁴ 。例えば、8-bpの傷跡を生じる融合タンパク質の構築を可能にしないDNA部分の間に存在する。さらに、上記の4種類の6bpの制限部位をDNA部分から除去しなければならず、これは非常に不便である。最初の問題を解決するためにBglBrick標準が確立されました⁵ 。これは、6-bpの「GGATCT」傷跡を作り、Gly-Serを産生し、複数のタンパク質またはタンパク質ドメインの融合を可能にする。 iBrickは第2の問題に対処するために開発されました⁶ 。長いDNA配列を認識するホーミングエンドヌクレアーゼ（HE）を使用します。 HE認識部位は天然のDNA配列にほとんど存在しないので、iBrick標準は、DNA配列を改変することなくiBrick部位の直接構築に使用することができる。しかし、iBrickスタンダードはDNA部分の間に21 bpの傷跡を残します。これは、その不評の理由です。

近年、クラスタリングされた規則的に間隔を置いた短い回文繰り返し（CRISPR）システムが急速に発展した。 CRISPR関連（Cas）タンパク質の中で、 ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）由来のCas9エンドヌクレアーゼが現在広く使用されている。大部分は、平滑末端を有する二本鎖DNA切断（DSB）を導入する⁹ 。

2015年に、Zhangと共同研究者は、Cpf1（ PrevotellaとFrancisellaの CRISPR）を初めて特徴付けました 。それはクラス2型V CRISPR-Cas系に属し、CRISRP RNA（crRNA）誘導エンドヌクレアーゼ^10である。 Cas9とは異なり、Cpf1は、4または5ntの5 'オーバーハング^10を有するDSBを導入する。この特性に基づいて、Cpf1を用いてDNAアセンブリ標準C-Brick ⁴を開発した。 C-ブリック標準ベクターでは、接頭語T1 / T2および接尾辞付きT3 / T4の4つのCpf1標的部位が生物学的部分に隣接する。これはBioBrick標準に似ています。 T2およびT3部位の切断として、p相補的な粘着末端を生じるので、DNA部分の反復アセンブリを実施することが可能であり、一方パーツ間に「GGATCC」傷を生成することが可能である。特に、C-Brick標準には2つの主な利点があります。長いターゲットシーケンスを認識し、短い傷跡を残します。 C-ブリックによって生成された6bpの「GGATCC」傷は、融合タンパク質の構築を可能にするGly-Serをコードする。さらに、C-Brick標準もBglBrickおよびBioBrick標準と部分的に互換性があります。

プロトコル

1.crRNAの調製

1. crRNAテンプレートの調製
   1. RNアーゼフリー水中の個々のオリゴヌクレオチド（ 表1 ）を10μMの濃度に再懸濁する。
   2. 22.5μLのトップストランドオリゴヌクレオチド（ 表1の T7-F）、22.5μLのボトムストランドオリゴヌクレオチド（ 表1 ）、および5μLの10×アニーリングバッファーを0.2mLのPCRチューブに加える。総容量が50μLであることを確認する。
      注：6つの異なるボトムストランドオリゴヌクレオチドが表1に示されており、その各々は、トップストランドT7-Fと個々に対合されるべきである。 表1の小文字は、crRNAのガイド配列に転写される配列を表す。 10x Taq PCRバッファーを10xアニーリングバッファの代わりに使用することができます。
   3. PCRチューブをサーモサイクラーに入れる。
   4. アニーリングプログラムを実行する：95℃での最初の変性5分間、次いで95-20℃の冷却時間（サーマルサイクラーで1分当たり1℃の減少）であった。
      注：すぐにステップ1.2.1のサンプルを使用してください。
2. crRNAの転写および精製
   1. RNaseフリー水38μL、ステップ1.1.4の鋳型8μL、5×T7転写バッファー20μL、NTP混合物（10μM）20μL、組換えRNase阻害剤（RRI）4μL、および10 μLのT7 RNAポリメラーゼを1.5mLのマイクロ遠心チューブに添加した。総容量が100μLであることを確認してください。
   2. マイクロ遠心チューブを37℃の水浴に一晩（約16時間）置く。
   3. 転写されたRNAを精製するには、RNAクリーンアップキットと濃縮キットを使用してください。製造元のプロトコルに従ってください。
   4. UV-Vis分光光度計でRNAを定量し、RNAを10μMの濃度に希釈する。すぐにサンプルを使用するか、-80°Cで保存してください。
      注：crRNA配列表2にリストされています。

2.C-ブリック部品の構成（ すなわち、 C-ブリック標準ベクトルへの生物学的部品の挿入）

注：この手順には3つのサブステップがあります。短い生物学的部分（ 例えば、プロモーターおよびターミネーター）については、ダイレクトPCR法を使用して、生物学的部分をC-ブリック標準ベクターに挿入することが最善である⁴ 。補足データにはベクター全体の配列が示されており、接頭辞と接尾辞の配列は図1に示されています （下のステップ2.1）。 PCR（ 例えば、ゲノムDNA、プラスミド、または新しく合成されたDNA配列の鋳型を用いて）を介して容易に得ることができる生物学的部分に関しては、C-Brick標準ベクターに生物学的部分を挿入するために継ぎ目のないアセンブリ方法を使用することが最もよい（ステップ2.2、以下）。 BioBrickおよびBglBrick標準から得られた部分については、制限酵素媒介消化およびT4 DNAリガーゼ媒介ライゲーションを用いて、生物学的部分をC-ブリック標準ベクターに挿入することができる（以下の工程2.3）。

1. 直接PCR増幅による構築
   1. PCR増幅のためのオリゴヌクレオチドの設計および注文。
      注：オリゴヌクレオチドの5 '末端はDNA部分の配列を含み、オリゴヌクレオチドの3'末端はベクター配列（ すなわち、フォワード鎖の3 '末端に「GGATCCACTAGTCTCTAGCTCG」を含み、そしてフォワード鎖の「GGATCCTTTCTCCTCTTTCTAG」逆鎖の場合）。オリゴヌクレオチドの5 '末端にオーバーハングがないか、約20bpのオーバーハングを設計することができる。特定の例は、以前の研究^4に見出すことができる。
   2. 超純水中の個々のオリゴヌクレオチドを10μMの濃度に再懸濁する。
   3. 氷上で0.2 mLのPCRチューブでPCR反応をセットアップする：18μLの超純水、25μLの2×PCR緩衝液、1μLのdNTP（10μM）、ステップ2.1.2からのフォワード及びリバースプライマー（10μM）各2.5μL、鋳型としてのC-ブリック標準ベクター（50ng）0.5μL、高忠実度のDNAポリメラーゼの使用。総容量が50μLであることを確認する。
   4. チューブをサーモサイクラーに直接入れ、サーモサイクラープログラムを開始します。サンプルを直ちに使用するか、-20℃で凍結保存してください。
   5. サーモサイクラープログラム：98℃で3分間1サイクル; 98℃で10秒、55℃で20秒、および72℃で2分のサイクルを30サイクル; 72℃で10分間1サイクル。サンプルを16℃に保つ。
   6. ステップ2.1.4からの混合物9μLを1.5mL微量遠心管に加える。
   7. 1μLのDpnIを添加し、37℃の水浴中で1時間インキュベートする。
      注：プライマーに重複配列がない場合は、0.5μLのT4ポリヌクレオチドキナーゼ（PNK）と0.5μLのT4 DNAリガーゼを添加し、1時間22℃の水浴。そうでなければ、プライマーが約20nt重複配列を含む場合、DpnI処理産物を大腸菌 （DH10B）コンピテント細胞に直接形質転換する（工程2.4）。線状化されたPCR産物は、宿主内の組換え系によって環化される。
   8. すぐにサンプルを使用するか、-20℃で保存してください。
2. シームレスな組み立てによる構造
   1. PCR増幅のためのオリゴヌクレオチドの設計および注文。
      注：オリゴヌクレオチドの3 '末端はDNA部分の末端配列を含み、オリゴヌクレオチドの5'末端は線状化されたC-ブリック標準ベクター配列の末端を含む（ すなわち、 5 '末端には 「CTAGAAAGAGGAGAAAGGATCC」、フォワードストランドの5 '末端のための「CGAGCTAGAGACTAGTGGATCC」）。特定の例は、以前の研究^4に見出すことができる。
   2. 個体を再停止する超純水中の10μMのオリゴヌクレオチドを10μMの濃度に希釈した。
   3. 超純水18μL、2×PCRバッファー25μL、dNTPs（10μM）1μL、フォワードおよびリバースプライマー（10μM）の各2.5μLを加えます。 ）、0.5μLの鋳型（20〜500ng）、および0.5μLの高忠実度DNAポリメラーゼを添加した。総容量が50μLであることを確認する。
   4. チューブをサーモサイクラーに直接置き、サーモサイクラープログラムを実行してください。サンプルを直ちに使用するか、-20℃で凍結保存してください。
      注：サーモサイクラープログラムを次のように設定します：98℃で3分間1サイクル; 98℃で10秒間、プライマーのアニーリング温度に応じて55℃で20秒間、および72℃で1分間（生物学的部位の長さに応じて）30サイクル; 72℃で10分間1サイクル。サンプルを16℃に保つ。
   5. PCR精製システムを使用してPCR産物を精製する。テンキット;製造元のプロトコルに従ってください。
   6. C-ブリック標準ベクターをBamHIで消化します：34μLの超純水、10μLのプラスミド（1μg）、5μLの10倍緩衝液、および1μLのBamHIをマイクロ遠心チューブに加えます。 37℃で2時間、水浴中でインキュベートする。
   7. ゲルクリーンアップシステムキットを使用して上記の生成物を精製する。製造元のプロトコルに従ってください。
   8. ステップ2.2.7からの線状化ベクター（50ng）2μL、ステップ2.2.4からのフラグメント（200ng）の5μL、シームレス組立キットからの5x継ぎ目のないアセンブリ緩衝液2μLおよびシームレス組立酵素1μLを加える。 1.5 mLのマイクロ遠心チューブに加えます。総容量は10μLです。
   9. これを37℃の水浴に30分間置く。サンプルを直ちに使用するか、-20℃で凍結保存してください。
3. 制限酵素媒介消化およびT4 DNAリガーゼ媒介性連結による構築。
   注意：BioBrick（ステップ2.3.4-2.3.7）およびBglBrick（ステップ2.3.1-2.3.3）標準から得られた部分については、制限酵素媒介消化およびT4DNAリガーゼ媒介ライゲーションを使用して、生物学的部分をC-ブリック標準ベクターに組み込む。
   1. BglHIおよびBglIIでBglBrick標準品を消化する：超純水34μL、プラスミド10μL（2μg）、10倍バッファー5μL、BamHI0.5μLおよびBglII0.5μLをマイクロ遠心チューブに加えます。 37℃の水浴中で2時間インキュベートする。
   2. 1％アガロースゲル電気泳動を行い、ゲルクリーンアップシステムキットを用いてフラグメントを精製する。
   3. フラグメントとC-Brick標準ベクターをライゲーションする：ステップ2.1.12の線状化ベクター（50ng）2μLとステップ2.3.3のフラグメント（200ng）6μLを1.5mLマイクロ遠心チューブに加える。 10μLの10×T4 DNAリガーゼバッファーと1μLのT4 DNAリガーゼを加えます。 22℃で2時間インキュベートする。すぐにサンプルを使用するかフリーズする-20℃で保存してください。
   4. XbaIおよびSpeIでBioBrick標準品を消化する：超純水34μL、プラスミド10μL（2μg）、10倍バッファー5μL、XbaI0.5μLおよびSpeI0.5μLをマイクロ遠心チューブに加えます。 37℃の水浴中で2時間インキュベートする。
   5. C-ブリック標準ベクターをXbaIとSpeIで消化します：34μLの超純水、10μLのプラスミド（1μg）、5μLの10倍緩衝液、0.5μLのXbaI、および0.5μLのSpeIをマイクロ遠心チューブに加えます。 37℃の水浴中で2時間インキュベートする。
   6. 1％アガロースゲル電気泳動を行い、ゲル精製システムキットを用いて、ステップ2.3.4のフラグメントおよびステップ2.3.5の直線化ベクターを精製する。製造業者のプロトコールに従って調製した。
   7. フラグメントとC-Brickベクターをライゲーションする：ステップ2.3.5の線状化ベクター（50ng）2μLとステップ2.3.4のフラグメント（200ng）6μLを1.5mL微量遠心チューブに加える。広告d1μLの10×T4 DNAリガーゼ緩衝液および1μLのT4 DNAリガーゼ。 22℃で2時間インキュベートする。サンプルを直ちに使用するか、-20℃で凍結保存してください。
4. 大腸菌 （DH10B）のコンピテント細胞への化学的形質転換のために、ステップ2.1.8,22.9,2.3.3または2.3.7からの生成物10μLを添加する。
5. いくつかのクローンを5 mL液体Luria-Bertani（LB）チューブに取り、37℃でシェーカー（220 rpm）で一晩インキュベートする。
6. プラスミド調製キットを用いてプラスミドを抽出する。製造元のプロトコルに従ってください。
7. サンガー配列決定による正しいクローンの同定¹¹ 。

3. C-ブリックアセンブリ（ 図2 ）

1. C-BrickベクターのCpf1による消化
   1. RNaseフリー水22.5μL、10x Cpf1緩衝液4μL、ステップ2.6のプラスミド（1μg）10μL、RRI0.5μL、および1＆＃181; LのCpf1（5μM）を1.5mLのマイクロ遠心チューブに添加する。
      注：Cpf1は、市販のものを購入することも、前の研究^4のプロトコルに従って精製することもできます⁴ 。
   2. T1およびT2部位に外来DNA断片を挿入するには、1μLのcrRNA-T2（10μM）を添加し、37℃の水浴中で30分間インキュベートします。さらに30分間、1μLのcrRNA-T1（10μM）およびCpf1（5μM）を添加する。
      注：T3およびT4部位に外来DNA断片を挿入するには、1μLのcrRNA-T3（10μM）を添加し、37℃の水浴中で30分間インキュベートします。 1μLのcrRNA-T4（10μM）をさらに30分間添加する。
   3. 1μLの感熱アルカリ性ホスファターゼを添加し、チューブを37℃の水浴中でさらに1時間インキュベートする。
   4. アガロースゲル電気泳動を行い、ゲルクリーンアップシステムキットを用いてベクターを精製する。サンプルを直ちに使用するか、-20℃で凍結保存してください。
2. Cpf1によるDNA断片の消化
   1. RNaseフリー水21.5μL、10x Cpf1バッファー4μL、ステップ2.6（2μg）のプラスミド10μL、RRI0.5μL、およびCpf1（5μM）2μLを1.5mL微量遠心管に加えます。
   2. T1およびT2部位に外来DNA断片を挿入するには、1μLのcrRNA-T1（10μM）と1μLのcrRNA-T3（10μM）を添加し、37℃の水浴中で2時間インキュベートする。
      注：あるいは、1μLのcrRNA-T2（10μM）と1μLのcrRNA-T4（10μM）を添加し、37℃の水浴中で2時間インキュベートする。
   3. アガロースゲル電気泳動を行い、ゲルクリーンアップシステムキットを用いてフラグメントを精製する。サンプルを直ちに使用するか、-20℃で凍結保存してください。
3. C-ブリックアセンブリとさらなる検証
   1. 外来DNA断片とC-Brickベクターをライゲーションします：2μLの線状化ベクター（50ng）およびステップ3.2.3のDNAフラグメント（200ng）6μLを1.5mL微量遠心チューブに添加する。 1×10 4個のT4 DNAリガーゼバッファーと1μLのT4 DNAリガーゼを加えます。 22℃で2時間インキュベートする。サンプルを直ちに使用するか、-20℃で凍結保存してください。
   2. 大腸菌 （DH10B） - コンピテント細胞への化学的形質転換のために10μLのライゲーション産物（段階3.3.1）を添加する。
   3. いくつかのクローンを5mL液体LBチューブに加え、シェーカー上で220 rpm、37℃で一晩インキュベートする。
   4. プラスミド調製キットを用いてプラスミドを抽出する。製造元のプロトコルに従ってください。
   5. サンガー配列決定による正しいクローンの同定¹¹ 。
4. C-Brickアセンブリの新しいラウンドを実行します。手順3.3.4の正しいクローンは、手順3.1-3.3と同じプロトコルに従い、さらなる反復C-ブリックアセンブリのための新しいC-ブリックベクターまたはDNA部分として使用することができる。
   注：T2 'とT3のitesはT2サイトとT3サイトのバックアップとして設計されています（ 図1a ）。ステップ2.3.7から得られたプラスミドについては、C-Brick標準アセンブリのためにT2 'およびT3'のみを使用することができる。

結果

このプロトコールは、3つの色素タンパク質カセット（cjBlue（BBa_K592011）、eforRed（BBa_K592012）、およびamilGFP（BBa_K592010））のアセンブリを実証した。最初に、上記の3つの遺伝子およびターミネーターのコード配列をC-ブリック標準ベクターに個々にクローニングした。短いDNA部分、プロモーターおよびターミネーターを、5 '末端に短いDNA部分を含むプライマーを...

ディスカッション

このプロトコールは、DNAアセンブリ標準C-ブリックの手順を記載する。このプロトコルの最も重要なステップは、C-Brick標準ベクトルの線形化です。ベクターの不完全な切断は、成功率に重大な影響を及ぼす可能性がある。さらに、Cpf1は、主に「18-23」切断パターンの標的DNA配列を切断するが、2つの塩基の近くの不正確な切断もまた検出され、DNAアセンブリ後に少数の突然変異を引き起こす可...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Comercial Oligonucleotide	Sangon Biotech
10x Taq PCR Buffer	Transgen	#J40928
Ultra Pure Distilled Water	Invitrogen	10977-015
5x RNA Transcription Buffer	Thermo Scientific	K0441
T7 RNA polymerase	Thermo Scientific	#EP0111
NTP mixture	Sangon	#ND0056
RRI (Recombinant RNase Inhibitor)	Takara	2313A
RNA Clean & Concentrator-5	Zymo Research	R1015
UV-Vis Spectrometer	Thermo Scientific	Nano-Drop 2000c
2x Phanta Max Buffer	Vazyme	PB505	PCR buffer
dNTPs	Transgen	AD101
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase	Vazyme	P505-d1
Ezmax for One-step Cloning	Tolobio	24303-1	seamless assembly kit
5x Buffer for Ezmax One-step Cloning	Tolobio	32006
BamHI	NEB	#R0136L
BamHI-HF	NEB	#R3136L
BglII	NEB	#R0144L
XbaI	NEB	#R0145L
SpeI	NEB	#R3133L
10x Buffer 3	NEB	#B7003S
10x CutSmart Buffer	NEB	B7204S
10x T4 DNA ligase Buffer	Tolobio	32002
T4 PNK	Tolobio	32206
T4 DNA ligase	Tolobio	32210
DpnI	NEB	#R01762
SV Gel and PCR clean-up system	Promega	A9282
Plasmid Mini Kit I	Omega	D6943-02	plasmid preparation kit
thermosensitive alkaline phosphatase	Thermo Scientific	#EF0651	FastAP
10x Cpf1 buffer	Tolobio	32008
Cpf1	Tolobio	32105	FnCpf1
thermocycler	Applied Biosystems	veriti 96 well
C-Brick standard vector	Tolobio	98101
E. coli [DH10B]	Invitrogen	18297010
Luria-Bertani media (tryptone)	Oxoid	LP0042
Luria-Bertani media (yeast extract)	Oxoid	LP0021
Luria-Bertani media (NaCl)	Sangon Biotech	B126BA0007