Protocolos para el ensamblaje estándar de ADN de C-Brick usando Cpf1

Resumen

La proteína Cpf1 asociada con CRISPR puede ser guiada por un ARN CRISPR (crRNA) especialmente diseñado para escindir ADN de doble hebra en los sitios deseados, generando extremos pegajosos. Basándose en esta característica, se estableció un estándar de ensamblaje de ADN (C-Brick), y se describe aquí un protocolo que detalla su uso.

Resumen

La proteína Cpf1 asociada a CRISPR cliva ADN de doble cadena bajo la guía de ARN CRISPR (CRRNA), generando extremos pegajosos. Debido a esta característica, Cpf1 se ha utilizado para el establecimiento de un estándar de ensamblaje de ADN llamado C-Brick, que tiene la ventaja de sitios de reconocimiento largos y cicatrices cortas. En un vector estándar de C-Brick, hay cuatro sitios de reconocimiento Cpf1 - el prefijo (sitios T1 y T2) y el sufijo (sitios T3 y T4) - partes flanqueantes de ADN biológico. La escisión de los sitios T2 y T3 produce extremos pegajosos complementarios, que permiten el ensamblaje de partes de ADN con sitios T2 y T3. Mientras tanto, se genera una cicatriz corta "GGATCC" entre las piezas después del montaje. Como el plásmido recién formado contiene de nuevo los cuatro sitios de escisión de Cpf1, el método permite el ensamblaje iterativo de partes de ADN, que es similar a las de los patrones de BioBrick y BglBrick. Un procedimiento que describe el uso de la norma C-Brick para ensamblar partes de ADNSe describe aquí. El estándar de C-Brick puede ser ampliamente utilizado por científicos, estudiantes de posgrado y de pregrado, e incluso aficionados.

Introducción

La estandarización de las partes biológicas del ADN es importante para el desarrollo de la biología sintética ¹ . El desarrollo de un procedimiento de ensamblaje de ADN puede reemplazar diseños experimentales ad hoc y eliminar muchos de los resultados inesperados que surgen durante el ensamblaje de componentes genéticos en sistemas más grandes. El estándar BioBrick (BBF RFC 10) fue uno de los primeros estándares de ensamblaje de ADN propuestos. Utiliza la secuencia de prefijo (que contiene sitios de corte EcoRI y XbaI) y la secuencia de sufijo (que contiene sitios de corte SpeI y PstI) ^{2 , 3} . Debido a que XbaI y SpeI tienen extremos cohesivos complementarios, las partes de ADN de BioBrick que se cortan con XbaI y SpeI se pueden unir, generando una nueva BioBrick para un montaje iterativo adicional.

Algunos defectos han sido identificados con el uso del estándar BioBrick ⁴ . Por ejemplo, produce una cicatriz de 8 pbEntre las partes de ADN, que no permite la construcción de proteínas en fusión. Además, los cuatro tipos de sitios de restricción de 6 pb mencionados anteriormente deben retirarse de las partes de ADN, lo cual es muy inconveniente. El estándar BglBrick se estableció para resolver el primer problema ⁵ . Crea una cicatriz de 6 pb "GGATCT", produciendo Gly-Ser y permitiendo la fusión de múltiples proteínas o dominios de proteínas. IBrick fue desarrollado para hacer frente al segundo problema ⁶ . Utiliza endonucleasas homing (HEs) que reconocen largas secuencias de ADN. Como los sitios de reconocimiento de HE rara vez existen en secuencias de ADN naturales, el estándar iBrick puede ser usado para la construcción directa de partes de iBrick sin modificar sus secuencias de ADN. Sin embargo, el estándar de iBrick deja una cicatriz de 21 pb entre las partes de ADN, lo que podría ser la razón de su impopularidad.

En los últimos años, las repeticiones palindrómicas cortas intercaladas con intervalos regulares (CRISPR) se ha desarrollado rápidamente ^{7 , 8} . Entre las proteínas asociadas a CRISPR (Cas), la endonucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes es ahora ampliamente utilizada. En su mayor parte introduce introducciones de doble cadena de ADN (DSB) con extremos romos ⁹ .

En 2015, Zhang y compañeros de trabajo caracterizaron Cpf1 (CRISPR de Prevotella y Francisella 1) por primera vez. Pertenece al sistema de tipo 2 CRISPR-Cas de tipo V y es una endonucleasa guiada por ARN de CRISRP (crRNA) ¹⁰ . A diferencia de Cas9, Cpf1 introduce un DSB con un 4 o 5 nt 5 'sobresaliente ¹⁰ . Basándose en esta característica, Cpf1 se utilizó para desarrollar un estándar de ensamblaje de ADN, C-Brick ⁴ . En un vector estándar de C-Brick, cuatro sitios objetivo Cpf1 de T1 / T2 prefijados y T3 / T4 sufijados flanquean las partes biológicas; Esto es similar al estándar BioBrick. Como la escisión de los sitios T2 y T3 pProduce extremos pegajosos complementarios, es posible realizar el montaje iterativo de partes de ADN mientras se genera una cicatriz "GGATCC" entre las partes. Cabe destacar que el estándar C-Brick tiene dos ventajas principales: reconocer secuencias largas de blanco y dejar cicatrices cortas. La cicatriz de 6 pb "GGATCC" generada por C-Brick codifica Gly-Ser, que permite la construcción de proteínas de fusión. Además, el estándar C-Brick es también parcialmente compatible con los estándares BglBrick y BioBrick.

Protocolo

1. Preparación de CRRNA

1. Preparación de plantillas de CRRNA
   1. Re-suspender los oligonucleótidos individuales ( Tabla 1 ) en agua libre de RNasa a una concentración de 10 μM.
   2. Se a~naden 22,5 μl de oligonucleótido de hebra superior (T7-F en la Tabla 1 ), 22,5 μl de oligonucleótido de cadena inferior ( Tabla 1 ) y 5 μl de tampón de recocido 10x a un tubo de PCR de 0,2 ml. Asegúrese de que el volumen total es de 50 μl.
      NOTA: En la Tabla 1 se muestran seis oligonucleótidos diferentes de hebras inferiores, cada uno de los cuales debería estar emparejado individualmente con la hebra superior T7-F. Las letras minúsculas de la Tabla 1 representan la secuencia a transcribir en la secuencia guía de CRRNA. Se puede usar tampón Taq PCR 10x en lugar del tampón de recocido 10x.
   3. Coloque el tubo de PCR en un termociclador.
   4. Ejecutar el programa de recocido: desnaturalización inicial a 95 ° C para5 min y luego un tiempo de reutilización de 95-20 ° C, con una disminución de 1 ° C por minuto en el termociclador.
      NOTA: Utilice inmediatamente las muestras para el paso 1.2.1.
2. Transcripción y purificación de CRRNA
   1. Se añaden 38 μl de agua libre de RNasa, 8 μl de la plantilla de la etapa 1.1.4, 20 μl de tampón de transcripción 5x T7, 20 μl de mezcla NTP (10 μM), 4 μl de inhibidor RNasa recombinante (RRI) y 10 μL Μl de ARN polimerasa T7 a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Asegúrese de que el volumen total es de 100 μL.
   2. Se pone el tubo de microcentrífuga en un baño de agua a 37 ° C durante la noche (durante aproximadamente 16 h).
   3. Utilice un kit de limpieza y concentración de ARN para purificar el ARN transcrito; Siga el protocolo del fabricante.
   4. Cuantificar los ARNs con espectrofotómetros UV-Vis y diluir el ARN a una concentración de 10 μ M. Utilice las muestras inmediatamente o almacénelas a -80 ° C.
      NOTA: La secuencia de CRRNAS se enumeran en la Tabla 2 .

2. Construcción de piezas de C-Brick ( es decir, la inserción de partes biológicas en un vector estándar de C-Brick)

NOTA: Este paso tiene tres sub-pasos. Para las partes biológicas cortas ( por ejemplo, promotores y terminadores), es mejor utilizar el método de PCR directa para insertar las partes biológicas en un vector estándar de C-Brick ⁴ . La secuencia completa del vector se muestra en los datos suplementarios, y la secuencia de prefijo y sufijo se muestra en la Figura 1 (paso 2.1, más adelante). Para las partes biológicas que pueden obtenerse fácilmente mediante PCR ( por ejemplo, con plantillas de ADN genómico, plásmidos o secuencias de ADN sintetizadas de novo ), es mejor utilizar el método de ensamblaje sin costuras para insertar las partes biológicas en un vector estándar de C-Brick (Paso 2.2, más adelante). Para las partes obtenidas de las normas BioBrick y BglBrick, la restricciónSe puede usar la digestión mediada por enzima y la ligación mediada por ligasa de T4-ADN para insertar las partes biológicas en un vector estándar de C-Brick (etapa 2.3, más adelante).

1. Construcción mediante amplificación directa por PCR
   1. Diseñar y ordenar oligonucleótidos para la amplificación por PCR.
      NOTA: El extremo 5 'del oligonucleótido contiene la secuencia de la parte de ADN, y el extremo 3' del oligonucleótido contiene la secuencia del vector ( es decir, "GGATCCACTAGTCTCTAGCTCG" en el extremo 3 'de la hebra delantera y "GGATCCTTTCTCCTCTTTCTAG" En la cadena inversa). En el extremo 5 'del oligonucleótido no se puede diseñar ningún saliente ni un saliente de 20 pb. Ejemplos específicos se pueden encontrar en un estudio previo ⁴ .
   2. Re-suspender oligonucleótidos individuales en agua ultra pura a una concentración de 10 μ M.
   3. Preparar reacciones de PCR en hielo en un tubo de PCR de 0,2 ml: añadir 18 μl de agua ultra pura, 25 μL de 2x P1 μl de dNTPs (10 μM), 2,5 μl de cada uno de los cebadores directos e inversos (10 μM) del paso 2.1.2, 0,5 μl de vector estándar C-Brick (50 ng) como molde y 0,5 μl De DNA polimerasa de alta fidelidad. Asegúrese de que el volumen total es de 50 μl.
   4. Coloque el tubo directamente en un termociclador e inicie el programa del termociclador. Utilizar las muestras inmediatamente o congelarlas y almacenarlas a -20 ° C.
   5. Programa termociclador: un ciclo durante 3 min a 98 ° C; Treinta ciclos durante 10 s a 98 ° C, 20 s a 55 ° C y 2 min a 72 ° C; Y un ciclo durante 10 min a 72 ° C. Mantenga la muestra a 16 ° C.
   6. Añadir 9 μl de la mezcla de la etapa 2.1.4 a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
   7. Añadir 1 μl de DpnI e incubar durante 1 h en un baño de agua a 37 ° C.
      NOTA: Si los cebadores no tienen secuencias solapadas, añada 0,5 μL de polinucleótido quinasa T4 (PNK) y 0,5 μL de T4 DNA ligasa e incube enUn baño de agua a 22 ° C durante 1 h. De lo contrario, si los cebadores contienen una secuencia de superposición de ~ 20 nt, transformar directamente los productos tratados con DpnI en células compatibles con E. coli (DH10B) (etapa 2.4). El producto de PCR linealizado será circularizado por el sistema de recombinación en el huésped.
   8. Utilice las muestras inmediatamente o guárdelas a -20 ° C.
2. Construcción a través de un montaje sin fisuras
   1. Diseñar y ordenar oligonucleótidos para la amplificación por PCR.
      NOTA: El extremo 3 'del oligonucleótido contiene la secuencia terminal de la parte de ADN y el extremo 5' del oligonucleótido contiene el terminal de la secuencia de vector estándar linealizada de C - Brick ( es decir, "CTAGAAAGAGGAGAAAGGATCC" para el extremo 5 ' -end de la cadena delantera y "CGAGCTAGAGACTAGTGGATCC" para el extremo 5 'de la cadena inversa). Ejemplos específicos se pueden encontrar en un estudio previo ⁴ .
   2. Re-suspender el individuoUal en agua ultrapura a una concentración de 10 μM.
   3. Preparar reacciones de PCR en hielo en un tubo de PCR de 0,2 ml: añadir 18 μl de agua ultra pura, 25 μL de tampón de PCR 2x, 1 μl de dNTP (10 μM), 2,5 μl de cada uno de los cebadores directos e inversos (10 μM ) De la etapa 2.2.2, 0,5 μl de plantilla (20-500 ng) y 0,5 μl de ADN polimerasa de alta fidelidad. Asegúrese de que el volumen total es de 50 μl.
   4. Coloque el tubo directamente en el termociclador y ejecute el programa del termociclador. Utilizar las muestras inmediatamente o congelarlas y almacenarlas a -20 ° C.
      NOTA: Ajuste el programa del termociclador a: un ciclo durante 3 min a 98 ° C; 30 ciclos durante 10 s a 98 ° C, 20 s a 55 ° C (según la temperatura de recocido del cebador) y 1 min (según la longitud de las partes biológicas) a 72 ° C; Y un ciclo durante 10 min a 72 ° C. Mantenga la muestra a 16 ° C.
   5. Purificar el producto de PCR utilizando un sistema de limpieza de PCRKit de temperatura; Siga el protocolo del fabricante.
   6. Digerir el vector estándar C-Brick con BamHI: añadir 34 μl de agua ultra pura, 10 μL de plásmido (1 μg), 5 μL de tampón 10x y 1 μl de BamHI al tubo de microcentrífuga. Incubar durante 2 h a 37 ° C en un baño de agua.
   7. Purificar el producto anterior usando un kit de sistema de limpieza de gel; Siga el protocolo del fabricante.
   8. Añadir 2 μl de vector linealizado (50 ng) de la etapa 2.2.7, 5 μl de fragmento (200 ng) de la etapa 2.2.4, 2 μl de tampón de ensamblaje sin costura 5x y 1 μl de enzima de ensamblaje sin costura de un kit de ensamblaje sin costura A un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Asegúrese de que el volumen total es de 10 μl.
   9. Colocar esto en un baño de agua a 37 ° C durante 30 min. Utilizar las muestras inmediatamente o congelarlas y almacenarlas a -20 ° C.
3. Construcción mediante digestión mediada por enzimas de restricción y ligación mediada por ligasa de T4 ADN.
   NOTA: Para las partes obtenidas de las normas BioBrick (etapa 2.3.4-2.3.7) y BglBrick (etapa 2.3.1-2.3.3), se puede utilizar la digestión mediada por enzimas de restricción y la ligación mediada por ligasa de T4-ADN para insertar la Biológicas en un vector estándar de C-Brick.
   1. Digerir las partes estándar de BglBrick con BamHI y BglII: añadir 34 μl de agua ultra pura, 10 μL de plásmido (2 μg), 5 μL de tampón 10x, 0,5 μL de BamHI y 0,5 μL de BglII en el tubo de microcentrífuga. Incubar durante 2 h en un baño de agua a 37 ° C.
   2. Ejecutar una electroforesis en gel de agarosa al 1% y purificar el fragmento usando un kit de sistema de limpieza de gel.
   3. Ligar el fragmento y el vector estándar de C-Brick: añadir 2 μl de vector linealizado (50 ng) de la etapa 2.1.12 y 6 μl de fragmento (200 ng) de la etapa 2.3.3 a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 1 μ l de 10 x T4 ADN ligasa buffer y 1 μ l de T4 DNA ligase. Incubar durante 2 h a 22 ° C. Utilice las muestras inmediatamente o freezE y almacenarlos a -20 ° C.
   4. Digerir las partes estándar de BioBrick con XbaI y SpeI: añadir 34 μL de agua ultra pura, 10 μL de plásmido (2 μg), 5 μL de tampón 10x, 0,5 μL de XbaI y 0,5 μL de SpeI al tubo de microcentrífuga. Incubar durante 2 h en un baño de agua a 37 ° C.
   5. Digerir el vector estándar de C-Brick con XbaI y SpeI: añadir 34 μL de agua ultrapura, 10 μL de plásmido (1 μg), 5 μl de tampón 10x, 0,5 μL de XbaI y 0,5 μl de SpeI al tubo de microcentrífuga . Incubar durante 2 h en un baño de agua a 37 ° C.
   6. Ejecutar una electroforesis en gel de agarosa al 1% y purificar el fragmento de la etapa 2.3.4 y el vector linealizado de la etapa 2.3.5 con un kit de sistema de limpieza de gel; Siguiendo el protocolo del fabricante.
   7. Ligar el fragmento y el vector C-Brick: añadir 2 μl de vector linealizado (50 ng) de la etapa 2.3.5 y 6 μl de fragmento (200 ng) de la etapa 2.3.4 a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. AnuncioD 1 μl de tampón de ADN ligasa 10 x T4 y 1 μl de ADN ligasa T4. Incubar durante 2 h a 22 ° C. Utilizar las muestras inmediatamente o congelarlas y almacenarlas a -20 ° C.
4. Añadir 10 μl de los productos de la etapa 2.1.8, 2.2.9, 2.3.3 o 2.3.7 para la transformación química en las células competentes de E. coli (DH10B).
5. Recoger varios clones a un líquido de 5 ml Luria-Bertani (LB) tubo e incubar a 37 ° C en un agitador (220 rpm) durante la noche.
6. Extraer el plásmido usando un kit de preparación de plásmido; Siga el protocolo del fabricante.
7. Identificar los clones correctos mediante la secuenciación de Sanger ¹¹ .

3. Ensamblaje del C-Brick ( Figura 2 )

1. Digestión del vector C-Brick con Cpf1
   1. Añadir 22,5 μl de agua libre de RNasa, 4 μl de tampón Cpf1 10x, 10 μl del plásmido de la etapa 2.6 (1 μg), 0,5 μL de RRI y 1 μg de# 181; L de Cpf1 (5 μM) a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
      NOTA: Cpf1 puede adquirirse comercialmente o purificarse siguiendo el protocolo en un estudio previo ⁴ .
   2. Para insertar un fragmento de ADN extraño en los sitios T1 y T2, añadir 1 μl de CRRNA-T2 (10 μM) e incubar en un baño de agua a 37 ° C durante 30 min. A dd 1 μ l de CRRNA-T1 (10 μ M) y Cpf1 (5 μ M) durante otros 30 min.
      NOTA: Alternativamente, para insertar un fragmento de ADN extraño en los sitios T3 y T4, añadir 1 μl de CRRNA-T3 (10 μM) e incubar en un baño de agua a 37 ° C durante 30 minutos. Añadir 1 μ l de CRRNA-T4 (10 μ M) durante otros 30 min.
   3. Añadir 1 μl de fosfatasa alcalina termosensible e incubar el tubo en un baño de agua a 37 ° C durante otras 1 h.
   4. Ejecutar una electroforesis en gel de agarosa y purificar el vector utilizando un kit de sistema de limpieza de gel. Utilizar las muestras inmediatamente o congelarlas y almacenarlas a -20 ° C.
La digestión del fragmento de ADN con Cpf1
1. Añadir 21,5 μl de agua libre de RNasa, 4 μl de tampón Cpf1 10x, 10 μL de plásmido de la etapa 2.6 (2 μg), 0,5 μL de RRI y 2 μl de Cpf1 (5 μM) a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
2. Para insertar un fragmento de ADN extraño en los sitios T1 y T2, añadir 1 μl de CRRNA-T1 (10 μM) y 1 μl de CRRNA-T3 (10 μM) e incubar en un baño de agua a 37 ° C durante 2 h.
   NOTA: Alternativamente, añada 1 μl de CRRNA-T2 (10 μM) y 1 μl de CRRNA-T4 (10 μM) e incube en un baño de agua a 37 ° C durante 2 h.
3. Ejecutar una electroforesis en gel de agarosa y purificar el fragmento usando un kit de sistema de limpieza de gel. Utilizar las muestras inmediatamente o congelarlas y almacenarlas a -20 ° C.
2. Ensamblaje de C-Brick y verificación adicional
   1. Ligar el fragmento de ADN extraño y el vector C-Brick: añadir 2 μl del vector linealizado (50 ng) de la etapa 3.1.4 y 6 μl del fragmento de ADN (200 ng) de la etapa 3.2.3 a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 1 μl de tampón de ADN ligasa 10 x T4 y 1 μl de ADN ligasa T4. Incubar durante 2 h a 22 ° C. Utilizar las muestras inmediatamente o congelarlas y almacenarlas a -20 ° C.
   2. Añadir 10 μl de los productos de ligación (etapa 3.3.1) para la transformación química en células competentes de E. coli (DH10B).
   3. Se agregan varios clones a un tubo LB líquido de 5 ml y se incuba durante la noche en un agitador a 220 rpm y 37ºC.
   4. Extraer el plásmido usando un kit de preparación de plásmido; Siga el protocolo del fabricante.
   5. Identificar los clones correctos mediante la secuenciación de Sanger ¹¹ .
3. Realice una nueva ronda de ensamblaje C-Brick. Los clones correctos de la etapa 3.3.4 pueden usarse como un nuevo vector de C-Brick o parte de ADN para un montaje iterativo de C-Brick adicional, siguiendo el mismo protocolo de los pasos 3.1-3.3.
   NOTA: T2 'y T3' sItes están diseñados como la copia de seguridad de los sitios T2 y T3 ( Figura 1a ). Para los plásmidos obtenidos de la etapa 2.3.7, sólo pueden utilizarse T2 'y T3' para el ensamblaje estándar de C-Brick.

Resultados

Este protocolo demostró el ensamblaje de tres casetes de cromoproteína (cjBlue (BBa_K592011), eforRed (BBa_K592012), y amilGFP (BBa_K592010)). En primer lugar, las secuencias codificantes de los tres genes y terminadores mencionados anteriormente se clonaron individualmente en un vector estándar de C-Brick. Partes cortas de ADN, promotor y terminador, se introdujeron en el vector C-Brick mediante amplificación por PCR usando cebadores que contenían las partes cortas de ADN en ...

Discusión

Este protocolo describe un procedimiento para el ensamblaje de ADN estándar C-Brick. El paso más importante en este protocolo es la linealización del vector estándar de C-Brick; La escisión incompleta del vector podría afectar seriamente la tasa de éxito. Adicionalmente, aunque Cpf1 escinde principalmente secuencias de ADN diana en el patrón de escisión "18-23", también se detectó una escisión imprecisa cerca de las dos bases ⁴ , lo que puede causar un pequeño número de mu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Comercial Oligonucleotide	Sangon Biotech
10x Taq PCR Buffer	Transgen	#J40928
Ultra Pure Distilled Water	Invitrogen	10977-015
5x RNA Transcription Buffer	Thermo Scientific	K0441
T7 RNA polymerase	Thermo Scientific	#EP0111
NTP mixture	Sangon	#ND0056
RRI (Recombinant RNase Inhibitor)	Takara	2313A
RNA Clean & Concentrator-5	Zymo Research	R1015
UV-Vis Spectrometer	Thermo Scientific	Nano-Drop 2000c
2x Phanta Max Buffer	Vazyme	PB505	PCR buffer
dNTPs	Transgen	AD101
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase	Vazyme	P505-d1
Ezmax for One-step Cloning	Tolobio	24303-1	seamless assembly kit
5x Buffer for Ezmax One-step Cloning	Tolobio	32006
BamHI	NEB	#R0136L
BamHI-HF	NEB	#R3136L
BglII	NEB	#R0144L
XbaI	NEB	#R0145L
SpeI	NEB	#R3133L
10x Buffer 3	NEB	#B7003S
10x CutSmart Buffer	NEB	B7204S
10x T4 DNA ligase Buffer	Tolobio	32002
T4 PNK	Tolobio	32206
T4 DNA ligase	Tolobio	32210
DpnI	NEB	#R01762
SV Gel and PCR clean-up system	Promega	A9282
Plasmid Mini Kit I	Omega	D6943-02	plasmid preparation kit
thermosensitive alkaline phosphatase	Thermo Scientific	#EF0651	FastAP
10x Cpf1 buffer	Tolobio	32008
Cpf1	Tolobio	32105	FnCpf1
thermocycler	Applied Biosystems	veriti 96 well
C-Brick standard vector	Tolobio	98101
E. coli [DH10B]	Invitrogen	18297010
Luria-Bertani media (tryptone)	Oxoid	LP0042
Luria-Bertani media (yeast extract)	Oxoid	LP0021
Luria-Bertani media (NaCl)	Sangon Biotech	B126BA0007