Estudios de Virus de influenza A en un modelo murino de infección

Resumen

Virus de la gripe A (gripe) son importantes patógenos respiratorios humanos. Para entender la patogenicidad de gripe y realizar ensayos preclínicos de vacunas nuevos enfoques, modelos animales, imitar la fisiología humana se requieren. Aquí, describimos las técnicas para evaluar el IAV patogenia, respuesta humoral y eficacia de la vacuna utilizando un modelo murino de infección.

Resumen

Virus de la influenza causan más de 500.000 muertes en todo el mundo¹ y se asocian con un costo anual de US $ 12 billones en los Estados Unidos solo considerando médica directa y gastos de hospitalización y ausentismo de trabajo². Modelos animales son cruciales en los estudios de Influenza A virus (IAV) evaluar patogenesia viral, interacciones huésped-patógeno, respuesta inmune, y la eficacia de la vacuna actual o nuevos enfoques así como antivirales. Los ratones son un modelo animal pequeño ventajoso porque su sistema inmunológico es evolutivamente similar a ése encontrado en los seres humanos, están disponibles de proveedores comerciales como sujetos genéticamente idénticos, existen múltiples cepas que pueden ser aprovechadas para evaluar la base genética de las infecciones, y son relativamente baratas y fáciles de manipular. Para recapitular la infección IAV en los seres humanos a través de las vías respiratorias, ratones primero son anestesiados antes de la inoculación intranasal con gripe infecciosa bajo contención de bioseguridad adecuado. Después de la infección, la patogenesia de la gripe se determina mediante el control diario de la morbilidad (pérdida de peso corporal) y la tasa de mortalidad (supervivencia). Además, patogenesia viral también puede evaluarse mediante la evaluación de replicación del virus en la parte superior (mucosa nasal) o tracto respiratorio (pulmones) inferior de ratones infectados. Las respuestas humorales sobre infección de IAV pueden rápidamente evaluar sangrado no invasiva y la detección del anticuerpo secundario ensayos destinados a detectar la presencia de total o anticuerpos neutralizantes. Aquí, describimos los métodos comunes utilizados para infectar ratones intranasal (i.n) con IAV y evaluar patogénesis, respuesta inmune humoral y eficacia de protección.

Introducción

Gripe es virus envueltos, clasificados en la familia de Orthomyxoviridae ³. Contienen ocho moléculas de ARN monocatenario con polaridad negativa³. En los seres humanos, gripe causa epidemias estacionales y pandemias ocasionales de consecuencia importante cuando se introducen nuevos virus en la población humana⁴. Por otra parte, gripe estacional es altamente y rápidamente transmitida entre los seres humanos produciendo una elevada pérdida económica en todo el mundo cada año^2,5. IAV los síntomas incluyen tos, congestión nasal, fiebre, malestar general, cefalea, anorexia y mialgias, pero el virus también puede producir una enfermedad más severa en pacientes inmunocomprometidos⁶. De hecho, la Organización Mundial de la salud (OMS) calcula que el virus de la gripe estacional causan 300.000-500.000 muertes en todo el mundo cada año¹. Hay sólo dos clases de medicamentos actualmente aprobados por la Food and Drug Administration (FDA) para la profilaxis de la gripe y tratamiento en seres humanos: inhibidores de la neuraminidasa (NA) (p. ej., oseltamivir) y bloqueadores del canal iónico M2 (p. ej., amantadina); sin embargo, la aparición de variantes del virus resistentes a los medicamentos es una preocupación cada vez mayor. Vacunación, por lo tanto, sigue siendo la mejor opción médica para proteger a los seres humanos contra las infecciones de gripe. Hasta la fecha, tres tipos de influenza hay vacunas aprobadas por la FDA para el uso humano: las vacunas de proteínas recombinantes virales hemagglutinin (HA), inactivadas vacunas contra la influenza (IIV) y viva atenuada de influenza vacunas (LAIV)^{5, 7}. las tres vacunas están diseñadas para inducir la respuesta inmune adaptativa contra la proteína viral de la HA, el objetivo principal de neutralizar anticuerpos contra la gripe.

Un modelo de ratón validado para el estudio de infección de IAV en vivo

Se han utilizado modelos animales para estudiar, entre otros, IAV patogenesia^8,9,10,11, factores virales que contribuyen a la enfermedad¹² o transmisión viral^{13 ,14}, y probar la eficacia de nuevas vacunas o antivirales fármacos^9,10,15. Ratones (Mus musculus) son el modelo animal más ampliamente utilizado para la investigación IAV por varias razones: 1) el sistema inmune es evolutivamente similar al que presentan en los seres humanos; compra animal de bajo costo, incluyendo 2), la vivienda y la reproducción; 3) pequeño tamaño fácilmente manipular y almacenar; 4) variabilidad de host mínimo para obtener respuestas homogéneas y resultados; 5) un gran conocimiento de la biología de ratones, incluyendo la secuencia del genoma; 6) muchos disponible biología molecular y/o reactivos de Inmunología; 7) disponible knock out (KO) de ratones para estudiar la contribución de una proteína huésped dado en infección viral; y, 8) múltiples cepas de ratón que pueden ser aprovechadas para evaluar las bases genéticas de las infecciones.

Hay varias cepas de ratón disponibles actualmente para el estudio de IAV en vivo. Edad, estado inmunitario, sexo, cepa genética de fondo y el ratón, así como rutas de infección, dosis y cepas del virus de influyen en el resultado de la infección del IAV en ratones. Las cepas de ratón más comunes utilizadas en la investigación IAV son C57BL/6, BALB/C y, más recientemente, DBA.2 ratones ya que son más susceptibles a la enfermedad IAV que dos cepas anteriores^{16,17,18, 19 , 20}. lo que es importante, la respuesta inmune también puede ser diferente dependiendo de la cepa de ratón^18,19,20. Por lo tanto, es muy importante recuperar toda la información disponible sobre el ratón y la cepa IAV a elegir la mejor opción para el experimento a realizarse.

Aunque el ratón es un buen modelo animal de infección para los estudios en vivo IAV, tienen varias limitaciones, que deben considerarse en el diseño experimental. Por ejemplo, una limitación importante de la utilización de ratones en vivo estudios es que la gripe no transmite entre ratones. Así, para la transmisión de los estudios, más aceptado modelos animales (e.g., hurones o cobayas) son usados^16,17,21. Además, hay varias diferencias entre las manifestaciones del IAV en ratones y seres humanos. A diferencia de los seres humanos, ratones no desarrollan fiebre con infección de IAV; por el contrario presentan hipotermia^16,17. En ratones, replicación de IAV se concentra en el tracto respiratorio inferior (pulmones) en lugar de las vías aéreas superiores. Por lo tanto, virulencia del IAV en ratones no se correlaciona siempre al que se observa en los seres humanos. En conjunto, ya que las ventajas compensan las desventajas limitadas, ratón representa el primer modelo animal para evaluar patogenesia viral gripe, inmunogenicidad y eficacia protectora en los estudios de vacunas y antivirales. Por otra parte, no sería éticamente aceptable para llevar a cabo estudios con IAV usando modelos animales grandes sin pruebas previas en un pequeño modelo animal de infección IAV. En este manuscrito, describimos cómo infectar ratones intranasal (i.n.) con IAV, cómo controlar la severidad y progreso de la infección viral y cómo llevar a cabo los experimentos necesarios para evaluar la respuesta inmune humoral y la eficacia de protección.

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Protocolo

todos los protocolos animal descritos aquí fueron aprobados por el cuidado institucional de Animal y el Comité uso (IACUC) y el Comité institucional de bioseguridad (IBC) en la Universidad de Rochester escuela de medicina y odontología y cumplir con las recomendaciones de la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de la 22 de Consejo de investigación nacional. Las instalaciones y programas del vivero y la división de medicina del laboratorio Animal de la Facultad de medicina y odontología están acreditados por AAALAC International y cumplan con la política de institutos nacionales de salud (NIH), ley federal y ley estatal. Requisitos similares se apliquen en cada institución se adhieran a los protocolos animal descritos en este manuscrito.

1. uso de animales vertebrados pequeños

Nota: el equipo de Protección Personal apropiado (PPE) se requiere para trabajar con los ratones. Requisitos mínimos incluyen batas desechables, cubre zapato, capucha cabeza, mascarilla y guantes.

1. Acuerdo con el protocolo IACUC, coloque un máximo de 5 ratones por jaula. Siguiendo el protocolo IACUC, eutanasia ratones con dos métodos de eutanasia (la segunda debe ser un método físico) para asegurarse de que el animal está muerto.
   Nota: En los experimentos en que IAV se evalúan morbimortalidad, ratones que perdieron 20% de su peso corporal inicial se considera haber alcanzado el extremo experimental y fueron sacrificados con CO ₂ y la dislocación cervical como la método secundario físico. Este porcentaje de peso corporal puede ser diferente en otras instituciones. En los procedimientos donde se recogen los pulmones de ratones y la mucosa nasal después de la infección de IAV, ratones son sacrificados con una dosis letal de 2,2,2-tribromoethanol (TBE) y cortando el hepático vena como método secundario físico. Mujer ratones C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad fueron comprados y mantenidos en las instalaciones de cuidado de los animales en la Universidad de Rochester escuela de medicina y odontología en condiciones libres de patógenos específicas.

2. Bioseguridad

Nota: en este informe, la gripe utilizada para infectar ratones es la cepa de laboratorio adaptados al ratón común de gripe H1N1 de A/Puerto Rico/8/34 (PR8 WT) ^{22 , 23} y una temperatura sensible LAIV variante, PR8 LAIV ⁸. Realizar todos los procedimientos que implican las infecciones IAV (en la vitro o en vivo), cultivos celulares y muestras biológicas, en un gabinete bajo nivel biosafety (BSL) -2 de seguridad biológica condiciones. Utilizar los otros trajes BSL o condiciones de contención si se utilizan cepas altamente virulentas de IAV.

1. Limpie el gabinete con desinfectante del dióxido de cloro antes y después de realizar todos los procedimientos experimentales descritos en este manuscrito de bioseguridad. Esterilizar todo el material de disección (tijeras, bisturí y disección pinzas) y los homogeneizadores Dounce antes y después de su uso siguiendo las recomendaciones adecuadas de IBC. Descarte todo el material producido durante los procedimientos bajo pautas adecuadas de IBC y IACUC.

3. Infección intranasal

1. lugar del 6 a 8 semanas de edad hembra C57BL/6 ratones en condiciones libres de patógenos específicas. Organizar y etiquetar el ratón jaulas con el virus y la dosis utilizada. Identificar los ratones en cada jaula mediante un código de punzón de oreja o con otro método aprobado, como la pintura de las colas. Colocar un máximo de 5 ratones por jaula.
2. Preparar la dilución de IAV (fluorescente formando unidades (FFU) ratón) bajo condiciones asépticas en un volumen total de 30 μL/ratón estéril 1 x solución salina buffer fosfato (PBS). Mantener el inóculo de virus en el hielo. Calcular la cantidad de IAV a añadir en la dilución viral con la fórmula: ((X FFU por ratón/30 μL) x volumen final) / stock título viral.
3. Los ratones con una escala de pesar y registrar el peso de cada ratón (día 0). Mantenga el ratón en una posición dorsal al recoger por el scruff del cuello entre el dedo índice y el pulgar. Sujete la cola contra la mano con el dedo meñique.
4. Anestesiar el ratón por vía intraperitoneal (i.p.) con 240-250 mg/kg de TBE insertando la aguja en el 2/3 caudal del lado derecho del abdomen. PAUSE brevemente antes de retirar la aguja. El ratón a la jaula y esperar 5 minutos
5. Aplique ungüento oftálmico estéril a los ojos para evitar la sequedad mientras el ratón está anestesiado. Compruebe si el ratón está anestesiado por falta del reflejo de retirada del pedal (es decir, presión del dedo del pie). Si los ratones no están completamente anestesiados tosen por el virus de la.
6. Cuando el ratón está totalmente anestesiado, coloque el ratón en recumbency dorsal. Poner la punta de la pipeta que contiene 30 μL del inóculo de virus en la nariz y lentamente pero constantemente expulsar la solución. Asegúrese de que el ratón es inhalar la preparación observando el inóculo gota desapareciendo.
7. Compruebe que el ratón está respirando como TBE puede deprimir la tasa de respiración y temperatura. Devolver el animal a la jaula en recumbency dorsal. Controlar los ratones para detectar cualquier signo de dificultad respiratoria y si observan, el ratón para respirar por animal sosteniendo verticalmente e inducen impacto impulsado por la respiración ²⁴. Controlar el ratón hasta que recupere conciencia (30-45 minutos después de fue anestesiada).

4. Caracterización de la patogenesia Viral ( figura 1)

1. evaluación de la morbilidad y mortalidad ( figura 1 y figura 2)
   1. Infectar i.n. 3-4 grupos de mujeres ratones C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad (por lo menos 5 ratones por grupo, n = 5) con dosis 10 veces (10, 10 ² 10 ³ y 10 ⁴ FFU y ratón) de PR8 WT como se describe en la sección 3.
   2. Monitor y pesan los ratones con una escala en los próximos 14 días en aproximadamente el mismo tiempo para minimizar las variaciones del peso debido a la ingestión de alimentos. Eutanasia a ratones que pierden 20% de su peso corporal inicial como se describe en la sección 1.
   3. Después de 14 días, eutanasia a los ratones que sobreviven a la infección viral como se describe en la sección 1.
   4. Calcular el viral ratón 50% la dosis letal (MLD ₅₀) basada en los datos de supervivencia obtenidos mediante el método de Reed y Muench ²⁵. En primer lugar, calcular la distancia de la proporción (PD):
      
      1. a continuación, calcular el MLD ₅₀ mediante la siguiente fórmula:
         
2. evaluación de los títulos virales en los pulmones y la mucosa nasal ( figura 1 y figura 2. )
   1. recuperación de pulmones y mucosa nasal
      1. infectar ratones de C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad hembra i.n. (n = 6) con la dosis viral a la prueba 10-10 ⁴ FFU de PR8 WT como se describe en la sección 3.
      2. Recoger los pulmones de ratón y la mucosa nasal en los días 2 (n = 3) y 4 (n = 3).
         1. Eutanasia a los ratones con una dosis letal (i.p.) de TBE (500 mg/kg). Coloque el animal en dorsal recumbency y desinfectar la piel sobre el tórax con etanol al 70%. Cortar la piel con un escalpelo desde el esternón hasta la base del abdomen. Hacer cortes de 1 cm de la base de la incisión a las partes laterales de los ratones con las tijeras.
         2. Cortar la vena hepática con tijeras a sangrar el ratón como el método de eutanasia secundaria. Coloque el animal en posición ventral y esperar 2 minutos para permitir que la sangre drene hacia fuera. Este paso es importante para reducir la sangre en los pulmones.
         3. Quitar la piel de toda la parte superior del ratón (incluido el jefe) a la base del abdomen donde se hizo la primera incisión con la ayuda de pinzas y tijeras de disección. Cortar la cabeza con las tijeras y colocarlos en un plato de Petri seca estéril.
         4. Cortar a las uniones entre el maxilar y la mandíbula con las tijeras y deseche la mandíbula. Con las tijeras, hacer dos cortes en los extremos de los arcos cigomáticos y eliminarlos. Quitar los ojos con la ayuda de las pinzas de disección.
         5. Sostener el cráneo con el fórceps de disección y cortar el cráneo a lo largo de la sutura sagital con un bisturí. Levante las dos mitades del cráneo con el cerebro para ver la mucosa nasal. Las mucosas nasales están rodeadas por los huesos etmoides y huesos anteriores del cráneo, incluyendo el nasal, maxilar, Palatino, malar,.
         6. Con el bisturí, cortar la parte del cráneo con el cerebro y deseche. Colocar la otra parte del cráneo con la mucosa nasal en un tubo estéril. Guarde el tubo en hielo (4 º C) si las muestras son procesadas el mismo día, o en hielo seco para congelarlos rápidamente si las muestras se procesará más tarde.
         7. Para evitar la contaminación de las muestras, limpiar y desinfectar las herramientas de disección entre cada tejido recuperado y entre cada disección animal con desinfectante del dióxido de cloro.
         8. Para recoger los pulmones, coloque el animal en recumbency dorsal y corte la pleura con las tijeras. Abrir la caja torácica cortando las costillas a 1 cm a ambos lados del esternón. Hacer los recortes de la base de la caja torácica en la parte superior con las tijeras.
         9. Hacer un corte transversal con las tijeras entre las dos incisiones en la parte superior de la caja torácica y retire la placa del pecho. Mantenga los pulmones con las pinzas, cortar al final de la tráquea (justo antes de los pulmones) con las tijeras y poner los pulmones en un tubo estéril. Guarde el tubo en hielo (4 º C) si las muestras son procesadas el mismo día, o en hielo seco para congelarlos rápidamente si las muestras se procesará más tarde.
            Nota: Homogeneizar las muestras de tejido en el mismo día que se recogen y almacenan a-80 ° C para analizar títulos virales más adelante. Es importante que las muestras no se someten a congelación y descongelación repetida ciclos antes de que se determinan los títulos de virus. Como alternativa, guardar las muestras de tejido a-80 ° C hasta que se procesarán.
   2. Homogeneización de pulmones y mucosa nasal
      1. Coloque los pulmones o la mucosa nasal en un homogeneizador de Dounce estéril y añadir 1 mL de medio de infección fría. Homogeneizar la muestra moviendo la mano hacia arriba y hacia abajo durante aproximadamente 1 minuto a temperatura ambiente (RT) hasta que los pulmones están completamente interrumpidos. Poner la muestra homogeneizada en un tubo estéril y tienda a 4 ° C. utilizar un homogeneizador de Dounce nueva para cada muestra.
      2. Centrifugar las muestras a 300 x g durante 5-10 min a RT. recoger el sobrenadante en un tubo estéril nuevo. Guarde el sobrenadante a 4 ° C si la titulación viral se realiza en el mismo día y descartar el precipitado. O bien, congelar (-80 ° C) del sobrenadante de homogeneizado de la muestras para evaluar los títulos virales más tarde.
   3. Titulación de virus por inmunofluorescencia indirecta
      1. el día antes de la titulación, placas de 96 pocillos con células epiteliales de riñón canino Madin-Darby (MDCK) (4 x 10 ⁴ células/pocillo) para llegar a la confluencia de ~ 80-90% en medios de cultivo de tejidos de la semilla. Colocar las células en una incubadora de 37 ° C con 5% CO ₂. El día de la titulación viral, compruebe las células bajo el microscopio para confirmar una monocapa antes de iniciar la infección viral.
      2. 1:10 de preparar las diluciones del sobrenadante de las muestras homogeneizadas (pulmón o mucosa nasal) en medios de infección en una placa de 96 pocillos. Realizar la titulación viral por triplicado para determinar con precisión los títulos virales.
         1. Agregar 90 μl de medio de infección para cada uno de los pozos de la placa de 96 pocillos. Añadir 10 μl de uno del sobrenadante de las muestras homogeneizadas a pozos A1, A2 y A3 para evaluar el título viral de cada muestra por triplicado. Añadir 10 μl de sobrenadante de otra de las muestras homogeneizadas a pozos A4, A5 y A6. Realizar la misma dilución consecutivamente con el resto de las muestras.
         2. Después de la adición la muestra sobrenadante a la columna A, usa una pipeta multicanal para mezclar mediante pipeteo arriba y abajo. Transferir 10 μl de la columna A fila B. cambio las puntas entre diluciones y mezclar bien. Repetir este proceso hasta llegar a la última fila (H).
      3. Retire el medio de cultivo de tejidos (paso 4.2.3.1) usando un adaptador de aspiradora aspirador multicanal de las células MDCK en placas de 96 pocillos y lavar dos veces con 100 μL/pocillo de PBS 1 x.
      Células
      4. transferir 50 μL/pocillo del sobrenadante diluido en serie de las muestras homogeneizadas a la placa de 96 pocillos con MDCK. Empezar a transferir las diluciones más altas (columna H) a las diluciones más bajas (columna A). En este caso, no es necesario cambiar las puntas entre hileras diferentes.
      5. Poner las placas de 96 pozos en una plataforma oscilante de 1 h a temperatura ambiente para permitir la adsorción viral. Después de la adsorción viral, eliminar el inóculo utilizando un adaptador de aspiradora aspirador multicanal y añadir 100 μL/pocillo de los medios de comunicación después de la infección. Incube las células infectadas para 8 h en un incubador de 33 ° C o 37 ° C con 5% CO ₂. Proceder a la fijación, tinción, proyección de imagen y cálculo del título viral como se describe en pasos 4.2.3.6 – 4.2.3.12.
      6. Retire el medio de cultivo de tejidos de las placas de 96 pozos utilizando un adaptador de aspiradora aspirador multicanal. Fijar y permeabilizar las células con 100 μL/pocillo de solución de fijación/permeabilización por 20 min a TA.
         PRECAUCIÓN: Use la solución de fijación/permeabilización en una campana de humos para evitar la exposición al formaldehído.
      7. Quitar la solución de fijación/permeabilización utilizando un adaptador de aspiradora aspirador multicanal, lavado con PBS 1 x, incubar las células fijas con el bloqueo de solución por 1 h a RT. tienda las células al bloquear la solución a 4 ° C o proceder al siguiente paso.
      8. Quitar la solución de bloqueo. Añadir 50 μL/pocillo de 1 μg/mL anticuerpo monoclonal (mAb) anti-NP HB-65 diluido en solución de dilución del anticuerpo. Incubar durante 1 h a 37 ° C. diversos mAb o polyclonpuede ser utilizado al (pAb) los anticuerpos anti-PR8.
      9. Mientras tanto, diluir 1: 200 el isotiocianato de fluoresceína (FITC)-anticuerpo secundario conjugado del anti-ratón en solución de dilución del anticuerpo. Centrifugue la solución a 1.700 x g durante 5-10 min a TA. Pueden utilizarse otros anticuerpos secundarios conjugados con otros fluoróforos.
      10. Quitar el anticuerpo primario y lavar 3 veces con 100 μL/pocillo de PBS 1 x. Añadir 50 μL/pocillo de la dilución del anticuerpo secundario e incube durante 30-45 min a 37 ° C. quitar el anticuerpo secundario y lavado 3 veces con 100 μL/pocillo de PBS 1 x. Deje el último lavado de la placa.
      11. Observar las células bajo un microscopio de fluorescencia para determinar el número de células positivas (verde). Calcular el título viral contando FFU/mL. Calcular el título viral expresado en FFU/mL de la dilución con 30-50 las células manchadas positivas mediante la fórmula: ((n1 + n2 + n3) / 3) x 20 x 1/dilución.

5. Evaluación de la respuesta inmune Humoral ( figura 3)

1. infectar i.n. 3 grupos de mujeres ratones C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad (n = 5) con diferentes dosis (10 ² 10 ³ y 10 ⁴ FFU / ratón) de LAIV PR8 y mock-infectar a un grupo (n = 5) con 1 x PBS estéril como control negativo. Realizar las infecciones de ratón i.n como se describe en la sección 3.
   1. Ratón sangrado por punción submaxilar
      1. catorce días después de la inmunización, recoger la sangre de ratones submaxilar sangrado utilizando una lanceta ²⁶ de 4 mm, o con IACUC otro método aprobado.
         1. Mantenga el ratón recogiendo por el scruff del cuello entre el dedo índice y el pulgar. Sujete la cola contra la mano con el dedo meñique para inmovilizar el ratón.
         2. Poner el ratón en una posición lateral a la mejilla. Realizar la punción en la Unión de las venas retro orbital y submaxilares con la vena yugular. Fregadero de la lanceta (4 mm) y recuperar la sangre en un tubo estéril (aproximadamente 0.2 - 0.4 mL/ratón se recuperan). Aplique presión sobre la punción con una toalla estéril durante unos segundos. Coloque el ratón en la jaula.
      2. Poner los tubos por 1-2 h a 37 ° C y luego los Centrifugue a 700 x g durante 30 min a temperatura ambiente para separar el suero de la sangre. Transferir la capa superior que consiste en el suero con una pipeta en un tubo estéril nuevo. Deseche los pellets de células de sangre rojas (RBCs). Almacenar el suero a -20 ° C.
2. Análisis de anticuerpos totales contra proteínas virales
   1. preparación de extractos de células MDCK infectados
      1. el día antes de la infección, la semilla un plato de 100 mm con 4-5 x 10 ⁶ células MDCK (a ~ 80-90 confluencia de % al día siguiente) en medios de cultivo de tejidos. Colocar las células en una incubadora de 37 ° C con 5% CO ₂. El día de la infección viral, compruebe las células bajo el microscopio para confirmar una monocapa antes de iniciar la infección viral.
      2. Preparar una dilución viral con una multiplicidad de (0.001) bajo de infección (MOI) de PR8 WT en los medios de infección en 4 mL de volumen final total. Calcular la cantidad de PR8 WT con la fórmula ((MOI X x células n °) x volumen final) / stock título viral.
      3. Aspirar el medio de cultivo de tejido de la placa de células MDCK y lavar dos veces con 4 mL de PBS 1 x. Añadir el inóculo viral (4 mL) y poner la placa en una plataforma oscilante de 1 h a temperatura ambiente para permitir la adsorción viral. Retirar el inóculo viral con vacío y añadir 8-10 mL de medio de infección posterior al que contiene 1 μg/mL de tripsina tratada TPCK. Incube las células infectadas durante 48-72 h en una incubadora de 33 ° C o 37 ° C con 5% CO ₂.
      4. Separar las células con la ayuda de un raspador celular y recoger las células y el medio de cultivo de tejidos con una pipeta en un tubo de 15 mL. Centrifugar el tubo a 400 x g durante 5-10 min a RT. aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 1 mL de tampón RIPA y poner la mezcla en un tubo de 1,5 mL estéril. Incubar en hielo durante 20-30 minutos
      5. Centrifugar el tubo a 1.300 x g por 20-30 min a 4 ° C. con cuidado, se recupera el sobrenadante. Tienda la célula extrae en alícuotas de μl 100-20 ° C.
      6. Valorar los extractos de células como se describe por el análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) antes de evaluar la presencia de anticuerpos ^{9 , 10 , 11 , 27}. celular incluyen extractos de células MDCK infectados de mock (preparadas como se indicó anteriormente) como control negativo.
   2. ELISA ( figura 4)
      1. capa de poliestireno, placas de 96 pocillos con la dilución de células MDCK infectados extracción en PBS 1 x (generalmente entre 1: 200 - 1:1, 000). Cubra la otra placa con la misma dilución del extracto de células MDCK infectados mock como control negativo. Incubar durante la noche (O/N) a 4 ° C.
      2. Quitar el sobrenadante utilizando un adaptador de aspiradora aspirador multicanal y lavar una vez con 100 μL/pocillo de PBS 1 x con una pipeta multicanal. Bloque de fijación no específica mediante la adición de 100 μL/pocillo de bloquear la solución por 1 h a RT.
      3. Mientras tanto, hacer diluciones seriadas 2 veces (a partir de dilución 1:50) de los sueros de cada ratón infectado en el paso 5.1 en la solución de dilución del anticuerpo en una placa de 96 pozos.
      4. Quitar la solución de bloqueo de las placas poliestireno de 96 pozos utilizando un adaptador de aspiradora aspirador multicanal. Añadir 50 μl de cada dilución de suero de ratón en el pozo apropiado e incubar 1 h a 37 ° C.
      5. Retirar los sueros de ratones con un adaptador de aspiradora aspirador multicanal. Lavar los pocillos 3 veces con agua destilada utilizando una pipeta multicanal. Añadir 50 μL/pocillo de un anticuerpo secundario anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano (HRP) diluido 1:2,000 en la solución de dilución del anticuerpo. Incubar 1 h a 37 ° C.
      6. Quitar el anticuerpo secundario con un adaptador de aspiradora aspirador multicanal. Lavar los pocillos 3 veces con agua destilada utilizando una pipeta multicanal. Preparar la solución de sustrato de tetrametilbenzidina (TMB) mezclando la solución de 1:1 A y B. Añadir 100 μL/pocillo de sustrato e incube durante 5-10 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
      7. Detener la reacción añadiendo 100 μL/pocillo de 0,2 N H ₂ hasta ₄. Leer las placas a 450 nm en un lector de placas ELISA.
      8. Reste el valor obtenido en cada dilución de la placa de 96 pocillos de infectados mock MDCK desde el valor obtenido en la placa de 96 pocillos MDCK infectados. Calcular los valores medios para cada dilución con los diferentes sueros y representarlos en un gráfico que muestra las desviaciones estándar (SD).
3. Análisis de anticuerpos neutralizantes
   1. ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HAI) ( figura 5)
      1. antes de realizar el ensayo HAI, tratar el suero de ratón con receptor destruir la enzima (RDE) para eliminar todos inhibidores no específicos presentes en el suero. Agregar 1 volumen de suero de ratón a 4 volúmenes de la dilución de trabajo RDE (dilución de suero es ahora de 1:5). Incubar O/N (12- 18 h) en un baño de agua de 37 ° C.
      2. Calor de las muestras de suero a 56 ° C durante 30 min para inactivar el RDE.
      3. Previamente para determinar la actividad de hemaglutinación (HAU) de PR8 peso estándar HA ensayo ²⁸. Una vez determinada la HAU viral, diluir la acción viral que HAU 8 por 50 μl de PBS 1 x.
      4. Preparar diluciones seriadas 2 veces (12 diluciones) de los sueros tratados con RDE en una placa de 96 pocillos fondo V. Utilice una fila para cada muestra de suero (por ejemplo, A1 a A12).
         1. Añadir 25 μl de 1 x PBS desde A1 a A12 pozos. Prueba cada una de las muestras de suero en una fila. Añadir 25 μl del suero tratado con RDE (1:5) a 25 μl de PBS 1 x en el primer pocillo de la columna (A1). La primera dilución del suero es de 1:10.
         2. Una vez que todos los sueros tratados con RDE se agregan a la primera columna, (por ejemplo, A1, B1, C1), utilice una pipeta multicanal para mezclar el suero y 1 x PBS mediante pipeteo arriba y abajo. Transferencia 25 μl de los sueros diluidos de la primera columna a la segunda columna (por ejemplo, de A1 a A2). Cambiar las puntas entre las diluciones y mezcla de.
         3. Repetir pasos 5.3.1.4.2. hasta llegar a la última columna (p. ej., A12, B12, C12). Deseche los 25 μl de la última columna, manteniendo el volumen constante en todos los pozos (25 μl). Incluyen una fila de pocillos que contengan sólo 25 μl de PBS 1 x sin ninguna sera como control negativo.
      5. Añadir 25 μl de la IAV diluido a 8 HAU/50 μl a cada uno de los pozos con los sueros en la placa de 96 pocillos fondo V, el volumen final en cada uno es bien 50 μL, que contiene 4 HAU de virus. Mezcle el contenido mediante pipeteo repetido. Incubar durante 1 h a RT.
      6. Añadir 50 μl de Turquía 0.5% glóbulos rojos a cada uno de los pozos. Mezcle el contenido mediante pipeteo repetido. Incube la placa durante 30-45 min en hielo. Lea el ensayo HAI visualmente cuando los hematíes en los pocillos de control (1 x PBS) forman un precipitado rojo (es decir, pellets) en la parte inferior de los pozos de.
         Nota: los glóbulos rojos de otras especies como pollo, cuy o caballo también se puede utilizar.
      7. Calcular los títulos HAI identificando la última en que los hematíes forman una pelotilla roja y no se produce hemaglutinación.
         Nota: El valor recíproco de esta dilución es el título HAI. El valor recíproco se multiplica por un factor de 20 para corregir para la 1:20 dilución del suero en la primera fila.
   2. Ensayo de microneutralización virus (VNA) ( figura 6)
      1. el día antes de VNA, preparar las células MDCK en una placa de 96 pozos para llegar a 80-90% de confluencia al día siguiente como se describe en el paso 5.2.1.1. Preparar una dilución de PR8 WT en los medios de infección que 200 FFU/25 μl.
      2. Inactivate el suero de ratón a 56 ° C por 1 h. hace diluciones seriadas 2 veces (12 dilución) por suero de ratón en triplicado utilizando una placa de 96 pocillos.
         1. Agregar 40 μl del suero a 160 μl de medio de infección en el primer pozo de la primera fila, (por ejemplo, A1) (dilución de suero 1:5). Mezclar por pipeteo. Añadir 100 μl de medio de infección para los otros pozos (A2 a H12).
         2. Transferir 100 μl de la primera fila a la segunda fila para hacer diluciones de 1:2 (p. ej., de A1 a A2). Cambiar consejos entre diluciones y mezclar mediante pipeteo. Repetir este proceso hasta la última fila (p. ej., A12). Descartar 100 μl de la última fila, manteniendo el volumen constante en todos los pozos (100 μL).
      3. Agregar 100 μl de dilución de IAV en todos los pocillos. Incubar 1 h a TA. Mientras tanto, retire el medio de cultivo de tejidos las células MDCK la placa de 96 pozos utilizando un adaptador de aspiradora aspirador multicanal y lavar dos veces con 100 μL/pocillo de PBS 1 x.
      4. En cada placa de 96 pocillos de células MDCK, dejar dos filas de los controles. Una fila es el control negativo (células sin sueros y virus), y la otra fila es el control positivo de la infección (células con virus en ausencia de sueros o sueros de ratones infectados mock).
      5. Transferir 50 μL/pocillo de la placa del anticuerpo del virus a las placas de 96 pocillos de células MDCK. Poner las placas en una plataforma oscilante de 1 h a temperatura ambiente para permitir la adsorción viral.
      6. Retirar el inóculo de anticuerpo del virus utilizando un adaptador de aspiradora aspirador multicanal y añadir 100 μL/pocillo de post-infección medios que contenga 1 μg/mL de tripsina tratada TPCK.
      7. Incubar las células ~ 3-4 días en una incubadora de 33 ° C o 37 ° C con 5% CO ₂ hasta que se observa efecto citopático (CPE) en el control positivo (células infectadas en ausencia de suero o de suero control).
      8. Retire el medio de cultivo de tejidos utilizando un adaptador de aspiradora aspirador multicanal y añadir 100 μL/pocillo de la violeta cristalina de 0.1%. Incubar durante 1 h a RT. Retire la solución de cristal violeta con un adaptador de aspiradora aspirador multicanal. Lavar los pocillos 3 veces con agua destilada. Secar las láminas en RT.
      9. Calcular los títulos VNA identificando la dilución más alta que conserva una monocapa celular confluente de células MDCK.
         Nota: El valor recíproco de esta dilución correspondiente es el título del anticuerpo neutralizante. El valor recíproco se multiplica por un factor de 10 para corregir el 1:10 dilución de los sueros en el primer pocillo de la fila.

6. Evaluación de las vacunas de eficacia de protección ( figura 3)

1. vacuno i.n. un grupo de mujeres ratones C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad (n = 11) con la dosis de la LAIV PR8 para probar (FFU/ratón) y mock-vacunar a otro grupo de ratones (n = 11) con 1 x PBS estéril. Realizar las inmunizaciones de i.n. de ratón como descritas en la sección 3.
2. Vacunación después de catorce días, sangran los ratones y recoger el suero como se describe en la sección 3. Analizar la presencia de total y de neutralizar anticuerpos contra PR8 WT como se describe en la sección 5.1.1.
3. Vacunación después de quince días, mida y registre el peso del ratón (día 0). Desafío i.n. de ratones con una dosis letal de la WT de PR8 (desafío homólogo) como se describió anteriormente en la sección 3.
4. Medir el peso corporal y la supervivencia (n = 5 / Grupo) durante 14 días después del desafío para evaluar la morbilidad y la mortalidad producidas por el desafío de peso PR8 en ratones vacunados (sección 4.1).
5. Recuperar los pulmones de ratón y mucosa nasal (n = 3 al día) en el día 2 y día 4 posterior desafío con PR8 pesos homogeneizar y analizar los pulmones y mucosa nasal tal como se describe en la sección 4.2 a evalúa la replicación viral del PR8 WT en ratones vacunados.

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Resultados

Caracterización de la patogenesia viral en ratones

La patogenesia de IAV se relaciona con la morbilidad y la mortalidad causada por la infección. Estos dos parámetros pueden evaluarse fácilmente en ratones: morbilidad IAV se asocia con pérdida de peso corporal en ratones infectados y el porcentaje de supervivencia indicará la tasa de mortalidad (figura 1). El peso corporal y la supervivencia en r...

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Discusión

El modelo de ratón de IAV es ampliamente utilizado en vivo estudios de eficacia IAV patogenesia, inmunogenicidad y protección. El pequeño tamaño de los ratones los hace fáciles de manipular y almacenar en comparación con otros modelos animales tales como hurones o cobayas. Además, la facilidad en términos de costo de animal, alojamiento y reproducción permiten su uso en pruebas de vacunación pre clínicos en los que se necesitan grandes cantidades de animales. En particular, ya que los ratones se han u...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells	ATCC	CCL-34
Six- to eight-week-old female C57BL/6 mice	National Cancer Institute (NCI)	01XBE
Turckey red blod cells	Biolink Inc		Store at 4 °C
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Corning Cellgro	15-013-CV	Store at 4 °C
Fetal Bovine Serum (FBS)	Seradigm	1500-050	Store at -20 °C
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x	Corning	30-009-CI	Store at -20 °C
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x	Corning	30-00-CI	Store at -20 °C
Bovin Albumin solution (BA)	Sigma-Aldrich	A7409	Store at 4 °C
Bovin Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9647	Store at 4 °C
Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin	Sigma-Aldrich	T8802	Store at -20 °C
Neutral Buffered Formalin 10%	EMD	65346-85	Store at RT
Triton X-100	J.T.Baker	X198-07	Store at RT
Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65	ATTC	H16-L10-4R5	Store at -20 °C
Polyclonal rabbit anti-mouse immunoglobulins/FITC	Dako	F0261	Store at 4 °C
ECL Anti-mouse IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody	GE Healthcare	LNA931V/AG	Store at 4 °C
TMB substrate set	BioLegend	421101	Store at 4 °C
Vmax Kinetic plate reader	Molecular Devices
Dounce Tissue Grinders	Thomas Scientific	7722-7
Receptor destroying enzyme, RDE (II)	Denka Seiken Co.	370013	Store at -20 °C
Crystal Violet	Fisher Scienctific	C581-100	Store at RT
96-well Cell Culture Plate	Greiner Bio-one	655-180
Cell Culture dishes 100 mm	Greiner Bio-one	664-160
Nunc MicroWell 96-Well Microplates	Thermo Fisher Scienctific	269620
Nunc 96-Well Polystyrene Conical Bottom MicroWell Plates	Thermo Fisher Scienctific	249570
Puralub Vet Ointment	Dechra	9N-76855
Fluorescent microscope	Olympus	Olympus IX81