JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

インフルエンザ A ウイルス (IAVs) は、重要な人間の呼吸器病原体です。IAVs の病原性を理解して新しいワクチン接種のアプローチの臨床テストを実行するには、人間の生理を模倣した動物モデルが必要です。ここでは、IAV 病因、体液性応答および感染症のマウスモデルを用いたワクチンの有効性を評価する手法について述べる。

要約

インフルエンザ ウイルスは引き起こす以上 500,000 の死世界1と単独で直接医療と入院費と仕事欠勤2を考慮した米国の 120 億ドルの年間コストに関連付けられています。動物モデルはウイルスの病原性、宿主-病原体相互作用、免疫反応を評価する A 型インフルエンザ ウイルス (経年) 研究で重要な現在および/または新規ワクチンの効果は抗ウイルス薬だけでなく、アプローチします。彼らの免疫システムは進化的人間に似ているので、マウスが有利な小さな動物モデル、彼らが遺伝的に同一科目として商用ベンダーから利用できる、複数の系統を評価するために悪用される可能性があります。感染症の遺伝的な根拠、比較的安価で操作が容易です。IAV 感染気道を介して人間を要約するには、マウスはバイオ セーフティの適切な抑制の下で伝染性の IAVs 鼻腔内接種前に麻酔最初。感染後 IAVs の病因は毎日 (体重) の罹患率と死亡率 (生存率) 率を監視することによって決定されます。さらに、ウイルスの病因は上 (鼻粘膜) または下 (肺) 感染マウスの気道でウイルスの複製を評価することによっても評価できます。IAV 感染体液性反応を非侵襲的な出血、二次抗体の検出によって急速に評価できる合計の存在を検出または中和抗体アッセイ向け。ここでは、方法について述べる、一般的なマウスの鼻腔内感染するために使用 (i.n) IAV とし、病因、液性免疫応答と保護の有効性を評価。

概要

IAVs は、オルトミクソ ウイルス科の家族3に分類されるエンベロープ ウイルスです。負の極性3と 8 の単一座礁させた RNA の分子が含まれます。ヒトでは、IAVs は、新規ウイルスは人間の人口4で導入されたときに、季節性のエピデミックおよび重要な結果の時折パンデミックを引き起こします。また、季節 IAVs は、生産の世界的な高い経済損失毎年2,5人間高と急速に送信されます。IAV 症状咳、鼻づまり、発熱、倦怠感、頭痛、食欲不振、筋肉痛、しかし、ウイルス免疫不全患者6のより深刻な病気を引き起こすことができます。実際には、世界保健機関 (WHO) は、季節性インフルエンザのウイルスは、毎年1300,000-500,000 死亡、世界を引き起こすことを計算します。現在のインフルエンザ予防とヒトの治療食品医薬品局 (FDA) によって承認された医薬品の唯一の 2 つのクラスがある: ノイラミニダーゼ (NA) 阻害剤 (例えばオセルタミビル) と (は例えば、M2 イオン チャネルのブロッカーアマンタジン);ただし、薬剤耐性ウイルスの亜種の出現は、関心の高まりです。予防接種は、したがって、IAVs 感染症から人間を守る最良の医療の選択肢になります。までに、インフルエンザの 3 つのタイプ人間の使用のために FDA によって認可されるワクチンが利用可能な: 組換えウイルス赤血球凝集素 (HA) 蛋白ワクチン、不活化インフルエンザ ワクチン (IIV) とライブ弱毒インフルエンザ ワクチン (LAIV)5,7. 3 つのワクチンは、ウイルスの HA 蛋白質、IAVs に対する中和抗体の主要なターゲットに対する適応免疫応答を誘導するために設計されています。

IAV 感染研究生体内で検証済みのマウス ・ モデル

要因を検討し、とりわけ、IAV 病態8,9,10,11, ウイルス病12および/またはウイルス伝送13 に貢献する動物モデルを使用されています。 ,14,9,10,15を薬新しいワクチンや抗ウイルス剤の有効性をテスト。マウス (ハツカネズミ) は、いくつかの理由 IAV 研究の最も広く使用された動物モデル: 1) 免疫系は進化的に似たような人間の存在を2) 低コストなど動物の購入、住宅再生;簡単に操作および格納; 3) 小型サイズ均一な反応と結果を取得する 4) 最小ホスト変動5) マウス生物学、ゲノム シーケンスを含む大規模な知識6) 多くの利用可能な分子生物学や免疫学の試薬;7) 使用可能なノックアウト (KO) マウス ウイルス感染の特定のホスト蛋白質の貢献を研究するには8) 感染症の遺伝的な根拠を評価するために利用できる複数のマウス系統。

体内IAV 勉強する現在利用可能ないくつかのマウスの系統があります。感染症, 線量, ウイルス株は、すべてのルートと同様、年齢、免疫状態、セックス、遺伝的背景とマウスひずみ IAV 感染マウスの結果に影響します。彼らは元系統16,17,18,より IAV 病気にかかりやすいので、IAV 研究で使用される最も一般的なマウス系統は BALB/C および、もっと最近、DBA.2 マウス C57BL/619,20します。 重要なことは、免疫反応も異なることがありますマウスひずみ18,19,20によって。したがって、マウスの IAV 緊張が行われる実験に最適なオプションを選択するすべての入手可能な情報を回復する非常に重要です。

マウスは、IAV と研究生体内で感染症の動物モデルは、実験的なデザインで考慮する必要があるいくつかの制限がある.例えば、マウスを用いた生体内での研究の主な制限は、IAVs をマウスの間で送信しないことです。したがって、伝送の研究より受け入れられる動物モデル (例えばフェレット、モルモット) が使用される16,17,21。さらに、マウスで経年の症状と人間のいくつかの違いがあります。人間と違って、マウスを開発しない IAV 感染時に発熱逆に、彼らは低体温症16,17を提示します。マウス、IAV レプリケーションは上気道ではなく下気道 (肺) に集中しています。したがって、IAV のマウスに対する病原性は人間に見られるように常に相関しません。完全に、メリットが限られている不利な点を上回る、のでマウスはインフルエンザ ウイルスの病原性、免疫原性およびワクチンと抗ウイルス剤の研究で予防効果を評価するために使用する最初の動物モデルを表します。さらに、それは IAV IAV 感染の小さな動物モデルで以前証拠なし大動物モデルを使用して、研究を実施する倫理的に許容できません。本稿で述べるマウスの鼻腔内感染する方法 (i.n と) IAV、重大度とウイルス感染の進行状況を監視する方法および液性免疫応答と保護の有効性を評価するために必要な実験を実施する方法。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

プロトコル

ここで説明したすべての動物のプロトコル制度動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ロチェスター大学医学部・歯学部、大学の制度的バイオ セーフティ委員会 (IBC) によって承認され、遵守ケアと国立研究評議会 22 の実験動物の使用のためのガイドの推奨事項。設備とビバリウムと実験動物医学医学部・歯学部のプログラムの AAALAC インターナショナルによって認定されている州法、連邦法、国立衛生研究所 (NIH) ポリシーを遵守します。本稿で説明した動物のプロトコルに準拠する各機関に適用される類似した要件

。

1。 小さな脊椎動物の使用

注: 適切な個人保護装置 (PPE) はマウスを操作するため必要です。使い捨てつなぎ服、靴カバー、ヘッドのボンネット、マスク、手袋、最小要件が含まれます

。
  1. IACUC プロトコールに従ったケージあたり最大 5 マウスを配置します。動物は死んでいるように安楽死 (2 番目は物理的なメソッドである必要があります) の 2 つの方法でマウスを安楽死させる IACUC プロトコルに続く
    。 注: 罹患率と死亡率の評価を経年で実験、初期体重の 20% を失ったマウス実験的エンドポイントに達したと考えられていたし、CO 2 ととして頚部転位を安楽死させ、セカンダリの物理的な方式です。この体重の割合は、他の機関で異なる場合があります。IAV 感染後のマウス肺と鼻粘膜の収集場所の手順でマウス 2,2,2 tribromoethanol (TBE) の致命的な線量を安楽死させたし、物理の第 2 の方法として静脈、肝を切断することによって。女性 6-に-8 週齢の c57bl/6 マウスが購入し、特定病原体フリーの条件の下でロチェスター大学医学部・歯学部大学で動物のケア施設で維持します
    2. 。

2。バイオ セーフティ

注: このレポートの IAVs マウスに感染するために使用、A/Puerto リコ/8/34 新型インフルエンザ a/h1n1 (PR8 WT) 22 , 23 の一般的な実験室のマウスに適応したひずみと温度敏感な LAIV バリアント、PR8 LAIV 8。IAV 感染症 (生体外で または 生体内で)、細胞培養、生物学的安全キャビネット [バイオ セーフティ レベル (BSL)-2 での生体試料を含むすべての手順を実行の条件。猛毒 IAV 系統を使用している場合、他の BSL のスーツまたは包含条件を利用します

。
  1. クリーン バイオ セーフティ キャビネット塩素二酸化消毒する前に、この原稿で説明したすべての実験手順を実行した後。適切な IBC 推奨事項に従って使用の前後にすべての解剖素材 (はさみ、メス、解剖鉗子) と Dounce ホモジナイザーを消毒します。IBC と IACUC の適切なガイドラインの下で手続き中に生成されるすべての材料破棄します
    2. 。

3。鼻腔内感染

特定病原体フリーの条件の下で
  1. 場所女性 6-に-8 週齢 C57BL/6 マウス。整理し、ラベルをマウスにウイルスと用量使用ケージ。マウスの耳パンチ コードを用いた各ケージや尾の絵画などの別の承認方法を識別します。1 檻あたり最大 5 マウスを配置します
    2. 。
  2. 準備 IAV の希釈 (蛍光形成単位 (FFU)/マウス) 滅菌 1 リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) x 30 μ L/マウスの総量無菌条件の下で。氷の上のウイルスの接種材料を維持します。式でウイルスの希釈を追加する IAV の量を計算: ((マウスあたり X FFU/30 μ L) 最終巻 x)/ウイルス力価を株価します
    3. 。
  3. はスケールでマウスの重量を量る、各マウス (0 日目) の体重を記録します。仰臥位でマウスを押したまま、人差し指と親指の間に首の首筋でピックアップしています。小指で手に対して尾を保持します
    4. 。
  4. マウスの腹腔内麻酔 (i. p.) TBE の腹部の右側の尾の 2/3 に針を挿入することで 240 250 mg/kg とします。簡単に針を撤回する前に一時停止します。マウスをケージに戻り、5 分を待つ
  5. は、マウスを麻酔しながら乾燥を防ぐため目に滅菌の眼軟膏を適用します。(すなわち、つま先ピンチ) ペダル逃避反射の欠如によってマウスを麻酔かどうかチェックしてください。彼らは、ウイルスまで咳がマウスは完全に麻酔がない場合
    6. 。
  6. マウス完全に麻酔をかけられときに、背の臥床にマウスを置きます。ピペット先端部が、鼻孔、ゆっくりとウイルスの接種材料の 30 μ L を含むを置くが、常にソリューションを取り出します。マウスがドロップ消える菌を観察することによって準備を吸入してください
    7. 。
  7. は、マウスは TBE の温度と呼吸の率を低下させることが、呼吸をチェックしてください。動物を背臥床に置いて、ケージに戻ります。呼吸困難の兆候のマウスを監視し、, 垂直に保持している動物に息をし、呼吸 24 を駆動への影響を誘発するのには、マウスを助けます。(30-45 分それで麻酔された後) の意識が回復するまでマウスを監視します
    8. 。

4。ウイルスの病因 ( 図 1) の特性

  1. の罹患率と死亡率 ( 図 1 および 図 2) 評価
    1. 感染 i.n と女性 6-に-8 週齢の c57bl/6 マウスの 3-4 グループ (グループ、n あたり少なくとも 5 マウス = 5) 10 倍用量 (10、10 2 10 3 と 10 4 FFU/マウス) PR8 WT 3 で説明したようの
      2. 。
    2. モニター約食物摂取による体重変化を最小限に抑えるために同時に次の 14 日間スケールを持つマウスの重量を量る。セクション 1 で説明したように最初の体重の 20% を失うマウスを安楽死させる
      3. 。
    3. 14 日後、セクション 1 で説明したように、ウイルス感染を生き残るためマウスを安楽死させる
      4. 。
    4. は、ウイルス マウスの 50% 致死量 (MLD 50) リードと Muench 25 の方法を使用して得られた生存データに基づいて計算します。まず、計算割合距離 (PD):
      figure-protocol-3226
      1. は次に、次の数式によって MLD 50 を計算:
        figure-protocol-3345
  2. 肺と鼻粘膜でウイルス抗体の評価 ( 図 1 と 図 2。)
    1. 肺と鼻粘膜
        の回復
      1. i.n と女性 6-に-8 週齢の c57bl/6 マウスに感染する (n = 6) テスト 10 10 4 PR8 WT FFU のセクション 3 で説明したようにウイルスの線量と
        2. 。
      2. 日 2 のマウス肺と鼻粘膜の収集 (n = 3) と 4 (n = 3)。
        1. TBE (500 mg/kg) の致死量 (i. p.) を持つマウスを安楽死させます。背臥床に動物を配置し、70% エタノールで胸郭の上毛皮を消毒します。腹部の基部を胸骨からメスで皮膚を切る。はさみで切開の基地からマウスの横の部分を 1 cm カットを作る
          2. 。
        2. は、セカンダリの安楽死方法としてマウスを出血するハサミで肝静脈をカットしました。腹位置に動物を配置し、流出する血液を許可する 2 分を待ちます。この手順は肺で血液を減らすことが重要です
          3. 。
        3. は、鉗子、はさみを解剖の助けを借りて最初の切開をした腹部のベースにマウス (頭部を含む) の全体の上の部分から皮膚を削除します。頭をハサミでカットし、乾燥滅菌シャーレ
          4. 。
        4. は、上顎骨と下顎骨の間の接合をはさみでカットし、下顎骨を破棄します。はさみで頬骨の円弧の両端に 2 つのカットを行いそれらを削除します。解離性の鉗子の助けを借りて目を削除します
          5. 。
        5. 解離性の鉗子で頭蓋骨を保持し、メスと矢状縫合線に沿って頭蓋骨をカットします。鼻の粘膜を確認するため脳と頭蓋の 2 つの半分を持ち上げて取り外します。鼻高は篩骨と鼻、上顎骨、口蓋, 頬骨, を含む頭蓋骨の前部の骨によって囲まれている
          6. 。
        6. メスを使用して、脳と頭蓋の一部をカットし、破棄します。生殖不能の管に鼻粘膜と頭蓋の他の部分を配置します。サンプルは同じ日に処理される場合はドライアイスを迅速に凍結することは、場合に、サンプルはその後に処理されます氷 (4 ° C) の上のチューブを格納します
          7. 。
        7. サンプルの汚染を避けるためには、きれいにし消毒回復各組織間、および塩素ガスの消毒剤と各動物解剖解剖ツール
          8. 。
        8. 肺を収集し背臥床に動物を配置、胸膜をはさみでカットします。胸骨の両側に 1 cm で肋骨を切断することによって胸郭を開きます。はさみで優れた部分を胸郭の基地からカットを作る
          9. 。
        9. 胸郭の優れた部分の 2 つの切開とハサミで断面、胸のプレートを外します。鉗子で肺を保持、(肺) の直前に気管の終わりをハサミで切って、肺生殖不能の管に。サンプルは同じ日に処理される場合はドライアイスを迅速に凍結することは、場合に、サンプルはその後に処理されます氷 (4 ° C) の上のチューブを格納します
          。 注: 組織サンプルを収集、同じ日に均質化し、ウイルス抗体価を後で分析する-80 ° C で保存します。サンプルなく受けること繰り返し凍結融解サイクル ウイルス力価を決定する前に重要です。また、処理するまで-80 ° C で組織サンプルを格納します
          10. 。
    2. 肺と鼻粘膜の均質化
      1. 滅菌 Dounce ホモジナイザーに肺や鼻粘膜を配置し、かぜメディアの 1 つの mL を追加。肺が完全に崩壊するまで室温 (RT) で約 1 分の杵を上下に移動することによってサンプルを均質化します。4 生殖不能の管とストアで均質化されたサンプルを置く ° C. 使用各サンプルの新しい Dounce ホモジナイザー
        2. 。
      2. は、収集した新しい滅菌チューブに上清を 5-10 分の 300 x g でサンプルを遠心分離機します。ウイルスの滴定が同じ日に実行される場合、4 ° C で上清を保存し、ペレットを破棄します。また、(-80 ° C)、均質化の上清凍結後ウイルス力価を評価する
        3. 。
    3. 間接蛍光抗体法によるウイルス滴定
      1. 滴定、前日シード マディン-ダービー犬腎臓 (MDCK) 上皮細胞 (4 × 10 4 細胞/ウェル) ティッシュ文化メディアで 80 〜 90% の合流点に到達すると 96 ウェルのプレート。5% CO 2 と 37 ° C の定温器にセルを配置します。ウイルスの滴定の日がウイルス感染を開始する前に、単分子膜の確認を顕微鏡下で細胞をチェックします
        2. 。
      2. 準備 1:10 96 ウェル プレートの感染媒体の均質化試料 (肺や鼻粘膜) の上澄みの希薄。ウイルスの滴定を実行するには、ウイルス抗体価を正確に判断をトリプリケートします。
        1. 96 ウェル プレートで井戸のそれぞれに感染メディアの追加 90 μ L。A1、A2、A3 の 3 通の各サンプルのウイルス力価を評価するための井戸に 10 μ L の均質化試料の上澄みのいずれかを追加します。A4、A5、A6 の井戸に均質化試料の上澄みを別の 10 μ L を追加します。サンプルの残りの部分で連続して同じ希釈を実行します
          2. 。
        2. 、A の行に上清のサンプルを追加した後は、上下にピペッティングして混合するマルチ チャンネル ピペットを使用します。10 μ L A の行から行 * 変更するヒント間転送希釈とよく混ぜます。(H) の最後の行に到達するまでこの手順を繰り返します
          3. 。
      3. 組織培養培地 (ステップ 4.2.3.1) を取り除き 96 ウェル プレートでの 1x PBS 100 μ L/ウェルで二回洗う MDCK 細胞から真空吸引器マルチ アダプターを使用します
        4. 。
      4. 転送 50 μ L/ウェル MDCK と 96 ウェル プレートに均質化試料の希釈した上清のセルです。低い希釈 (列 A) により高い希釈 (列 H) を転送を開始します。この場合、別の行の間ヒントを変更する必要はありません
        5. 。
      5. は、ウイルス吸着できるように RT で 1 h のロッキング プラットフォーム上 96-ウェル プレートを置きます。ウイルス吸着後真空アスピレータ マルチ チャンネル アダプターを使用して接種を削除し、感染後メディアの 100 μ L/ウェルを追加します。5% CO 2 の 33 ° C または 37 ° C の定温器で 8 h の感染細胞を孵化させなさい。4.2.3.6 の手順で説明するよう、固定、染色、イメージング、およびウイルス力価計算に進む – 4.2.3.12
        6. 。
      6. は、真空吸引器マルチ チャンネル アダプターを使用して 96 ウェルのプレートから組織培養培地を削除します。修正し、室温に 20 分間固定/透過液の 100 μ L/ウェルとセルを permeabilize
        注意: ホルムアルデヒド曝露を防ぐために発煙のフード固定/透過ソリューションを使用しています
        7. 。
      7. 真空アスピレータ マルチ チャンネル アダプターを使用して固定/透過ソリューションを削除、1x PBS で洗浄しインキュベートした店で 1 時間のためのソリューションを 4 ° C でソリューションをブロック内のセル ブロックと固定セルまたは次のステップに進んでください
        8. 。
      8. は、ブロックのソリューションを削除します。1 μ G/ml モノクローナル抗体 (mAb) 抗 NP HB の 50 μ L/ウェルを追加-65 抗体希釈液で希釈しました。37 ° c. の異なる mAb または polyclon で 1 時間インキュベートします。アル抗体 (pAb) アンチ PR8 を使用できます
        9. 。
      9. 一方、希釈 1: 200 (FITC) かに-共役二次抗マウス抗体の抗体希釈液で。ソリューション ルートで 5-10 分の 1,700 × g で遠心分離します。その他 fluorophores が付いているその他二次抗体を使用できます
        10. 。
      10. は一次抗体を削除し、1 × pbs 100 μ L/ウェルで 3 回を洗います。二次抗体希釈の 50 μ L/ウェルを追加し、37 ° c. 削除二次抗体と 1 × pbs 100 μ L/ウェルで 3 回洗浄で 30-45 分間インキュベートします。プレートの最後の洗浄のままにします
        11. 。
      11. は、肯定的なステンド グラス (緑) の細胞の数を決定する蛍光顕微鏡下で細胞を観察します。FFU/mL をカウントすることによってウイルスの力価を計算します。数式を使用して 30 50 陽性染色細胞で希釈から FFU/mL の表現ウイルス力価を計算: ((n1 + n2 + n3)/3) x 20 x 1/希釈
        12. 。

5。評価の体液性免疫応答 ( 図 3)

  1. 女性 6-に-8 週齢の c57bl/6 マウスの i.n と 3 グループに感染 (n = 5) の異なる投与量 (10 2 10 3、および 10 4 FFU/マウス) PR8 LAIV のモック感染する 1 つのグループ (n = 5) 陰性対照として滅菌 PBS × 1。セクション 3 で説明どおり i.n マウス感染。 顎下出血使って 4 mm のランセット 26, マウスの血液を収集
    1. マウス顎下腺穿刺
      1. 14 日予防接種後出血または別 IACUC を使用してメソッドを承認します。
        1. ホールドで人差し指と親指の間に首の首筋で拾ってマウス。マウスを固定する小指と手に対して尾を保持します
          2. 。
        2. は、側臥位で頬を参照してくださいにマウスを置きます。レトロな軌道および顎下静脈内頚静脈との合流点で穿刺を行います。ランセット (4 mm) をシンクし、生殖不能の管に血液を回復 (約 0.2 - 0.4 mL/マウスが回復)。数秒間滅菌ナプキンによる穿刺に圧力を適用します。ケージにマウスを配置します
          3. 。
      2. 37 ° C で 1-2 時間の管を入れ、血液から血清を分離する RT で 30 分のための 700 × g で遠心分離します。新しい生殖不能の管にピペットを使い、血清の上層に転送します。赤い血球 (赤血球) のペレットを破棄します。-20 で血清を保存 ° C
  2. ウイルス蛋白質に対する抗体の解析
    1. 感染 MDCK 細胞抽出液の準備
      1. 感染、前日シードの 4-5 倍の 10 の 6 MDCK 細胞 (80 ~ 90 に到達する 1 つの 100 mm ディッシュ% 次の日合流点) 組織文化メディアで。5% CO 2 と 37 ° C の定温器にセルを配置します。ウイルス感染の日ウイルス感染を開始する前に、単分子膜の確認を顕微鏡下で細胞を確認してください
        2. 。
      2. 4 mL 合計最終巻の感染媒体の PR8 WT の感染 (MOI) の低い (0.001) 多様性のウイルスの希釈を準備します。式で PR8 WT の量を計算 ((n ° セル x X MOI) 最終巻 x)/ウイルス力価を株価します
        3. 。
      3. は MDCK 細胞板から組織培養培地を吸引し、4 mL の 1x PBS で 2 回洗ってください。ウイルス接種 (4 mL) を追加し、ロッキング ウイルス吸着できるように RT で 1 h 用のプレートを入れてください。真空接種ウイルスを削除し、TPCK 扱われるトリプシンの 1 μ g/mL を含む感染後メディアの 8-10 mL を追加します。5% CO 2 の 33 ° C または 37 ° C の定温器で 48-72 時間感染細胞をインキュベートします
        4. 。
      4. 細胞スクレーパーを用いて細胞を分離、細胞・組織培養培地 15 mL チューブにピペットを使いを収集しています。吸引した上清で 5-10 分のための 400 の x g でチューブを遠心分離機、RIPA バッファーの 1 mL の細胞ペレットを再懸濁し、1.5 mL の生殖不能の管にミックスを入れてください。氷上で 20-30 分の間孵化させなさい
      5. 4 で 20-30 分間遠心する 1,300 x g でチューブ ° C. 慎重に上清を回復します。セル抽出 100 μ 因数-20 でストア ° C
      6. 抗体 9 , 10 , 11 の存在のためにそれらを評価する前に酵素免疫測定法 (ELISA) で説明されているように細胞抽出液を滴定します。, 27. (上記のように準備) モック感染 MDCK 細胞からネガティブ コントロールとして含めるセルを抽出します
        7. 。
    2. Elisa 法 ( 図 4)
      1. 96 ウェル感染 MDCK 細胞の適切な希釈抽出 (1: 200 - 1:1, 000) の間に通常の 1x PBS でポリスチレンをコートします。モック感染 MDCK 細胞抽出物の同じ希釈陰性対照として別板をコートします。孵化 4 宿泊 (O/N) ° C
      2. は、真空吸引器マルチ チャンネル アダプターを使用して上澄みを除去し、100 μ L/ウェルのマルチ チャンネル ピペットを使い、1 × PBS で 1 回洗浄します。100 μ L/ウェル室温 1 時間解決を妨げるを追加することで非特異的結合をブロック
      3. 一方、各マウス手順 5.1 96 ウェル プレートでの抗体希釈液で感染から血清中の (希釈 1:50 開始) 2 倍のシリアル希薄を作る
        4. 。
      4. は、真空吸引器マルチ アダプターを使用したポリスチレン 96 ウェルのプレートからブロッキング ソリューションを削除します。適切な井戸の各マウス血清希釈の 50 μ L を追加し、37 で 1 時間インキュベート ° C
      5. は、真空吸引器マルチ アダプターとマウス血清を削除します。マルチ チャンネル ピペットを使用して蒸留水で 3 回の井戸を洗ってください。抗体希釈液で希釈する西洋わさびペルオキシダーゼ (HRP) 1:2,000 と抱合抗マウス抗体の 50 μ L/ウェルを追加します。37 ° C で 1 時間孵化させなさい
      6. は、真空吸引器マルチ アダプターと二次抗体を削除します。マルチ チャンネル ピペットを使用して蒸留水で 3 回の井戸を洗ってください。B. 追加 100 μ L/ウェル基板の 1:1 溶液を混合してテトラメチルベンジジン (TMB) 基板ソリューションを準備し、暗闇の中で常温の 5-10 分間インキュベートします
        7. 。
      7. は、だから 0.2 N H 2 の 100 μ L/ウェルの追加によって反作用を停止 4。450 でプレートを読む ELISA プレート リーダーに nm
        8. 。
      8. は、MDCK 感染 96 ウェル プレートで得られた値から MDCK モック感染 96 ウェル プレートの各希釈で取得した値を減算します。それぞれ異なる血清希釈の平均値を計算し、標準偏差 (SD) を示すグラフで表す
        9. 。
  3. 中和抗体の解析
    1. 赤血球凝集抑制 (ハイ) 試金 ( 図 5)
      1. 受容体とマウス血清を扱うハイ分析を実行する前に(RDE) 血清中にすべての非特異的阻害剤を除去するために酵素を破壊します。RDE 作業希釈の 4 巻にマウス血清の 1 ボリュームを追加 (血清希釈は 1:5)。O/N (12 - インキュベートします。18 h) 37 ° C の水浴中です
        2. 。
      2. 熱、RDE を不活化する 30 分の 56 ° c 血清
        3. 。
      3. はあらかじめ標準 HA アッセイ 28 PR8 WT の赤血球凝集活性 (天后) を判別します。ウイルスのハウが決定される希釈ウイルス株式の 1x PBS で 50 μ L あたり 8 天后
        4. 。
      4. は、96 ウェル V 底プレート RDE 治療血清の 2 倍のシリアル希薄 (12 希釈) を準備します。各血清サンプルを (例えば A12 に A1) の 1 つの行を使用します。
        1. 1 x の追加 25 μ L の PBS は、A1 から A12 井戸。1 つの行にそれぞれの血清サンプルをテストします。25 μ L の列 (A1) の最初の井戸の 1 × PBS に RDE 治療血清 (1:5) 25 μ L を追加します。最初の血清希釈は 1:10 します
          2. 。 最初の列に追加するすべての RDE 治療血清
        2. (例えば A1, B1, C1)、マルチ チャンネル ピペットを使用して上下にピペッティングによる血清および 1x PBS をミックスします。2 番目の列 (たとえば、A1 A2 からから) 最初の列から 25 μ L の希釈血清を転送します。希薄の間ヒントを変更し、ミックスします
          3. 。
        3. 繰り返し手順 5.3.1.4.2。 最後の列を (例えば、A12、B12、C12) に到達するまで。最後の列は、すべての井戸 (25 μ L) でボリュームの整合性を保つから 25 μ L を破棄します。負の制御として、血清なし 1 × PBS ののみ 25 μ L を含む井戸の 1 つの行が含まれます
          4. 。
      5. 96 ウェル V 底プレートの血清と井戸のそれぞれに 8 天后/50 μ L に希釈して、IAV の追加 25 μ L; それぞれの最終巻も 50 μ L、ウイルスの 4 天后を含みます。内容を繰り返しピペッティングで混ぜます。室温 1 時間孵化させなさい
      6. 井戸のそれぞれに 0.5% トルコ赤血球の追加 50 μ L。内容を繰り返しピペッティングで混ぜます。氷の上の 30-45 分のプレートを孵化させなさい。読まれたハイ試金視覚制御井戸 (1 x PBS) における赤血球形成の井戸の底で赤い沈殿 (すなわち ペレット).
        注: 鶏の赤血球などの他の種から、モルモットや馬も使用できます
        7. 。
      7. は、最後も、赤血球は赤いペレットを形成され、赤血球凝集が発生しませんを識別することによってハイ価を計算します
        。 注: この希釈の相互価値はハイ価です。相互の値が 20、1:20 を補正するための係数で乗算されます最初の行で血清の希釈します
        8. 。
    2. ウイルス中和試験 (VNA) ( 図 6)
      1. VNA 前日準備 5.2.1.1 の手順で説明するよう次の日 80-90% の合流点を到達する 96 ウェル プレートで MDCK 細胞。200 FFU/25 μ L を持っている感染メディアで PR8 WT の希釈を準備します
        2. 。
      2. 不活性化 1 h. 56 ° C でマウス血清は、マウス血清 96 ウェル プレートを使用して帳票あたり 2 倍連続希釈 (12 希釈) を確認します。 (たとえば A1) 最初の行の最初のよく感染メディアの
        1. 追加 40 μ L の血清 160 μ L (血清希釈 1:5)。ピペッティングで混ぜます。他の井戸に感染メディアの 100 μ L を追加 (H12 に A2).
        2. (例えば、A1 A2 からから) 1:2 の希釈液を作るための 2 番目の行を最初の行から転送 100 μ L。ピペッティングで希薄とミックスのヒントを変更します。最後の行 (例えば A12) までこれを繰り返します。最後の行は、すべての井戸 (100 μ L) でボリュームの整合性を保つから 100 μ L を破棄します
          3. 。
      3. すべてのウェルに IAV 希釈の追加 100 μ L。室温 1 時間インキュベートします。一方、真空吸引器マルチ チャンネル アダプターを使用して 96 ウェル プレートで MDCK 細胞から組織培養培地を削除し、1 × pbs 100 μ L/ウェルで二回洗う
        4. 。
      4. MDCK 細胞の各 96 ウェル プレートでコントロールの 2 つの行のままにします。1 つの行は否定的な制御 (細胞ウイルスと血清なし) とその他の行は感染症 (血清またはモック感染マウス血清の不在でウイルスと細胞) の肯定的な制御します
        5. 。
      5. 転送 50 μ L/ウェル ウイルス抗体プレートから MDCK 細胞の 96 ウェルのプレートに。ウイルス吸着できるように RT で 1 時間揺動のプラットフォーム上に皿を置いています
        6. 。
      6. 真空アスピレータ マルチ チャンネル アダプターを使用してウイルス抗体菌を削除し、TPCK 扱われるトリプシンの 1 μ g/mL を含む感染後メディアの 100 μ L/ウェルを追加します
        7. 。
      7. 肯定的な制御 (コントロール血清、血清の不在で感染細胞) の細胞変性効果 (CPE) が観察されるまで 5% CO 2 の 33 ° C または 37 ° C の定温器で 3 〜 4 日の細胞をインキュベートします
        8. 。
      8. 真空アスピレータ マルチ チャンネル アダプターを使用して組織培養培地を取り除き、0.1% クリスタル バイオレットの 100 μ L/ウェルを追加します。真空吸引器マルチ アダプターを使用したクリスタル ・ バイオレット液ルート削除で 1 時間インキュベートします。蒸留水で 3 回洗浄します。乾燥室温プレート
      9. は MDCK 細胞の単層でコンフルエントの細胞を保持する最高の希釈を識別することによって VNA 価を計算します
        。 注: この対応する希釈の相互価値は中和抗体価です。相互の価値は、1:10 を修正する 10 の係数で乗算されます行の最初も血清の希釈します
        10. 。

6。保護の有効性ワクチン ( 図 3) の評価

  1. 予防接種 i.n と女性 6-に-8 週齢の c57bl/6 マウスのグループ (n = 11) PR8 LAIV 線量 (FFU/マウス) をテストし、模擬接種マウスの別のグループ (n = 11)滅菌 PBS × 1。第 3 節で前述したようにマウス i.n と予防接種を実行します
    2. 。
  2. 14 日後ワクチン接種、マウスを出血し、セクション 3 で説明したように、血清を収集します。合計とに対する中和抗体 PR8 WT セクション 5.1.1 で前述の存在を分析します
    3. 。
  3. 15 日後予防接種を測定し、マウスの体重 (0 日) を記録します。チャレンジ 3 のセクションで前述したように PR8 WT (相同の挑戦) の致命的な線量をマウス i.n と
    4. 。
  4. 体重と生存率を測定する (n = 5/グループ) の罹患率と死亡率はワクチン接種マウス (セクション 4.1) PR8 WT チャレンジ プロデュース評価への挑戦後 14 日間です
    5. 。
  5. マウス肺と鼻粘膜を回復 (n = 3/日) 2 日目に 4 後 PR8 重量の均質化に挑戦し、肺を分析し、鼻粘膜にセクション 4.2 で説明されているよう評価ワクチン接種マウスで PR8 WT のウイルス複製します
    6. 。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

結果

マウスにおけるウイルスの病因の評価

IAV の病因罹患率とその感染による死亡率に関連しています。これらの 2 つのパラメーターをマウスで簡単に評価できる: IAV 罹患率は感染マウスの体重減少と関連し、生存率は死亡率 (図 1) を示します。体重、IAV 感染マウスの生存率は通常感染8

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

ディスカッション

IAV マウス モデル広く IAV 病態、免疫原性と保護の有効性のvivo の研究のため。マウスのサイズが小さいため簡単に操作して、フェレット、モルモットなど他の動物モデルと比較して保存します。また、動物がコストの面で使いやすさ、ハウジングおよび再生に使用できる多数の動物が必要となる予防接種前臨床テストで。とりわけ、マウスが使用されているので複数の研究分野は、い?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

LM S 研究室でインフルエンザ ウイルスに関する研究が部分的に、ニューヨーク インフルエンザ センターの卓越性 (NYICE)、インフルエンザ研究と監視 (CEIRS) のための卓越性の NIAID センターのメンバーによって資金を供給します。ウェンディ ・ ベイツは、原稿の修正に彼女のサポートを感謝いたします。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cellsATCCCCL-34
Six- to eight-week-old female C57BL/6 miceNational Cancer Institute (NCI)01XBE
Turckey red blod cellsBiolink IncStore at 4 °C
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)Corning Cellgro15-013-CVStore at 4 °C
Fetal Bovine Serum (FBS)Seradigm1500-050Store at -20 °C
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100xCorning30-009-CIStore at -20 °C
Penicillin/Streptomycin (PS) 100xCorning30-00-CIStore at -20 °C
Bovin Albumin solution (BA)Sigma-AldrichA7409Store at 4 °C
Bovin Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA9647Store at 4 °C
Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsinSigma-AldrichT8802Store at -20 °C
Neutral Buffered Formalin 10%EMD65346-85Store at RT
Triton X-100J.T.BakerX198-07Store at RT
Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65ATTCH16-L10-4R5Store at -20 °C
Polyclonal rabbit anti-mouse immunoglobulins/FITCDakoF0261Store at 4 °C
ECL Anti-mouse IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibodyGE HealthcareLNA931V/AGStore at 4 °C
TMB substrate setBioLegend421101Store at 4 °C
Vmax Kinetic plate readerMolecular Devices
Dounce Tissue GrindersThomas Scientific7722-7
Receptor destroying enzyme, RDE (II)Denka Seiken Co.370013Store at -20 °C
Crystal VioletFisher ScienctificC581-100Store at RT
96-well Cell Culture PlateGreiner Bio-one655-180
Cell Culture dishes 100 mmGreiner Bio-one664-160
Nunc MicroWell 96-Well MicroplatesThermo Fisher Scienctific269620
Nunc 96-Well Polystyrene Conical Bottom MicroWell PlatesThermo Fisher Scienctific249570
Puralub Vet OintmentDechra9N-76855
Fluorescent microscopeOlympusOlympus IX81

参考文献

  1. Girard, M. P., Cherian, T., Pervikov, Y., Kieny, M. P. A review of vaccine research and development: human acute respiratory infections. Vaccine. 23 (50), 5708-5724 (2005).
  2. Arnold, S., Monto, M. D. Epidemiology and Virology of Influenza Illness. Am J Manag Care. 6, Suppl 5. 255-264 (2000).
  3. Palese, P., Shaw, M. L. Orthomyxoviridae: The Viruses and Their Replication. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A. , 5th ed, Lippincott Williams and Wilkins. (2007).
  4. Li, K. S., et al. Genesis of a highly pathogenic and potentially pandemic H5N1 influenza virus in eastern Asia. Nature. 430 (6996), 209-213 (2004).
  5. Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. Reverse Genetics Approaches for the Development of Influenza Vaccines. Int J Mol Sci. 18 (20), (2017).
  6. Kunisaki, K. M., Janoff, E. N. Influenza in immunosuppressed populations: a review of infection frequency, morbidity, mortality, and vaccine responses. Lancet Infect Dis. 9 (8), 493-504 (2009).
  7. Belshe, R. B. Live attenuated versus inactivated influenza vaccine in infants and young children. N Engl J Med. 356 (7), 685-696 (2007).
  8. Cox, A., Baker, S. F., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L., Dewhurst, S. Development of a mouse-adapted live attenuated influenza virus that permits in vivo analysis of enhancements to the safety of live attenuated influenza virus vaccine. J Virol. 89 (6), 3421-3426 (2015).
  9. Nogales, A., et al. Influenza A Virus Attenuation by Codon Deoptimization of the NS Gene for Vaccine Development. J Virol. 88 (18), 10525-10540 (2014).
  10. Nogales, A., DeDiego, M. L., Topham, D. J., Martinez-Sobrido, L. Rearrangement of Influenza Virus Spliced Segments for the Development of Live-Attenuated Vaccines. J Virol. 90 (14), 6291-6302 (2016).
  11. Nogales, A., Huang, K., Chauché, C., DeDiego, M. L., Murcia, P. R., Parrish, C. R., Martínez-Sobrido, L. Canine influenza viruses with modified NS1 proteins for the development of live-attenuated vaccines. Virology. 500 (2017), 1-10 (2016).
  12. Garcia-Sastre, A., et al. Influenza A virus lacking the NS1 gene replicates in interferon-deficient systems. Virology. 252 (2), 324-330 (1998).
  13. Lowen, A. C. Blocking interhost transmission of influenza virus by vaccination in the guinea pig model. J Virol. 83 (7), 2803-2818 (2009).
  14. Mubareka, S. Transmission of influenza virus via aerosols and fomites in the guinea pig model. J Infect Dis. 199 (6), 858-865 (2009).
  15. Nogales, A., Baker, S. F., Martinez-Sobrido, L. Replication-competent influenza A viruses expressing a red fluorescent protein. Virology. 476C, 206-216 (2014).
  16. Margine, I., Krammer, F. Animal Models for Influenza Viruses: Implications for Universal Vaccine Development. Pathogens. 3 (4), 845-874 (2014).
  17. Bouvier, N., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).
  18. Pica, N., Iyer, A., Ramos, I., Bouvier, N. M., Fernandez-Sesma, A., García-Sastre, A., Lowen, A. C., Palese, P., Steel, J. The DBA.2 mouse is susceptible to disease following infection with a broad, but limited, range of influenza A and B viruses. J Virol. 85 (23), 12825-12829 (2011).
  19. Watanabe, H., Numata, K., Ito, T., Takagi, K., Matsukawa, A. Innate immune response in Th1- and Th2-dominant mouse strains. Shock. 22 (5), 460-466 (2004).
  20. Srivastava, B., Blazejewska, P., Hessmann, M., Bruder, D., Geffers, R., Mauel, S., Gruber, A. D., Schughart, K. Host genetic background strongly influences the response to influenza a virus infections. PLoS One. 4 (3), e4857(2009).
  21. Lowen, A. C., Bouvier, N. M., Steel, J. Transmission in the Guinea Pig Model. Curr Top Microbiol Immunol. 385, 157-183 (2014).
  22. Schickli, J. H. Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356 (1416), 1965-1973 (2001).
  23. Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A. Generation of recombinant influenza virus from plasmid DNA. J Vis Exp. (42), (2010).
  24. National Research Council (U.S.) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals., Institute for Laboratory Animal Research (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. , 8th ed, National Academies Press (U.S.). (2011).
  25. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene. 27 (3), 493-497 (1938).
  26. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34 (9), 39-43 (2005).
  27. Nogales, A. A temperature sensitive live-attenuated canine influenza virus H3N8 vaccine. J Virol. , (2016).
  28. Eisfeld, A. J., Neumann, G., Kawaoka, Y. Influenza A virus isolation, culture and identification. Nat Protoc. 9 (11), 2663-2681 (2014).
  29. Guo, H., Baker, S. F., Martinez-Sobrido, L., Topham, D. J. Induction of CD8 T cell heterologous protection by a single dose of single-cycle infectious influenza virus. J Virol. 88, 12006-12016 (2014).
  30. CDC: Centers for Disease Control and Prevention. Antigenic Characterization. , Available from: http://www.cdc.gov/flu/professionals/laboratory/antigenic.htm (2017).
  31. He, W., Mullarkey, C. E., Miller, M. S. Measuring the neutralization potency of influenza A virus hemagglutinin stalk/stem-binding antibodies in polyclonal preparations by microneutralization assay. Methods. , (2015).
  32. Gulati, U. Antibody epitopes on the neuraminidase of a recent H3N2 influenza virus (A/Memphis/31/98). J Virol. 76 (23), 12274-12280 (2002).
  33. Beare, A. S., Webster, R. G. Replication of avian influenza viruses in humans. Arch Virol. 119, 37-42 (1991).
  34. Rowe, T. Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays. J Clin Microbiol. 37 (4), 937-943 (1999).
  35. Stephenson, I., Wood, J. M., Nicholson, K. G., Zambon, M. C. Sialic acid receptor specificity on erythrocytes affects detection of antibody to avian influenza haemagglutinin. J Med Virol. 70 (3), 391-398 (2003).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

127 A

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved