流感病毒在小鼠感染模型中的研究

摘要

甲型流感病毒 (IAVs) 是人类重要的呼吸道病原体。为了了解 IAVs 的致病性和对新疫苗方法进行临床前测试, 需要模仿人体生理学的动物模型。在这里, 我们描述的技术, 以评估 IAV 病机, 体液反应和疫苗的效果使用小鼠感染模型。

摘要

流感病毒在全球范围内造成超过50万人死亡¹ , 并与每年的费用 12-140亿 USD 在美国单独考虑直接医疗和住院费用和工作缺勤的²。动物模型是关键的流感 A 病毒 (IAV) 研究评估病毒发病机制, 宿主-病原体相互作用, 免疫反应, 以及目前和/或新的疫苗方法的功效, 以及抗病毒药物。小鼠是一种有利的小动物模型, 因为它们的免疫系统在进化上与人类相似, 它们可从商业供应商那里获得, 作为基因上相同的学科, 有多种菌株可以利用来评估感染的遗传基础, 它们相对便宜, 易于操作。为了总结 IAV 感染的人通过呼吸道, 小鼠首先被麻醉之前, 鼻腔接种与传染性 IAVs 在适当的生物安全控制下。感染后, IAVs 的发病机制是通过每日监测发病率 (体重损失) 和死亡率 (存活率) 来确定的。此外, 病毒病机还可以评估病毒复制在上 (鼻黏膜) 或较低 (肺) 呼吸道感染小鼠。对 IAV 感染的体液反应可以通过无创性出血和二级抗体检测方法快速评估, 目的是检测总或中和抗体的存在。在这里, 我们描述了常用的方法感染小鼠鼻 (i. n) 与 IAV 和评估发病机制, 体液免疫反应和保护功效。

引言

IAVs 被封装在Orthomyxoviridae系列³中的病毒分类。他们包含八单 RNA 分子与阴性极性³。在人类中, IAVs 导致季节性流行病和偶然大流行的重要后果, 当新的病毒在人类人口中引入⁴。此外, 季节性 IAVs 是高度和迅速传播之间的人产生了高的经济损失世界各地每年^2,5。IAV 症状包括咳嗽、鼻塞、发热、不适、头痛、厌食和肌痛, 但病毒也会在免疫缺陷患者中产生更严重的疾病⁶。事实上, 世界卫生组织 (WHO) 计算, 季节性流感病毒每年造成30万至50万人死亡, 在世界各地¹。目前只有两类药物被食品和药物管理局 (FDA) 批准用于人类的流感预防和治疗: 神经氨酸酶 (NA) 抑制剂 (例如, 奥司他韦) 和阻断剂的 M2 离子通道 (例如,金刚烷胺);然而, 耐药性病毒变种的出现日益引起人们的关注。因此, 疫苗接种仍然是保护人类免受 IAVs 感染的最佳医疗选择。迄今为止, 有三种类型的流感疫苗是由 FDA 授权供人使用的: 重组病毒血 (HA) 蛋白疫苗、灭活流感疫苗 (IIV) 和活减流感疫苗 (LAIV)^5,7. 三种疫苗的设计目的是诱导对病毒 HA 蛋白的适应性免疫反应, 这是中和抗体对抗 IAVs 的主要目标。

一种验证的小鼠模型, 用于研究 IAV 感染在体内

动物模型被用于研究, 除其他以外, IAV 发病机制^8,9,10,11, 导致疾病的病毒因素¹²和/或病毒传输^{13 ,14}, 并测试新疫苗或抗病毒药物的功效⁹,^10,15。老鼠 (小家鼠) 是最广泛使用的动物模型为 IAV 研究有几个原因: 1) 免疫系统在进化上类似于人类的存在;2) 低成本, 包括动物购买、住房和繁殖;3) 体积小, 易于操作和贮存;4) 最小主机的变异性, 以获得均匀的反应和结果;5) 大鼠生物学知识, 包括基因组序列;6) 许多可用的分子生物学和/或免疫学试剂;7) 可用的敲出 (KO) 小鼠研究某一宿主蛋白对病毒感染的贡献;和, 8) 多小鼠菌株, 可以利用, 以评估遗传基础的感染。

目前有几个老鼠菌株可用于研究 IAV在体内。年龄、免疫状况、性别、遗传背景和小鼠品系以及感染途径、剂量和病毒株均影响小鼠 IAV 感染的结果。IAV 研究中使用的最常见的小鼠菌株是 C57BL/6、balb/c/C 和最近的 DBA. 2 只小鼠, 因为它们比两个前菌株更容易 IAV 疾病^{16,17,18,19,20}. 重要的是, 免疫应答也可以根据鼠标的应变情况而有所不同^18,19,20。因此, 恢复所有关于鼠标和 IAV 应变的可用信息是非常重要的, 以选择最佳的实验方法进行。

虽然鼠标是一个良好的动物模型感染的在体内研究与 IAV, 他们有几个限制, 需要考虑的实验设计。例如, 使用小鼠进行体内研究的一个主要限制是, IAVs 不在小鼠之间传播。因而, 为传输研究, 更加被接受的动物模型 (例如, 雪貂或试验品) 使用^16,17,21。此外, IAV 在小鼠和人类中的表现也存在着一些差异。与人类不同, 老鼠在 IAV 感染时不会发热;相反, 他们目前与低温^16,17。在小鼠中, IAV 的复制集中在下呼吸道 (肺部) 而不是上层气管。因此, IAV 在小鼠中的毒力并不总是与人类所看到的相关联。总之, 由于优势大于有限的劣势, 鼠标代表了第一个动物模型, 用于评估流感病毒的发病机制, 免疫原性和保护功效的疫苗和抗病毒研究。此外, 在 IAV 感染的小动物模型中, 使用大型动物模型进行 IAV 研究, 并没有以前的证据, 在道德上是不能接受的。在这篇手稿中, 我们描述了如何感染小鼠鼻 (.) 与 IAV, 如何监测病毒感染的严重性和进展, 以及如何进行的实验, 以评估体液免疫反应和保护功效。

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研究方案

这里描述的所有动物协议都是由机构动物保育和使用委员会 (IACUC) 和罗切斯特大学医学院和牙医学院的机构生物安全委员会 (IBC) 批准的, 并遵守与建议在指南为实验室动物的关心和用途全国研究委员会22。医学和牙科学院的 Vivarium 和实验动物医学科的设施和方案由 AAALAC 国际认证, 并符合国家法律、联邦法规和国家卫生研究院的政策。在每个机构都应采用类似的要求, 以遵守本手稿中所描述的动物协议.

1. 使用小型脊椎动物

注意: 在与鼠标一起工作时需要适当的个人防护设备 (PPE)。最低要求包括一次性工作服, 鞋套, 头罩, 口罩和手套.

1. 根据 IACUC 协议, 每个笼子最多放置5只老鼠。按照 IACUC 协议, 安乐的小鼠有两种安乐死方法 (第二个必须是物理方法), 以确保动物死亡.
   注意: 在对 IAV 发病率和死亡率进行评估的实验中, 失去20% 的初始体重的小鼠被认为已经达到了实验终点, 并以 CO ₂ 进行了安乐死, 并以颈椎脱位为物理辅助方法。这一比例的体重可能是不同的其他机构。在 IAV 感染后, 小鼠肺部和鼻腔粘膜被收集的过程中, 小鼠被安乐死, 致死剂量为22、2-tribromoethanol, 并以肝静脉为物理辅助方法。在罗彻斯特大学医学院和牙科学院的动物保育设施中, 在特定的无病原体条件下购买并维持了雌性6至8周老 C57BL/6 小鼠.

2。生物安全

注意: 在本报告中, 用于感染小鼠的 IAVs 是常用的流感 A/波多黎各 Rico/8/34 (PR8) ^{22 、 23} 和温度敏感的 LAIV 变体, PR8 LAIV ⁸ 。执行所有涉及 IAV 感染 ( 体外 或 体内 )、细胞培养和生物样本的所有过程, 在生物安全水平 (BSL) 下, 2 条件。如果使用剧毒的 IAV 菌株, 可利用其他 BSL 的套装或密闭条件.

1. 在执行本手稿中描述的所有实验程序之前和之后, 用二氧化氯消毒剂清洁生物安全柜。对所有解剖材料 (剪刀、手术刀和解剖钳) 和 Dounce 均质机进行消毒, 然后使用适当的 IBC 建议。在适当的中型散货箱和 IACUC 准则下, 丢弃在过程中产生的所有材料.

3。鼻腔感染

1. 将雌性6至8周的 C57BL/6 小鼠置于特定的无病原体条件下。使用病毒和剂量组织和标记鼠标笼。使用耳打码或其他批准的方法 (如画尾) 来识别每个笼子中的老鼠。每个笼子最多放置5只老鼠.
2. 在无菌条件下准备 IAV (FFU)/鼠标) 的稀释, 总容量为30和 #181; 无菌1x 磷酸缓冲液 (PBS) 中的 L/老鼠。在冰上保持病毒接种。计算 IAV 在病毒稀释中添加的量: ((x FFU 每只老鼠/30 和 #181; L) x 最终体积)/股票病毒滴度.
3. 按比例称量小鼠并记录每只老鼠的重量 (0 天)。在食指和拇指之间的颈背上捡起, 将鼠标置于背部位置。用小指把尾巴握在手上.
4. 麻醉 240-250 毫克/千克的小鼠腹腔 (ip), 插入针头在右侧腹部的尾端2/3。在撤回针头之前暂停片刻。将鼠标返回到笼子, 等待5分钟.
5. 用无菌眼膏涂抹于眼部, 防止老鼠被麻醉时干燥。检查是否被麻醉的鼠标缺乏踏板撤退反射 ( 即 , 脚趾捏)。如果老鼠没有完全麻醉, 他们会咳出病毒.
6. 当鼠标完全麻醉时, 将鼠标置于背卧床。把含有30和 #181 的吸管尖端; 病毒接种在鼻孔里, 缓慢而不断地弹出解决方案。确保鼠标通过观察接种滴消失来吸入制剂.
7. 检查鼠标是否呼吸, 可以降低温度和呼吸速率。把动物放回笼子里, 把它放在背卧床。监测小鼠是否有呼吸窘迫的迹象, 如果观察到, 可以通过垂直保持动物来帮助小鼠呼吸, 并诱发撞击驱动的呼吸作用 ²⁴ 。监测鼠标, 直到它恢复知觉 (30-45 分钟后, 它被麻醉).

4。病毒病机的特征 ( 图 1 )

1. 发病率和死亡率的评估 ( 图 1 和 图 2 )
   1. 感染. 3-4 组雌性6至8周老 C57BL/6 小鼠 (每组至少5只小鼠, n = 5) 具有10倍的剂量 (10, 10 ² , 10 ³ 和 10 ⁴ FFU/鼠标) 的 PR8 重量, 如在3节中所述。
   2. 在接下来的14天内监测和衡量小鼠的体重, 以尽量减少由于食物摄入而造成的重量变化。安乐小鼠, 失去20% 的初始体重如1节所述.
   3. 14 天后, 安乐在1节所述的病毒感染中存活的小鼠.
   4. 计算病毒50% 鼠标致死剂量 (MLD ₅₀ ), 根据使用芦苇和明奇的方法获得的生存数据 ²⁵ 。首先, 计算比例距离 (PD):
      
      1. 下一步, 按以下公式计算 MLD ₅₀ :
2. 评估肺部和鼻腔黏膜中的病毒滴 ( 图 1 和 图2)
   1. 肺部和鼻粘膜的恢复
      1. 感染. 的雌性6至8周老 C57BL/6 小鼠 (n = 6) 与病毒剂量测试 10-10 ⁴ FFU PR8 的重量, 如第3节所述。
      2. 在2天 (n = 3) 和 4 (n = 3) 中收集鼠标的肺部和鼻腔粘膜。
         1. 安乐 (500 毫克/千克) 的致命剂量 (ip) 的小鼠。将动物置于背卧床上, 用70% 乙醇消毒胸部的皮毛。用手术刀从胸骨到腹部的底部切开皮肤。用剪刀将切口底部的1厘米切到小鼠的侧部.
         2. 用剪刀切开肝静脉以出血作为继发性安乐死的方法。将动物置于腹位, 等待2分钟, 让血液排出。这一步对于减少肺部的血液是很重要的.
         3. 将小鼠的整个上部 (包括头部) 的皮肤从腹部的底部移除, 并借助解剖钳和剪刀进行第一切口。用剪刀割头, 把它放在无菌的干培养皿中.
         4. 用剪刀剪下上颌与下颌骨的接合处, 并丢弃下颌骨。用剪刀, 在颧骨的两端做两个切口, 然后把它们去掉。在解剖钳的帮助下移除眼睛.
         5. 用解剖钳握住颅骨, 用手术刀将颅骨沿矢状缝合线切开。抬起头骨的两半, 用大脑去看鼻腔粘膜。鼻粘膜周围的头骨前骨, 包括鼻, 上颌, 腭, 颧骨, 和筛骨.
         6. 使用手术刀, 用大脑切开颅骨部分, 然后丢弃。将颅骨的另一部分与鼻腔粘膜放在无菌管中。把管子放在冰上 (4 和 #176; C) 如果样品在同一天处理, 或者在干冰上, 如果样品以后被处理, 将它们快速冷冻.
         7. 为了避免样品的污染, 在每个组织之间的解剖工具和二氧化氯消毒剂之间进行清洁和消毒.
         8. 收集肺部, 将动物置于背卧床, 用剪刀切开胸膜。在胸骨两侧1厘米处切开肋骨, 打开胸腔。用剪刀把肋骨底部的切口从肋架的底座上剪下来.
         9. 在肋骨保持架的上级部分的两个切口之间用剪刀制作一个横截面, 并取出胸腔板。用钳子把肺部夹住, 在气管的末端 (在肺部前) 切开, 用剪刀把肺部放进无菌管。把管子放在冰上 (4 和 #176; C) 如果样品在同一天处理, 或者在干冰上, 如果样品以后被处理, 将它们快速冷冻.
            注: 质在采集的同一天, 将组织样品保存在-80 和 #176; C) 后进行病毒滴分析。在确定病毒滴之前, 样品不经过反复的冻融循环是很重要的。或者, 将组织样本存储在-80 和 #176; C, 直到它们被处理.
   2. 肺部和鼻腔粘膜的均匀性
      将肺部或鼻腔粘膜放入无菌 Dounce 均质机中, 并添加1毫升的冷感染介质。质的样品通过移动杵上下约1分钟室温 (RT), 直到肺部完全中断。将匀浆样品放在无菌管中, 贮存于4和 #176; c. 为每个样品使用新的 Dounce 均质机.
      1. 在 RT 上离心样品 300 x g, 5-10 分钟. 在新的无菌管中收集上清液。将上清液储存在4和 #176; C 如果在同一天进行病毒滴定并丢弃颗粒。或者, 冷冻 (-80 和 #176; C) 滴后的匀浆样品的上清液来评价病毒的后期.
   3. 病毒滴定法间接免疫荧光
      1. 前一天滴定, 种子 96-Madin-达比犬肾脏 (MDCK) 上皮细胞 (4 x 10 ⁴ 细胞/井) 达到〜 80-90% 在组织培养媒体融合。将单元格放置在37和 #176; C 孵化器与 5% CO ₂ 。在病毒性滴定的当天, 检查显微镜下的细胞, 在病毒感染开始前确认单层.
      2. 在96井板上的感染介质中制备1:10 稀释的匀浆样品 (肺或鼻粘膜) 的上清液。通过 triplicates 进行病毒滴定来准确测定病毒滴。
         1. 在96孔板中的每个井中添加90和 #181; L 感染介质。添加10和 #181; A1、A2 和 A3 的匀浆样品中的一个上清液, 对每一个样品的病毒滴度进行三份评价。添加10和 #181; 在 A4、A5 和 A6 中, 将匀浆样品的另一上清液升为水井。与样品的其余部分进行相同的稀释.
         2. 在将样品上清液添加到 a 排后, 使用多通道吸管移上下混合。转移10和 #181; L 从 A 排到行 b. 改变稀释之间的技巧和混合好。重复此操作, 直到到达最后一行 (H).
      3. 将组织培养介质 (步骤 4.2.3.1) 从96个井板中的 MDCK 单元中取出器多通道适配器, 然后用100和 #181 清洗两次; 1x PBS 的 L/好.
      4. 传输50和 #181; 将匀浆样品的连续稀释上清液的 L/井转至 96-MDCK 细胞的板。开始将更高的稀释 (行 H) 转移到下稀释 (行 A)。在这种情况下, 不需要更改不同行之间的提示.
      5. 在 RT 上将96个井板放在一个摇摆平台上1小时, 以允许病毒吸附。在病毒吸附后, 接种使用真空器多通道适配器, 并添加100和 #181; 感染介质的 L/井。在33和 #176 中孵育感染细胞8小时; c 或37和 #176; c 孵化器 5% CO ₂ 。进行固定, 染色, 成像和病毒滴度计算, 如步骤4.2.3.6 和 #8211; 4.2.3.12.
      6. 使用真空器多声道适配器从96井板中取出组织培养基。固定和 permeabilize 100 和 #181 的细胞; L/性溶液在 RT 上20分钟.
         注意: 在通风柜中使用固定/性溶液防止甲醛暴露.
      7. 使用真空器多通道适配器去除固定/性溶液, 用 1x PBS 冲洗, 并在 RT 中用阻塞溶液孵育固定电池1小时. 将单元格存储在4和 #176 的阻塞解决方案中, 或继续执行下一步.
      8. 删除阻止解决方案。增加50和 #181; 1 和 #181; HB-65 抗体稀释液中稀释的抗 NP 抗体。在37和 #176 孵育1小时; c. 不同的单克隆或 polyclon可使用 al 抗体 (pAb) anti-PR8.
      9. 同时, 在抗体稀释液中稀释1:200 荧光素异硫氰酸酯 (FITC)-共轭二 anti-mouse 抗体。离心解决方案在 1700 x g 为 5-10 分钟在 RT。其他与其他荧光共轭的二次抗体可以使用.
      10. 去除主抗体, 用100和 #181 冲洗3次; 1x PBS 的 L/井。添加50和 #181; 在37和 #176 中, 二次抗体稀释和孵育 30-45 分钟的 L/井; c. 除去二次抗体, 用3和 #181 冲洗100次; 1x PBS 的 l/井。把最后一把洗的放在盘子里.
      11. 观察荧光显微镜下的细胞, 确定阳性染色 (绿色) 细胞的数量。计算的病毒滴度计数 FFU/毫升。使用公式计算 30-50 阳性染色细胞在 FFU/毫升中表达的病毒滴度: (n1 + n2 + n3)/3) x 20 x 1/稀释.

5。体液免疫应答 ( 图 3 )

1. 感染. 3 组雌性6至8周老 C57BL/6 小鼠 (n = 5) 与不同剂量 (10 ² , 10 ³ , 和 10 ⁴ FFU/鼠) 的 PR8 LAIV, 并模拟感染一组 (n = 5) 与1x 无菌 PBS 作为一个负控制。执行3节所述的 i. n 鼠标感染.
   1. 小鼠通过下颌下腺穿刺出血
      1. 十四天后进行免疫接种, 用4毫米的柳叶刀对小鼠下颌下腺出血进行血液收集, 或使用另一种 IACUC 批准的方法。
         1. 通过将鼠标从食指和拇指之间的颈背上捡起来抓住它。用小指把尾巴靠在手上使鼠标固定住.
         2. 将鼠标置于横向位置以查看脸颊。在与颈静脉的后眶和下颌下腺静脉接合处进行穿刺。下沉柳叶刀 (4 毫米) 和恢复血液在一个无菌管 (大约 0.2-0.4 毫升/老鼠被恢复)。用无菌餐巾纸按压穿刺几秒钟。将鼠标放回笼子.
      2. 将 1-2 小时的管子放在37和 #176; C, 然后将它们离心到 700 x g, 在 RT 中将血清与血液分离。将含有吸管的血清的上层转移到新的无菌管上。丢弃红血球颗粒 (红细胞)。将血清储存在-20 和 #176; C.
2. 对病毒蛋白的总抗体的分析
   感染 MDCK 细胞提取物的制备
   1. 传染前的前一天, 种子一个100毫米的菜与 4-5 x 10
      1. 6 ^{MDCK 细胞 (达到〜 80-90第二天汇合) 在组织培养培养基中。将单元格放置在37和 #176; C 孵化器与 5% CO ₂ 。病毒感染的当天, 检查显微镜下的细胞, 确认一单层, 然后开始病毒感染.}
      2. 在4毫升的最终容量中, 在感染介质中制备一种低 (0.001) PR8 重的病毒性稀释。计算 PR8 量与公式 ((x 莫伊 x n 和 #176; 细胞) x 最终体积)/股票病毒滴度.
      3. 从 MDCK 细胞板中吸取组织培养基, 用4毫升 1x PBS 冲洗两次。添加病毒接种 (4 毫升), 并把板上的一个摇摆平台为1小时的 RT, 以允许病毒的吸附。去除病毒接种与真空, 并添加8-10 毫升的感染介质含有1和 #181; TPCK 处理的胰蛋白酶的 g/毫升。在33和 #176 中孵育感染细胞 48-72 小时; c 或37和 #176; c 孵化器与 5% CO ₂ .
      4. 在细胞刮刀的帮助下分离细胞和收集细胞和组织培养基与一个吸管在一个15毫升的管。离心管在 400 x g 为 5-10 分钟在 RT. 在1毫升的帕缓冲液中吸取上清和重细胞颗粒, 并将该混合物放入1.5 毫升的无菌管中。在冰上孵育20-30 分钟.
      5. 离心管在 1300 x g 为 20-30 分钟在4和 #176; 小心, 恢复上清。将细胞提取物存储在100和 #181; 等分-20 #176; C.
      6. 滴定酶联免疫吸附试验 (ELISA) 所描述的细胞提取物, 在评估它们是否存在抗体之前 ^{9 , 10 , 11 , 27} . 包括模拟感染的 MDCK 细胞中的细胞提取物 (如上所示) 作为阴性对照.
   2. ELISA ( 图 4 )
      1. 涂层聚苯乙烯 96-井板在 1x PBS 中适当稀释受感染的 MDCK 细胞提取物 (通常在 1:200-1:1, 000)。用同样稀释的模拟感染的 MDCK 细胞提取物作为阴性对照来涂另一盘。在4和 #176 夜间孵育 (O/N); C.
      2. 使用真空器多通道适配器卸下上清液, 用100和 #181 冲洗一次; 1x PBS 的 L/井与多通道吸管。通过在 RT 中添加100和 #181、1 h 的阻塞解决方案的 L/井来阻止非特定的绑定.
      3. 同时, 在96口板的抗体稀释液中, 在步骤5.1 中感染的每只老鼠, 制作2倍的稀释 (开始稀释 1:50) 的血清.
      4. 使用真空器多声道适配器从聚苯乙烯 96-井板上取下阻挡液。添加50和 #181; 每只老鼠血清稀释在适当的井和孵育 1 h 在37和 #176; C.
      5. 用真空器多声道适配器移除小鼠血清。使用多通道吸管用蒸馏水冲洗3次水井。添加50和 #181; anti-mouse 二级抗体共轭辣根过氧化物酶 (HRP) 稀释 1:2, 000 抗体稀释液。在37和 #176 孵育1小时; C.
      6. 卸下带有真空器多声道适配器的二次抗体。使用多通道吸管用蒸馏水冲洗3次水井。tetramethylbenzidine (TMB) 基体溶液通过混合1:1 溶液 A 和 b. 增加100和 #181; L/良好的基质和孵化 5-10 分钟在 RT 在黑暗中.
      7. 停止反应, 添加100和 #181; 0.2 N H ₂ 所以 ₄ 。阅读 450 nm 在一个 ELISA 平板阅读器的板块.
      8. 减去从 MDCK 感染的 96-井板中获得的 MDCK 模拟感染的 96-井板的每个稀释值。计算每个稀释的平均值与不同的血清和代表他们在一个图表显示标准偏差 (SD).
3. 中和抗体分析
   1. 血凝抑制 (海) 试验 ( 图 5 )
      1. 在执行海化验前, 用受体治疗小鼠血清破坏酶 (RDE) 消除血清中存在的所有非特异性抑制剂。添加1体积的小鼠血清到4卷的 RDE 工作稀释 (血清稀释现在 1:5)。孵育 O/N (12-18 h) 在37和 #176; C 水浴.
      2. 将血清样品加热56和 #176; C 为30分钟, 使 RDE 失效.
      3. 用标准 HA 测定法测定 PR8 的血凝活性 (口) ²⁸ 。一旦病毒口被确定, 稀释病毒的股票到8口每50和 #181; L 在 1x PBS.
      4. 准备2倍系列稀释 (12 稀释) 的 RDE 处理的血清在一个96井 V 底板。对每个血清样本使用一行 ( 例如 , A1 到 A12)。
         1. 添加25和 #181; 1x PBS 从 A1 到 A12 井。在一排中测试每个血清样本。添加25和 #181; RDE 处理的血清 (1:5) 到25和 #181; l 1x PBS 在专栏的第一井 (A1)。第一次血清稀释是 1:10.
         2. 一旦将所有 RDE 处理的血清添加到第一列中, ( 如 、A1、B1、C1), 使用多通道吸管将血清和 1x PBS 混合在一起移。转移25和 #181; 从第一列到第二列 ( 例如 , 从 A1 到 A2) 的稀释血清 L。更改稀释和混合的提示.
         3. 重复步骤 5.3. 1.4. 2. 直到到达最后一列 ( 例如 、A12、B12、C12)。丢弃25和 #181; l 从最后一栏, 保持音量一致的所有水井 (25 和 #181; l)。包括一排仅含25和 #181 的井; 1x PBS 没有任何血清作为阴性对照.
      5. 添加25和 #181; IAV 稀释到 8 HAU/50 和 #181; l 对每一个井与血清在96井 V 底板; 每个井的最终体积为50和 #181; l, 含有4口病毒。通过重复的移来混合内容。在 RT 上孵育1小时.
      6. 添加50和 #181; 0.5% 土耳其红细胞每口井。通过重复的移来混合内容。在冰上孵育盘子 30-45 分钟。当控制井 (1x PBS) 中的红细胞在井底形成红色沉淀 ( 即 、颗粒状) 时, 请看海法.
         注意: 还可以使用其他种类的红细胞, 如鸡肉、豚鼠或马.
      7. 计算海滴通过确定最后井, 其中红细胞形成一个红色的颗粒和血凝不发生.
         注: 这种稀释的相互价值是海滴度。相互价值乘以20的因子, 以纠正1:20 稀释的血清在第一行.
   2. 病毒 microneutralization 检测 (网络) ( 图 6 )
      1. 在网络之前的前一天, 在96个井板中准备 MDCK 单元, 以便在第二天到达80-90% 汇合处, 如步骤5.2.1.1 中所述。准备在感染介质中稀释 PR8 200 FFU/25 和 #181; L.
      2. 在56和 #176 上禁用鼠标血清; C 为1小时, 用96个井板对每只老鼠血清进行2倍的连续稀释 (12 稀释)。
         1. 在第一行的第一个井中添加40和 #181; l 血清到160和 #181; l 感染媒体 ( 例如 , A1) (血清稀释 1:5)。混合移。添加100和 #181; L 感染介质到其他水井 (A2 至 H12).
         2. 传输100和 #181; L 从第一行到第二行, 使1:2 稀释 ( 例如 , 从 A1 到 A2)。改变稀释之间的技巧和混合的移。重复此操作, 直到最后一行 ( 例如 , A12)。丢弃100和 #181; 从最后一排, 保持在所有的水井 (100 和 #181; l) 的音量一致.
      3. 添加100和 #181; IAV 稀释到所有井。在 RT 处孵育1小时。同时, 用真空器多通道适配器从96井板的 MDCK 细胞中去除组织培养培养基, 用100和 #181 冲洗两次; 1x PBS 的 L/井.
      4. 在每96个 MDCK 单元格中, 为控件保留两行。一排是负控制 (没有病毒和血清的细胞), 另一排是阳性控制感染 (细胞与病毒在没有血清或血清从模拟感染小鼠).
      5. 传输50和 #181; 从病毒抗体板到 MDCK 细胞的96井板。将平板放在 RT 平台上1小时, 以允许病毒吸附.
      6. 使用真空器多通道适配器移除病毒抗体接种, 并添加100和 #181; 含有1和 #181 的感染介质的 L/井; TPCK 处理的胰蛋白酶的 g/毫升.
      7. 在33和 #176 中孵育细胞 3-4 天; c 或37和 #176; c 孵化器与 5% CO ₂ 直到病变效应 (CPE) 被观察到阳性对照 (感染细胞在缺乏血清或与对照血清).
      8. 使用真空器多通道适配器移除组织培养基, 并添加100和 #181; 0.1% 结晶紫的 L/井。在 RT 处孵育1小时. 使用真空器多通道适配器去除结晶紫溶液。用蒸馏水冲洗3次水井。在 RT 上擦干盘子.
      9. 通过确定保留 MDCK 细胞的汇合细胞单层的最高稀释度来计算网络滴.
         注: 此相应稀释的倒数值是中和抗体滴度。相互价值乘以10的因子, 以纠正1:10 的稀释的血清在第一井的行.

6。保护功效疫苗的评价 ( 图 3 )

1. 接种. 一组雌性6至8周老 C57BL/6 小鼠 (n = 11) 与 PR8 LAIV 剂量测试 (FFU/老鼠) 和模拟接种另一组小鼠 (n = 11)有1x 无菌 PBS。执行3节中所述的鼠标. 免疫.
2. 十四天 post-vaccination, 出血的小鼠和收集的血清, 如3节所述。分析 PR8 的总和中和抗体的存在, 如5.1.1 节所述.
3. 十五天 post-vaccination, 测量和记录鼠标的体重 (天 0)。挑战鼠. 与致命剂量的 PR8 重量 (同源挑战) 前面所描述的3节.
4. 测量体重和存活率 (n = 5/组) 在挑战后的14天评估的发病率和死亡率的 PR8 免疫小鼠的挑战, 接种疫苗 (第4.1 节).
5. 恢复鼠肺和鼻腔黏膜 (n = 3/天) 在2天 4 post-challenge 与 PR8 质和分析肺部和鼻腔黏膜, 如4.2 节所述, 评估免疫小鼠的病毒复制 PR8.

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结果

小鼠病毒病机的特征

IAV 的发病机制与其感染引起的发病率和死亡率有关。这两个参数可以很容易地在小鼠中进行评估: IAV 发病率与受感染小鼠的体重下降有关, 存活率的百分比将表明死亡率 (图 1)。IAV 感染小鼠的体重和生存率通常在感染^8、9、

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讨论

IAV 的小鼠模型广泛应用于体内的 IAV 病机、免疫原性和保护功效的研究。与其他动物模型 (如雪貂或豚鼠) 相比, 小老鼠可以使它们易于操作和储存。此外, 在动物成本、住房和生殖方面的便利使它们能够用于需要大量动物的前体免疫试验。值得注意的是, 由于小鼠已被用于多个研究学科, 一些分子和免疫学鼠试剂可以方便用于 IAV 研究。此外, 最小的寄主变异性和存在的免疫系统, 在进化上类?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells	ATCC	CCL-34
Six- to eight-week-old female C57BL/6 mice	National Cancer Institute (NCI)	01XBE
Turckey red blod cells	Biolink Inc		Store at 4 °C
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Corning Cellgro	15-013-CV	Store at 4 °C
Fetal Bovine Serum (FBS)	Seradigm	1500-050	Store at -20 °C
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x	Corning	30-009-CI	Store at -20 °C
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x	Corning	30-00-CI	Store at -20 °C
Bovin Albumin solution (BA)	Sigma-Aldrich	A7409	Store at 4 °C
Bovin Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9647	Store at 4 °C
Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin	Sigma-Aldrich	T8802	Store at -20 °C
Neutral Buffered Formalin 10%	EMD	65346-85	Store at RT
Triton X-100	J.T.Baker	X198-07	Store at RT
Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65	ATTC	H16-L10-4R5	Store at -20 °C
Polyclonal rabbit anti-mouse immunoglobulins/FITC	Dako	F0261	Store at 4 °C
ECL Anti-mouse IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody	GE Healthcare	LNA931V/AG	Store at 4 °C
TMB substrate set	BioLegend	421101	Store at 4 °C
Vmax Kinetic plate reader	Molecular Devices
Dounce Tissue Grinders	Thomas Scientific	7722-7
Receptor destroying enzyme, RDE (II)	Denka Seiken Co.	370013	Store at -20 °C
Crystal Violet	Fisher Scienctific	C581-100	Store at RT
96-well Cell Culture Plate	Greiner Bio-one	655-180
Cell Culture dishes 100 mm	Greiner Bio-one	664-160
Nunc MicroWell 96-Well Microplates	Thermo Fisher Scienctific	269620
Nunc 96-Well Polystyrene Conical Bottom MicroWell Plates	Thermo Fisher Scienctific	249570
Puralub Vet Ointment	Dechra	9N-76855
Fluorescent microscope	Olympus	Olympus IX81