Protocolos para Montagem Padrão de DNA C-Brick Usando Cpf1

Resumo

A proteína Cpf1 associada ao CRISPR pode ser guiada por um ARN CRISPR especialmente concebido (crRAR) para escindir o DNA de cadeia dupla nos locais desejados, gerando extremidades pegajosas. Com base nessa característica, foi estabelecido um padrão de montagem de DNA (C-Brick), e um protocolo que detalha seu uso é descrito aqui.

Resumo

A proteína Cpf1 associada ao CRISPR cliva o DNA de cadeia dupla sob a orientação do ARN CRISPR (crRNA), gerando extremidades pegajosas. Por causa desta característica, o Cpf1 tem sido usado para o estabelecimento de um padrão de montagem de DNA chamado C-Brick, que tem a vantagem de longos sites de reconhecimento e cicatrizes curtas. Em um vetor C-Brick padrão, existem quatro sites de reconhecimento Cpf1 - o prefixo (sites T1 e T2) e o sufixo (sites T3 e T4) - partes biológicas de DNA flanqueando. A clivagem dos locais T2 e T3 produz extremidades adesivas complementares, que permitem a montagem de partes de DNA com sites T2 e T3. Enquanto isso, uma pequena cicatriz "GGATCC" é gerada entre partes após a montagem. À medida que o plasmídeo recém-formado contém novamente os quatro locais de clivagem Cpf1, o método permite a montagem iterativa de partes de DNA, que é semelhante à dos padrões BioBrick e BglBrick. Um procedimento descrevendo o uso do padrão C-Brick para montar peças de DNAÉ descrito aqui. O padrão C-Brick pode ser amplamente utilizado por cientistas, estudantes de graduação e graduação e até amadores.

Introdução

A padronização de partes biológicas do DNA é importante para o desenvolvimento da biologia sintética ¹ . O desenvolvimento de um procedimento de montagem de DNA pode substituir projetos experimentais ad hoc e remover muitos dos resultados inesperados que ocorrem durante a montagem de componentes genéticos em sistemas maiores. O padrão BioBrick (BBF RFC 10) foi um dos primeiros padrões de montagem de DNA propostos. Ele usa a seqüência de prefixo (contendo sites de corte EcoRI e XbaI) e a seqüência de sufixos (contendo sites de corte SpeI e PstI) ^{2 , 3} . Como XbaI e SpeI têm extremidades coesivas complementares, as partes de DNA BioBrick que são cortadas com XbaI e SpeI podem ser unidas, gerando um novo BioBrick para uma montagem iterativa adicional.

Alguns defeitos foram identificados com o uso do padrão BioBrick ⁴ . Por exemplo, produz uma cicatriz de 8 pbEntre as partes de DNA, o que não permite a construção de proteínas in-fusion. Além disso, os quatro tipos acima mencionados de sites de restrição de 6 pb devem ser removidos das partes de DNA, o que é muito inconveniente. O padrão BglBrick foi estabelecido para resolver o primeiro problema ⁵ . Ele cria uma cicatriz "GGATCT" de 6 pb, produzindo Gly-Ser e permitindo a fusão de múltiplas proteínas ou domínios protéicos. IBrick foi desenvolvido para lidar com o segundo problema ⁶ . Ele usa endonucleases homing (HEs) que reconhecem longas seqüências de DNA. Como os sites de reconhecimento HE raramente existem em seqüências de DNA naturais, o padrão iBrick pode ser usado para a construção direta de peças iBrick sem modificar suas seqüências de DNA. No entanto, o padrão iBrick deixa uma cicatriz de 21 pb entre as partes do DNA, o que pode ser o motivo da sua impopularidade.

Nos últimos anos, as repetições palindrômicas curtas regularmente intercaladas agrupadas (CRISPR) foi desenvolvido rapidamente ^{7 , 8} . Entre as proteínas associadas a CRISPR (Cas), a endonuclease Cas9 de Streptococcus pyogenes é amplamente utilizada. Ele apresenta principalmente interrupções de DNA de cadeia dupla (DSBs) com extremidades sem corte ⁹ .

Em 2015, Zhang e colaboradores caracterizaram o Cpf1 (CRISPR da Prevotella e Francisella 1) pela primeira vez. Ele pertence ao sistema CRISPR-Cas da classe 2 do tipo V e é uma endonuclease 10 CRISRP RNA (crRNA). Ao contrário de Cas9, o Cpf1 apresenta um DSB com uma subida de 5 ou 5 nt 5 '10. Com base nessa característica, Cpf1 foi usado para desenvolver um padrão de montagem de DNA, C-Brick ⁴ . Em um vetor padrão C-Brick, quatro locais alvo Cpf1 de T1 / T2 prefixados e T3 / T4 sufixos flanqueiam as partes biológicas; Isso é semelhante ao padrão BioBrick. Como a divisão dos sites T2 e T3 pRoduces extremidades adesivas complementares, é possível realizar a montagem iterativa de partes de DNA ao gerar uma cicatriz "GGATCC" entre as partes. Notavelmente, o padrão C-Brick tem duas vantagens principais: reconhecendo longas sequências alvo e deixando cicatrizes curtas. A cicatriz de 6 pb "GGATCC" gerada por C-Brick codifica Gly-Ser, que permite a construção de proteínas de fusão. Além disso, o padrão C-Brick também é parcialmente compatível com os padrões BglBrick e BioBrick.

Protocolo

1. Preparação de crRNA

1. Preparação de modelos CRRNA
   1. Re-suspenda os oligonucleótidos individuais ( Tabela 1 ) em água sem RNase até uma concentração de 10 uM.
   2. Adicionar 22,5 μL de oligonucleótido de cadeia superior (T7-F na Tabela 1 ), 22,5 μL de oligonucleótido de cadeia inferior ( Tabela 1 ) e 5 μL de tampão de recozimento 10x a um tubo de PCR de 0,2 mL. Certifique-se de que o volume total seja de 50 μL.
      NOTA: Seis diferentes oligonucleótidos de cadeia inferior são mostrados na Tabela 1 , cada um dos quais deve ser emparelhado individualmente com a T7-F de topo. As letras minúsculas na Tabela 1 representam a sequência a transcrever para a sequência guia de crRNA. 10x Taq PCR buffer pode ser usado em vez do 10x annealing buffer.
   3. Coloque o tubo de PCR em um termociclador.
   4. Execute o programa de recozimento: desnaturação inicial a 95 ° C para5 min e depois um tempo de enchimento de 95-20 ° C, com uma diminuição de 1 ° C por minuto no termociclador.
      NOTA: Imediatamente use as amostras para o passo 1.2.1.
2. Transcrição e purificação de crRNA
   1. Adicionar 38 μL de água sem RNase, 8 μL do molde do passo 1.1.4, 20 μL de tampão de transcrição 5x T7, 20 μL de mistura de NTP (10 μM), 4 μL de inibidor de RNase recombinante (RRI) e 10 ΜL de polimerase de ARN T7 para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Certifique-se de que o volume total seja de 100 μL.
   2. Coloque o tubo de microcentrífuga em banho-maria a 37 ° C durante a noite (por cerca de 16 h).
   3. Use um kit de limpeza e concentração de ARN para purificar o ARN transcrito; Siga o protocolo do fabricante.
   4. Quantificar os RNAs com espectrofotômetros UV-Vis e diluir o RNA para uma concentração de 10 μM. Use as amostras imediatamente ou guarde-as a -80 ° C.
      NOTA: A sequência crRNAS estão listados na Tabela 2 .

2. Construção de peças de C-Brick ( ou seja, a inserção de peças biológicas em um vetor padrão de C-Brick)

NOTA: Esta etapa tem três sub-etapas. Para partes biológicas curtas ( por exemplo, promotores e terminadores), é melhor usar o método de PCR direta para inserir as partes biológicas em um vetor padrão C-Brick ⁴ . Toda a sequência do vetor é mostrada nos dados suplementares, e a seqüência de prefixo e sufixo é mostrada na Figura 1 (etapa 2.1, abaixo). Para as partes biológicas que podem ser facilmente obtidas através da PCR ( por exemplo, com modelos de DNA genômico, plasmídeos ou sequências de DNA sintetizadas de novo ), é melhor usar o método de montagem sem costura para inserir as partes biológicas em um vetor padrão C-Brick (Passo 2.2, abaixo). Para as peças obtidas dos padrões BioBrick e BglBrick, a restriçãoA digestão mediada por enzima e a ligação mediada por ligadura de ADN de T4 podem ser utilizadas para inserir as partes biológicas num vector padrão C-Brick (passo 2.3, abaixo).

1. Construção via amplificação direta de PCR
   1. Desenhe e ordene oligonucleótidos para amplificação por PCR.
      NOTA: O extremo 5 'do oligonucleótido contém a sequência da parte do DNA e a extremidade 3' do oligonucleótido contém a sequência do vetor ( isto é, "GGATCCACTAGTCTCTAGCTCG" na extremidade 3 'da cadeia dianteira e "GGATCCTTTCTCCTCTTTCTAG" Na cadeia inversa). Ou nenhum saliência ou uma saliência de ~ 20 pb podem ser concebidos no extremo 5 'do oligonucleótido. Exemplos específicos podem ser encontrados em um estudo anterior ⁴ .
   2. Re-suspenda os oligonucleótidos individuais em água ultra pura até uma concentração de 10 μM.
   3. Configure as reações de PCR no gelo em um tubo de PCR de 0,2 mL: adicione 18 μL de água ultra pura, 25 μL de 2x PCR buffer, 1 μL de dNTPs (10 μM), 2,5 μL de cada um dos iniciadores direto e reverso (10 μM) do passo 2.1.2, 0,5 μL de vetor padrão C-Brick (50 ng) como modelo e 0,5 μL De polimerase de DNA de alta fidelidade. Certifique-se de que o volume total seja de 50 μL.
   4. Coloque o tubo diretamente em um termociclador e comece o programa termociclador. Use as amostras imediatamente ou congelar e guarde-as a -20 ° C.
   5. Programa Thermocycler: um ciclo durante 3 min a 98 ° C; Trinta ciclos durante 10 s a 98 ° C, 20 s a 55 ° C e 2 min a 72 ° C; E um ciclo durante 10 min a 72 ° C. Mantenha a amostra a 16 ° C.
   6. Adicione 9 μL da mistura do passo 2.1.4 a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
   7. Adicione 1 μL de DpnI e incube durante 1 h num banho de água a 37 ° C.
      NOTA: Se os primers não tiverem seqüências sobrepostas, adicione 0,5 μL de polinucleotídeo quinase T4 (PNK) e 0,5 μL de T4 DNA ligase e incubar emUm banho de água a 22 ° C durante 1 h. Caso contrário, se os iniciadores contiverem uma seqüência de sobreposição de ~ 20 nt, transformar diretamente os produtos tratados com DpnI em células compatíveis com E. coli (DH10B) (etapa 2.4). O produto de PCR linearizado será circularizado pelo sistema de recombinação no hospedeiro.
   8. Use as amostras imediatamente ou guarde-as a -20 ° C.
2. Construção através de montagem sem costura
   1. Desenhe e ordene oligonucleótidos para amplificação por PCR.
      NOTA: A extremidade 3 'do oligonucleótido contém a sequência terminal da parte de DNA e a extremidade 5' do oligonucleótido contém o terminal da sequência de vetor padrão linear C-Brick ( ou seja, "CTAGAAAGAGGAGAAAGGATCC" para o 5 ' -end da cadeia direta e "CGAGCTAGAGACTAGTGGATCC" para o extremo 5 'da cadeia reversa). Exemplos específicos podem ser encontrados em um estudo anterior ⁴ .
   2. Re-suspenda os indivíduosOligonucleótidos ual em água ultra pura para uma concentração de 10 μM.
   3. Configure as reações de PCR no gelo em um tubo de PCR de 0,2 mL: adicione 18 μL de água ultra pura, 25 μL de tampão de PCR 2x, 1 μL de dNTPs (10 μM), 2,5 μL cada um dos iniciadores direto e reverso (10 μM ) A partir do passo 2.2.2, 0,5 μL de molde (20-500 ng) e 0,5 μL de DNA-polimerase de alta fidelidade. Certifique-se de que o volume total seja de 50 μL.
   4. Coloque o tubo diretamente no termociclador e execute o programa termociclador. Use as amostras imediatamente ou congelar e guarde-as a -20 ° C.
      NOTA: Configure o programa do termociclador para: um ciclo durante 3 min a 98 ° C; 30 ciclos por 10 s a 98 ° C, 20 s a 55 ° C (de acordo com a temperatura de recozimento do primário) e 1 min (de acordo com o comprimento das partes biológicas) a 72 ° C; E um ciclo durante 10 min a 72 ° C. Mantenha a amostra a 16 ° C.
   5. Purificar o produto de PCR usando um sistema de limpeza por PCRKit tem; Siga o protocolo do fabricante.
   6. Digerir o vetor padrão C-Brick com BamHI: adicionar 34 μL de água ultra pura, 10 μL de plasmídeo (1 μg), 5 μL de tampão 10x e 1 μL de BamHI ao tubo de microcentrífuga. Incubar até 2 h a 37 ° C num banho de água.
   7. Purifique o produto acima usando um kit de sistema de limpeza de gel; Siga o protocolo do fabricante.
   8. Adicione 2 μL de vetor linearizado (50 ng) do passo 2.2.7, 5 μL de fragmento (200 ng) do passo 2.2.4, 2 μL de tampão de montagem sem costura de 5x e 1 μL de enzima de montagem sem costura a partir de um kit de montagem sem costura Para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Certifique-se de que o volume total seja de 10 μL.
   9. Coloque isso em banho-maria a 37 ° C durante 30 min. Use as amostras imediatamente ou congelar e guarde-as a -20 ° C.
3. Construção por meio de digestão com restrição de medição enzimática e ligadura mediada por DNA ligase de T4.
   NOTA: Para as peças obtidas dos padrões BioBrick (passo 2.3.4-2.3.7) e BglBrick (passo 2.3.1-2.3.3), a digestão mediada por enzimas de restrição e a ligadura mediada por DNA ligase T4 pode ser usada para inserir a Partes biológicas em um vetor padrão C-Brick.
   1. Digerir as partes padrão BglBrick com BamHI e BglII: adicionar 34 μL de água ultra pura, 10 μL de plasmídeo (2 μg), 5 μL de 10x tampão 3, 0,5 μL de BamHI e 0,5 μL de BglII ao tubo de microcentrífuga. Incubar durante 2 h num banho de água a 37 ° C.
   2. Execute uma eletroforese em gel de agarose a 1% e purifique o fragmento usando um kit de sistema de limpeza de gel.
   3. Ligar o fragmento e o vetor padrão C-Brick: adicionar 2 μL de vetor linearizado (50 ng) do passo 2.1.12 e 6 μL de fragmento (200 ng) do passo 2.3.3 para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Adicionar 1 μL de 10 x T4 DNA ligase tampão e 1 μL de T4 DNA ligase. Incubar durante 2 h a 22 ° C. Use as amostras imediatamente ou livreE armazená-los a -20 ° C.
   4. Digite as peças padrão BioBrick com XbaI e SpeI: adicione 34 μL de água ultra pura, 10 μL de plasmídeo (2 μg), 5 μL de tampão 10x, 0,5 μL de XbaI e 0,5 μL de SpeI no tubo de microcentrífuga. Incubar durante 2 h num banho de água a 37 ° C.
   5. Digerir o vetor padrão C-Brick com XbaI e SpeI: adicionar 34 μL de água ultra pura, 10 μL de plasmídeo (1 μg), 5 μL de tampão 10x, 0,5 μL de XbaI e 0,5 μL de SpeI no tubo de microcentrífuga . Incubar durante 2 h num banho de água a 37 ° C.
   6. Execute uma eletroforese em gel de agarose a 1% e purifique o fragmento do passo 2.3.4 e o vetor linearizado a partir do passo 2.3.5 com um kit de sistema de limpeza de gel; Seguindo o protocolo do fabricante.
   7. Ligar o fragmento e o vetor C-Brick: adicionar 2 μL de vetor linearizado (50 ng) do passo 2.3.5 e 6 μL de fragmento (200 ng) do passo 2.3.4 para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. de AnúnciosD 1 μL de 10x T4 ADN ligase tampão e 1 μL de T4 DNA ligase. Incubar durante 2 h a 22 ° C. Use as amostras imediatamente ou congelar e guarde-as a -20 ° C.
4. Adicione 10 μL dos produtos do passo 2.1.8, 2.2.9, 2.3.3 ou 2.3.7 para a transformação química nas células competentes de E. coli (DH10B).
5. Levar vários clones para um tubo Luria-Bertani (LB) líquido de 5 mL e incubar a 37 ° C num agitador (220 rpm) durante a noite.
6. Extrair o plasmídeo usando um kit de preparação de plasmídeo; Siga o protocolo do fabricante.
7. Identifique os clones corretos pelo seqüenciamento do Sanger ¹¹ .

3. Conjunto C-Brick ( Figura 2 )

1. Digestão do vetor C-Brick com Cpf1
   1. Adicionar 22,5 μL de água sem RNase, 4 μL de 10x tampão Cpf1, 10 μL do plasmídeo do passo 2.6 (1 μg), 0,5 μL de RRI e 1 &# 181; L de Cpf1 (5 μM) para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
      NOTA: Cpf1 pode ser comprado comercialmente ou purificado após o protocolo em um estudo anterior ⁴ .
   2. Para inserir um fragmento de ADN estranho nos locais T1 e T2, adicionar 1 μL de crRNA-T2 (10 μM) e incubar em banho-maria a 37 ° C durante 30 min. Um dd 1 μL de crRNA-T1 (10 μM) e Cpf1 (5 μM) por mais 30 min.
      NOTA: Alternativamente, para inserir um fragmento de DNA estranho nos locais T3 e T4, adicionar 1 μL de crRNA-T3 (10 μM) e incubar em banho-maria a 37 ° C durante 30 min. Adicione 1 μL de crRNA-T4 (10 μM) por mais 30 min.
   3. Adicione 1 μL de fosfatase alcalina termossensível e incuba o tubo em um banho de água a 37 ° C durante mais 1 h.
   4. Execute uma eletroforese em gel de agarose e purifique o vetor usando um kit de sistema de limpeza de gel. Use as amostras imediatamente ou congelar e guarde-as a -20 ° C.
2. Digestão do fragmento de DNA com Cpf1
   1. Adicionar 21,5 μL de água sem RNase, 4 μL de 10x tampão Cpf1, 10 μL de plasmídeo a partir do passo 2.6 (2 μg), 0,5 μL de RRI e 2 μL de Cpf1 (5 μM) a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
   2. Para inserir um fragmento de DNA estranho nos locais T1 e T2, adicione 1 μL de crRNA-T1 (10 μM) e 1 μL de crRNA-T3 (10 μM) e incube em banho-maria a 37 ° C durante 2 h.
      NOTA: Alternativamente, adicione 1 μL de crRNA-T2 (10 μM) e 1 μL de crRNA-T4 (10 μM) e incube em banho-maria a 37 ° C durante 2 h.
   3. Execute uma eletroforese em gel de agarose e purifique o fragmento usando um kit de sistema de limpeza de gel. Use as amostras imediatamente ou congelar e guarde-as a -20 ° C.
3. Assembléia de C-Brick e verificação adicional
   1. Ligar o fragmento de ADN estranho e o vetor C-Brick: adicionar 2 μL do vetor linearizado (50 ng) do passo 3.1.4 e 6 μL do fragmento de ADN (200 ng) do passo 3.2.3 para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Adicionar 1 μL de 10x T4 ADN ligase tampão e 1 μL de T4 DNA ligase. Incubar durante 2 h a 22 ° C. Use as amostras imediatamente ou congelar e guarde-as a -20 ° C.
   2. Adicionar 10 μL dos produtos de ligação (passo 3.3.1) para a transformação química em células compatíveis com E. coli (DH10B).
   3. Adicione vários clones a um tubo LB líquido de 5 mL e incube durante a noite em um agitador a 220 rpm e 37 ° C.
   4. Extrair o plasmídeo usando um kit de preparação de plasmídeo; Siga o protocolo do fabricante.
   5. Identificar clones corretos pelo seqüenciamento do Sanger ¹¹ .
4. Execute uma nova rodada de montagem C-Brick. Os clones corretos do passo 3.3.4 podem ser usados ​​como um novo vetor C-Brick ou parte de DNA para uma montagem iterativa adicional de C-Brick, seguindo o mesmo protocolo das etapas 3.1-3.3.
   NOTA: T2 'e T3' sSão projetados como o backup de sites T2 e T3 ( Figura 1a ). Para os plasmídeos obtidos a partir do passo 2.3.7, apenas T2 e T3 podem ser utilizados para a montagem padrão do C-Brick.

Resultados

Este protocolo demonstrou a montagem de três cassetes de cromoproteína (cjBlue (BBa_K592011), eforRed (BBa_K592012) e amilGFP (BBa_K592010)). Primeiro, as sequências de codificação dos três genes e terminadores acima mencionados foram clonados individualmente em um vetor padrão C-Brick. Pequenas partes de DNA, promotor e terminador, foram introduzidas no vetor C-Brick através de amplificação por PCR usando primers contendo as partes de DNA curtas no terminal 5 '. Segu...

Discussão

Este protocolo descreve um procedimento para o padrão de montagem de DNA C-Brick. O passo mais importante neste protocolo é a linearização do vetor padrão C-Brick; A clivagem incompleta do vetor pode afetar seriamente a taxa de sucesso. Além disso, embora o Cpf1 cliva principalmente as sequências de DNA alvo no padrão de clivagem "18-23", também foi detectada uma clivagem incorreta perto das duas bases ⁴ , o que pode causar um pequeno número de mutações após a montagem do D...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Comercial Oligonucleotide	Sangon Biotech
10x Taq PCR Buffer	Transgen	#J40928
Ultra Pure Distilled Water	Invitrogen	10977-015
5x RNA Transcription Buffer	Thermo Scientific	K0441
T7 RNA polymerase	Thermo Scientific	#EP0111
NTP mixture	Sangon	#ND0056
RRI (Recombinant RNase Inhibitor)	Takara	2313A
RNA Clean & Concentrator-5	Zymo Research	R1015
UV-Vis Spectrometer	Thermo Scientific	Nano-Drop 2000c
2x Phanta Max Buffer	Vazyme	PB505	PCR buffer
dNTPs	Transgen	AD101
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase	Vazyme	P505-d1
Ezmax for One-step Cloning	Tolobio	24303-1	seamless assembly kit
5x Buffer for Ezmax One-step Cloning	Tolobio	32006
BamHI	NEB	#R0136L
BamHI-HF	NEB	#R3136L
BglII	NEB	#R0144L
XbaI	NEB	#R0145L
SpeI	NEB	#R3133L
10x Buffer 3	NEB	#B7003S
10x CutSmart Buffer	NEB	B7204S
10x T4 DNA ligase Buffer	Tolobio	32002
T4 PNK	Tolobio	32206
T4 DNA ligase	Tolobio	32210
DpnI	NEB	#R01762
SV Gel and PCR clean-up system	Promega	A9282
Plasmid Mini Kit I	Omega	D6943-02	plasmid preparation kit
thermosensitive alkaline phosphatase	Thermo Scientific	#EF0651	FastAP
10x Cpf1 buffer	Tolobio	32008
Cpf1	Tolobio	32105	FnCpf1
thermocycler	Applied Biosystems	veriti 96 well
C-Brick standard vector	Tolobio	98101
E. coli [DH10B]	Invitrogen	18297010
Luria-Bertani media (tryptone)	Oxoid	LP0042
Luria-Bertani media (yeast extract)	Oxoid	LP0021
Luria-Bertani media (NaCl)	Sangon Biotech	B126BA0007