JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Важных патогенов человека респираторных вирусов гриппа А (IAVs). Чтобы понять патогенности IAVs и выполнять Доклинические испытания подходов Роман вакцины, Животные модели, подражая физиологии человека требуются. Здесь мы описываем методы для оценки IAV патогенеза, гуморальные ответы и эффективность вакцины, с помощью мыши модели инфекции.

Аннотация

Вирусы гриппа вызывают более 500 000 смертей во всем мире1 и связаны с годовой стоимости 12-14 миллиардов долларов США в Соединенных Штатах только учитывая прямые медицинские и расходы на госпитализацию и работа прогулов2. Животные модели имеют решающее значение в гриппа вирус (IAV) исследования для оценки вирусный патогенеза, хост возбудитель взаимодействий, иммунные реакции, и эффективность текущих и/или Роман вакцины подходов и противовирусных препаратов. Мышей являются выгодным мелких животных модель, потому что их иммунная система является эволюционно аналогично, найденному в организме человека, они доступны от коммерческих поставщиков как генетически идентичных предметов, есть несколько штаммов, которые могут быть использованы для оценки генетическую основу инфекций, и они относительно недороги и легко манипулировать. Чтобы резюмировать IAV инфекции в организме человека через дыхательные пути, мышей сначала наркоз до интраназальной прививки с инфекционным IAVs под надлежащей биобезопасности сдерживания. После заражения патогенез IAVs определяется ежедневно мониторинга заболеваемости (потеря массы тела) и смертности (выживание). Кроме того вирусный патогенеза также могут оцениваться путем оценки репликацию вируса в верхнем (слизистой оболочки носа) или нижних дыхательных путей (легкие) зараженных мышей. Гуморальные ответы на IAV инфекции могут быстро оцениваться неинвазивные кровотечение и вторичные антитела обнаружения анализов, направленных на обнаружение присутствия общей или нейтрализующих антител. Здесь мы опишем общие методы, используемые для заразить мышей интраназально (н) с IAV и оценивать патогенеза, гуморального иммунного ответа и эффективности защиты.

Введение

IAVs являются оболочечных вирусов, классифицированных в ортомиксовирусы семьи3. Они содержат восемь молекулы одноцепочечной РНК с отрицательной полярности3. В организме человека IAVs вызывают сезонных эпидемий и случайные пандемий важное следствие когда роман вирусы внедряются в человеческой популяции4. Кроме того сезонные IAVs высоко и быстро передаются между людьми, производство повышенные экономические потери во всем мире каждый год2,5. IAV симптомы включают кашель, заложенность носа, лихорадка, общее недомогание, головная боль, анорексии и миалгии, но вирус может также производить более тяжелой болезни в6пациентов с ослабленным иммунитетом. В самом деле Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) рассчитывает, что вирусов сезонного гриппа вызывает 300 000-500 000 смертей во всем мире каждый год1. Существует только два класса препаратов, утвержденных в настоящее время продовольственной и лекарствами (FDA) для профилактики гриппа и лечения в организме человека: ингибиторы нейраминидазы (NA) (например, осельтамивир) и блокаторы м2 ионного канала (например, амантадин); Однако появление лекарственно-вирус вариантов является растущую озабоченность. Вакцинация, таким образом, остается наилучшее медицинское для защиты людей против IAVs инфекции. На сегодняшний день, три вида гриппа вакцины, лицензирован FDA для использования человеком доступны: рекомбинантных вирусный гемагглютинина (HA) белка вакцин, инактивированных гриппозных вакцин (IIV) и живой аттенуированной вакцины гриппа вакцины (LAIV)5, 7. три вакцины призваны побудить адаптивного иммунного ответа против вирусного белка HA, основные цели нейтрализующих антител против IAVs.

Проверяемое мыши модель для изучения IAV инфекции в естественных условиях

Животные модели были использованы для изучения, среди прочих, IAV патогенеза8,9,10,11, вирусные факторы, которые способствуют заболевания12 и/или передачи вируса13 ,14, и для проверки эффективности новых вакцин и противовирусных препаратов9,10,15. Мышь (Mus musculus) являются наиболее широко используемых животных модель для исследования IAV по нескольким причинам: 1) иммунная система эволюционно похож на которые представляют в организме человека; 2) низкой стоимости, в том числе животных покупки, жилищного строительства и воспроизводства; 3) малый размер, легко манипулировать и сохранять; 4) изменчивость Минимальный хост для получения однородной ответы и результаты; 5) большие знания биологии мышей, включая последовательность генома; 6) много доступных молекулярной биологии и иммунологии реагентов; 7) доступны выбить (KO) мышах для изучения вклада данного хоста белком на вирусные инфекции; и 8) несколько мышь штаммов, которые могут быть использованы для оценки генетической основы инфекций.

Есть несколько штаммов мышь в настоящее время доступны для изучения IAV в естественных условиях. Возраст, иммунного статуса, пола, генетический фон и мыши деформации, а также маршруты инфекции, дозы и вирусных штаммов повлиять на исход IAV инфекции у мышей. Наиболее распространенными мыши штаммов, используемых в исследованиях IAV являются C57BL/6, BALB/C и, совсем недавно, DBA.2 мышей, поскольку они более восприимчивы к болезни IAV чем двух бывших штаммов16,,1718, 19 , 20. Важно отметить, что иммунный ответ также может быть различным в зависимости от мыши штамма18,19,20. Таким образом очень важно восстановить всю имеющуюся информацию о мыши и IAV напрягаться, чтобы выбрать наилучший вариант для эксперимента, чтобы провести.

Хотя мыши является хорошей моделью животных инфекции в vivo исследований с IAV, они имеют некоторые ограничения, которые должны рассматриваться в экспериментальный дизайн. Например одним из основных ограничений использования мыши в vivo исследований является, что IAVs не передают среди мышей. Таким образом для передачи исследования, более принято Животные модели (например, хорьки или морских свинок) являются используется16,17,21. Кроме того существует ряд различий между проявлениями IAV мышей и людей. В отличие от людей мышей не развиваются лихорадка после IAV инфекции; наоборот, они представляют с гипотермией16,17. В мышей IAV репликации сконцентрированы в нижних дыхательных путей (легкие) вместо верхних дыхательных путей. Таким образом, что видел в людях не всегда коррелируется вирулентности IAV мышей. Вообще потому что преимущества перевешивают недостатки ограниченный, мыши представляет первый животных модель используется для оценки гриппа вирусный патогенеза, иммуногенность и защитной эффективности вакцины и антивирусных исследований. Кроме того она не будет этически приемлемыми для проведения исследований с IAV, с использованием больших животных моделей без предыдущих доказательств в мелких животных модели IAV инфекции. В этой рукописи, мы опишем, как заразить мышей интраназально (и.н.) с IAV, как контролировать тяжесть и прогресс вирусной инфекции и как проводить эксперименты, требуемые для оценки гуморального иммунного ответа и эффективности защиты.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

всех животных протоколы, описанные здесь были утверждены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) и институциональные Комитета по биобезопасности (IBC) в Университете Рочестер школа медицины и стоматологии и соответствуют с рекомендации в руководстве для ухода и использования лабораторных животных Национального Совета 22 исследований. Услуги и программы виварий и Отдел лабораторных животных медицины школа медицины и стоматологии аккредитованы АААЛЖ и соблюдать закон штата, федеральным законом и национальных институтов здравоохранения (НИЗ) политики. Аналогичные требования должны применяться в каждом учреждении придерживаться животных протоколы, описанные в этой рукописи.

1. Использование малых позвоночных животных

Примечание: надлежащей личной защиты (СИЗ) необходим для работы с мышами. Минимальные требования включают Комбинезоны одноразовые бахилы, головной крышки, маска и перчатки.

  1. В соответствии с протоколом IACUC, место максимум 5 мышей в клетке. После протокол IACUC, усыпить мышей с двумя методами эвтаназии (второй должен быть физический метод) для обеспечения, что животное мертв.
    Примечание: В ходе экспериментов, в которых IAV оцениваются заболеваемости и смертности, мышей, которые потеряли 20% от их первоначального веса считались достигли экспериментальной конечной точки и были умерщвлены с CO 2 и шейки матки дислокации как физические вторичный метод. Этот процент от веса тела может отличаться в других учреждениях. В процедурах, где собраны мышей легких и слизистой оболочки носа после IAV инфекции мышей умерщвлены смертельной дозой 2,2,2-tribromoethanol (КЭ) и путем разрезания печеночные Вены как физический вторичный метод. Женский 6-в-8-week-old мышей C57BL/6 были приобретены и сохранены в объекте ухода за животными в Университете Рочестер школа медицины и стоматологии при определенных условиях свободной от возбудителя.

2. Биобезопасности

Примечание: В настоящем докладе, IAVs, используемый для заразить мышей являются общим мыши адаптированных лаборатории штамм гриппа H1N1 Рико/8/34 A/Puerto (PR8 WT) 22 , 23 и температуры чувствительных LAIV вариант, PR8 LAIV 8. Выполнить все процедуры, которые включают IAV инфекции (в vitro или в естественных условиях), культур клеток и биологических образцов, в биологической безопасности кабинета по биобезопасности уровня (BSL) -2 условия. Использовать другие BSL костюмы или сдерживания условий, если используются высоко вирулентным штаммов IAV.

  1. Clean биобезопасности, кабинет с протравителем диоксида хлора до и после выполнения всех экспериментальных процедур, описанных в этой рукописи. Стерилизуйте все рассечение материала (ножницы, скальпель и рассекает щипцы) и Dounce гомогенизатор, до и после их использования, после надлежащего IBC рекомендаций. Отменить все материалы, подготовленные в ходе процедур руководящими принципами надлежащего КСГМГ и IACUC.

3. Интраназального инфекции

  1. место женщин 6-в-8-недельных C57BL/6 мышей при определенных условиях возбудителя бесплатно. Организовать и ярлык мыши клетки с вирусом и дозировка. Идентифицировать мышей в каждой клетке, с помощью кода удар уха или с другим утвержденным методом как картина хвостов. Место максимум 5 мышей за Кейджа.
  2. Подготовить разрежения IAV (флуоресцентные формирования подразделений (ФФУ) / мыши) в асептических условиях в общем объеме 30 мкл/мыши в стерильных 1 x фосфатный буфер (PBS). Поддерживать посевным материалом вируса на льду. Рассчитать количество IAV для добавления в Вирусный разрежения с формулой: ((X ФФУ на мышь/30 мкл) x окончательный объем) / фондовый вирусный титр.
  3. Весят мышей со шкалой и запишите вес каждой мыши (день 0). Удерживайте кнопку мыши в спинной позиции, подбирая шиворот шеи между указательным и большим пальцем. Прижмите хвост руки с пальцем Пинки.
  4. Анестезировать мыши внутрибрюшинно (и.п.) с 240-250 мг/кг КЭ, вставляя иглу в хвостовой 2/3 в правой части живота. Пауза вкратце до снятия иглы. Вернуть указатель мыши к клетке и подождать 5 мин
  5. Применять стерильная глазная мазь для глаз для предотвращения сухости, в то время как мыши находится под наркозом. Проверьте, если мышь находится под наркозом отсутствием педали вывода рефлекс (т.е., мыс пинча). Если мышь не под наркозом полностью они будут кашлять вирус.
  6. , Когда мышь находится полностью под наркозом, поместите курсор мыши в спинной recumbency. Поместите наконечник пипетки, содержащие 30 мкл посевным материалом вируса в ноздрю и медленно, но постоянно извлечь решение. Убедитесь, что мышь является вдыхание подготовки, наблюдая падение исчезают посевные.
  7. Проверить, что мышь дыхание как КЭ может угнетать уровень температуры и дыхание. Возвращение животное в клетке, поместив его в спинной recumbency. Контролировать мышей для каких-либо признаков респираторного дистресса и если наблюдается, помочь мыши, чтобы дышать, удерживая животное вертикально и побудить воздействия управляемый дыхания 24. Контролировать мыши до тех пор, пока он приходит в сознание (30-45 мин после того, как он был под наркозом).

4. Характеристика вирусных патогенеза ( рис. 1)

    1. оценки заболеваемости и смертности ( рис. 1 и рис. 2) Заразить и.н. 3-4 групп женщин 6-в-8-week-old мышей C57BL/6 (по крайней мере 5 мышей на группу, n = 5) с десятикратного дозах (10, 10 2, 10 3 и 10 4 ФФУ/мышь) от PR8 WT, как описано в разделе 3.
    2. Монитор и весят мышей со шкалой в течение 14 дней в приблизительно то же время для сведения к минимуму вес вариации из-за употребления пищи. Усыпить мышей, которые теряют 20% от их первоначального веса, как описано в разделе 1.
    3. После 14 дней, усыпить мышей, которые выживают вирусной инфекции, как описано в разделе 1.
    4. Расчет вирусный 50% мыши летальной дозы (50 MLD) основанный на выживание данных, полученных с помощью метода Рид и Мюнх 25. Во-первых, рассчитать долю расстояние (PD):
      figure-protocol-6476
      1. , рассчитать MLD 50 по следующей формуле:
        figure-protocol-6614
  2. Оценка вирусной титры в легких и слизистой оболочки носа ( рис. 1 и Рисунок 2. )
    1. восстановления легких и слизистой оболочки носа
      1. заразить и.н. Женский 6-в-8-week-old мышей C57BL/6 (n = 6) с вирусной доза для тестирования 10-10 4 ФФУ PR8 WT, как описано в разделе 3.
      2. Собирать мыши легких и слизистой оболочки носа в течение 2 дней (n = 3) и 4 (n = 3).
        1. Усыпить мышей с летальная доза (и.п.) КЭ (500 мг/кг). Животное в спинной recumbency и продезинфицируйте мех над грудной клетки с 70% этиловом спирте. Вырежьте кожу с помощью скальпеля от грудины к основанию живота. Сделать отрезоки 1 см от основания разреза на боковой части мышей с ножницами.
        2. Сократить печеночной вены с ножницами кровоточить мыши как метод вторичного эвтаназии. Поместите животное в вентральной положение и подождите 2 мин, чтобы позволить крови стечь. Этот шаг имеет важное значение для уменьшения крови в легких.
        3. Удалить кожу от всей верхней части мыши (включая голову) на базе живота, где первый разрез был сделан с помощью рассекает щипцами и ножницы. Вырезать головы с ножницами и поместить его в стерильной сухой Петри.
        4. Сократить соединения между верхней челюсти и нижней челюсти с ножницами и отбросить нижней челюсти. С помощью ножниц сделать два надреза на концах скуловой дуги и удалять их. Удаление глаза с помощью рассечения щипцами.
        5. Провести черепа с рассечения щипцами и сократить череп вдоль сагиттального шва с помощью скальпеля. Поднимите две половинки череп с мозга, чтобы увидеть слизистой оболочки носа. Носовые слизистых окружены решетчатой кости и передней костей черепа, включая носа, верхней челюсти, Палатин, скуловой,.
        6. С помощью скальпеля, вырезать часть черепа с мозгом и отбросить. Место в другой части черепа с носовой слизистой оболочки в стерильную пробирку. Хранить трубки на льду (4 ° C), если образцы обрабатываются в тот же день, или на сухой лед, чтобы заморозить их быстро, если образцы будут обрабатываться позже.
        7. Чтобы избежать контаминации образцов, очистить и продезинфицировать рассечения инструменты между каждой ткани восстановлена и каждое животное рассечение дезинфицирующим диоксида хлора.
        8. Для сбора легких, поместите животное в спинной recumbency и сократить плевры с ножницами. Откройте грудная клетка, резки ребер на 1 см на обе стороны грудины. Сделать сокращений от основания грудной клетки в превосходной часть ножницами.
        9. Сделать поперечное сечение с ножницами между двух разрезов в верхней части грудной клетки и удалить пластину груди. Держите легких с щипцами, вырезать ножницами в конце трахеи (непосредственно перед легких) и положить легких в стерильную пробирку. Хранить трубки на льду (4 ° C), если образцы обрабатываются в тот же день, или на сухой лед, чтобы заморозить их быстро, если образцы будут обрабатываться позже.
          Примечание: Однородный образцы тканей в тот же день, что они были собраны и хранить при температуре-80 ° C для последующего анализа вирусной титры. Важно, что образцы не проходят повторного замораживания оттаивания циклов, прежде чем вирус титры определяются. Кроме того, хранить образцы тканей при температуре-80 ° C до тех пор, пока они будут обработаны.
    2. Гомогенизации легких и слизистой оболочки носа
      1. место легких или слизистой оболочки носа в стерильных гомогенизатор Dounce и добавьте 1 mL холодной инфекции СМИ. Однородный образца, перемещая толкателем вверх и вниз для примерно 1 мин при комнатной температуре (RT), до тех пор, пока легкие полностью нарушена. Положить гомогенизированных образцов в стерильную пробирку и хранить при 4 ° C. Использование нового Dounce гомогенизатор для каждой выборки.
      2. Центрифугуйте образцы на 300 g x 5-10 мин на RT. собирать супернатант в новую стерильную пробирку. Хранить супернатант на 4 ° C, если вирусный Титрование осуществляется в тот же день и отбросить гранулы. Кроме того, заморозить (-80 ° C) супернатант из усредненной образцы для оценки вирусный титры позже.
    3. Вирус титрования по непрямой иммунофлюоресценции
      1. за день до титрования, семя 96-луночных пластины с Мадин-Дарби собак почек (MDCK) эпителиальных клеток (4 х 10 4 клетки/хорошо) до ~ 80-90% слияния в культуре ткани СМИ. Место клетки в инкубаторе 37 ° C с 5% CO 2. В день вирусных титрования, проверьте клетки под микроскопом, чтобы подтвердить монослоя перед началом вирусной инфекции.
      2. Готовят 1:10 разведений супернатант гомогенизированных образцов (легких или слизистой оболочки носа) в средствах массовой информации инфекции в 96-луночных пластине. Выполните вирусный титрования, triplicates для точного определения вирусных титры.
        1. Добавить 90 мкл инфекции средств массовой информации для каждого из скважин в 96-луночных пластины. Добавьте 10 мкл одного из супернатант гомогенизированных образцов скважин A1, A2 и A3 оценить вирусного титр каждого образца в трех экземплярах. 10 мкл другой супернатант гомогенизированных образцов, скважин, A4, A5 и A6. Выполнение же разбавления последовательно с остальной частью образцов.
        2. После добавления образца супернатант в строке A, используйте многоканальные пипетки для смешивать, закупорить вверх и вниз. Передача 10 мкл из строки A B. изменить строку советы между разведений и хорошо перемешать. Повторите это до достижения последней строки (H).
      3. Удалить тканевой культуры среднего (шаг 4.2.3.1) с помощью вакуум отсос многоканальный адаптер из MDCK клеток в 96-луночных пластины и мыть дважды с 100 мкл/хорошо ПБС.
      4. Передачи 50 мкл/колодец серийно разреженных супернатант гомогенизированных образцов на 96-луночных пластину с MDCK клеток. Начало передачи более высоких разведениях (строка H) нижней разведений (ряд А). В этом случае, нет необходимости изменять советы между различными рядами.
      5. Поставить 96-луночных пластины на платформу качалки для 1 h на RT, чтобы позволить вирусной адсорбции. После вирусных адсорбции удалите посевным материалом, с помощью вакуум отсос многоканальный адаптера и добавьте 100 мкл/хорошо послеоперационные инфекции СМИ. Инкубируйте инфицированных клеток для 8 h 33 ° C или 37 ° C инкубатор с 5% CO 2. Перейти к фиксации, окрашивание, изображений и титр вирусных вычисления, как описано в шагах 4.2.3.6 – 4.2.3.12.
      6. Удалить средство культуры ткани из 96-луночных пластины с помощью вакуум отсос многоканальный адаптера. Исправить и разрушения клеток с 100 мкл/хорошо фиксации/permeabilization решения для 20 мин на RT.
        ВНИМАНИЕ: Используйте фиксации/permeabilization решение в вытяжной шкаф для предотвращения воздействия формальдегидов.
      7. Удалить решение фиксации/permeabilization, с помощью адаптера Вакуумный аспиратор многоканальный, мыть с ПБС и инкубировать фиксированной ячейки с блокировкой решение за 1 час на RT. магазине клетки в блокировании раствор при температуре 4 ° C или перейти к следующему шагу.
      8. Удалить блокирующий решение. Добавьте 50 мкл/скважина 1 мкг/мл моноклональных антител (МАБ) анти NP HB-65, разбавленный раствор антител разрежения. Инкубировать в течение 1 ч при 37 ° C. разные МАБ или polyclonможет использоваться Аль антител (pAb) анти PR8.
      9. Тем временем, разбавьте 1: 200 флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC)-конъюгированных вторичное антитело против мыши в раствор антител разрежения. Центрифуга решение на 1700 g x 5-10 мин на RT. Могут использоваться другие вторичные антитела, конъюгированных с другими флуорофоров.
      10. Удаление первичного антитела и мыть 3 раза с 100 мкл/хорошо ПБС. Добавьте 50 мкл/хорошо вторичное антитело разбавления и Инкубируйте 30-45 минут при 37 ° C. Remove вторичные антитела и стирка 3 раза с 100 мкл/хорошо ПБС. Оставьте последний мыть в пластину.
      11. Наблюдать клетки под микроскопом флуоресценции для определения числа положительных окрашенных клеток (зеленый). Вычислить титр вирусных путем подсчета ФФУ/мл. Рассчитать вирусный титр, выраженная в ФФУ/mL разбавления с 30-50 положительных окрашенных клеток с использованием формулы: ((n1 + n2 + n3) / 3) x 20 x 1/разрежения.

5. Оценка гуморальной иммунной реакции ( рис. 3)

  1. заразить и.н. 3 группы женщин 6-в-8-week-old мышей C57BL/6 (n = 5) с разных дозах (10 2, 10 3 и 10 4 ФФУ / мышь) от PR8 LAIV и макет заразить одна группа (n = 5) с 1 x стерильные PBS как отрицательный контроль. Выполните н мыши инфекций, как описано в разделе 3.
    1. Мыши кровотечение, подчелюстной пункция
      1. четырнадцати дней после иммунизации, сбора крови мышей, подчелюстной кровотечения с помощью 4 мм Ланцет 26, или с использованием другой IACUC утверждения метода.
        1. Удерживайте мышь, подбирая шиворот шеи между указательным и большим пальцем. Прижмите хвост руки с пальцем Пинки обездвижить мыши.
        2. Положить мышь в боковую позицию, чтобы увидеть в щеку. Сделайте прокол на стыке ретро орбитальных и подчелюстной вен с яремной вены. Раковина lancet (4 мм) и восстановить крови в стерильную пробирку (примерно 0,2 - 0,4 мл/мыши восстанавливаются). Давление на прокол стерильной салфеткой на несколько секунд. Поместите курсор мыши обратно в отсек.
      2. Поставил трубы для 1-2 ч при 37 ° C и затем центрифуга их на 700 g x 30 мин на RT отделить сыворотку от крови. Перенести верхний слой, состоящий из сыворотки с пипетки на новую стерильную пробирку. Выбросите Пелле красных кровяных телец (эритроцитов). Хранить сыворотки в -20 ° с.
  2. Анализ всего антител против вирусных белков
    1. Подготовка зараженных MDCK клеточных экстрактов
      1. за день до инфекции, семян одно блюдо 100-мм с 4-5 х 10 6 клеток MDCK (до ~ 80-90 % слияния следующий день) в культуре ткани СМИ. Место клетки в инкубаторе 37 ° C с 5% CO 2. В день вирусной инфекции, проверьте клетки под микроскопом, чтобы подтвердить монослоя перед началом вирусной инфекции.
      2. Подготовить вирусный разрежения с разносторонность низкой (0.001) инфекции (МВД) от PR8 WT в средствах массовой информации инфекции в окончательный объем 4 мл. Рассчитать количество PR8 WT с формулой ((X MOI x n ° клетки) x окончательный объем) / фондовый вирусный титр.
      3. Аспирационная тканевой культуры среднего из плиты MDCK клеток и мыть дважды с 4 мл ПБС. Добавить вирусный посевным материалом (4 мл) и установите пластину на платформу качалки для 1 h на RT, чтобы позволить вирусной адсорбции. Удалить вирусных посевным материалом с вакуумом и добавить 8-10 мл послеоперационные инфекции носителя, содержащего 1 мкг/мл TPCK-лечение трипсина. Инкубировать инфицированных клеток для 48-72 ч, 33 ° C или 37 ° C инкубатор с 5% CO 2.
      4. Отсоедините клетки с помощью скребка клетки и собирать клетки и ткани питательной среды с пипетки в 15 мл. Центрифуга трубки на 400 g x 5-10 мин на RT. аспирата супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл Буфер RIPA и поставьте смесь в 1,5 мл стерильной пробирке. Инкубируйте на льду на 20-30 мин
      5. Центрифуг трубки на 1300 x g для 20-30 мин на 4 ° C. тщательно, восстановить супернатант. Магазин, сотовый экстракт в 100 мкл аликвоты в -20 ° с.
      6. Титруйте клеточных экстрактов, как описано в энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA) до оценки их на наличие антител 9 , 10 , 11 , 27. включить ячейку выдержки из макетов инфицированных клеток MDCK (подготовлен как указано выше) как отрицательный контроль.
    2. ELISA ( рис. 4)
      1. слой пенополистирола, 96-луночных пластины с соответствующим разрежения инфицированных MDCK ячейки извлечь в однократном ПБС (обычно между 1: 200 - 1:1, 000). Герб другую тарелку с же разбавления макет инфицированных клеток MDCK экстракт как отрицательный контроль. Инкубируйте на ночь (O/N) на 4 ° C.
      2. Удалить супернатант с помощью вакуум отсос многоканальный адаптера и мыть раз с 100 мкл/хорошо ПБС с многоканальные пипетки. Блок без конкретной привязки, добавив 100 мкл/хорошо блокировать решение за 1 час на RT.
      3. Между тем, сделать 2 раза серийных разведений (начиная разбавления 1:50) сыворотки от каждой мыши, инфицированных в 5.1 шаг в разбавления раствор антител в плиту 96-луночных.
      4. Удалить блокирующий решение из 96-луночных плит с помощью вакуум отсос многоканальный адаптера. 50 мкл каждого разведения сыворотки мыши в соответствующей скважине и инкубировать 1 час при 37 ° с.
      5. Удаление sera мышей с адаптером Вакуумный аспиратор многоканальный. Промойте лунки 3 раза с дистиллированной водой, используя многоканальные пипетки. Добавьте 50 мкл/колодец анти мыши вторичное антитело проспряганное с хреном пероксидазы (ПХ) разбавляют стоматологов в раствор антител разрежения. Инкубировать 1 час при температуре 37 ° C.
      6. Удаление вторичных антител с адаптером Вакуумный аспиратор многоканальный. Промойте лунки 3 раза с дистиллированной водой, используя многоканальные пипетки. Подготовка раствора субстрата тетраметилбензидина (ТМБ) путем смешивания 1:1 решение A и B. Добавить 100 мкл/хорошо субстрата и инкубировать 5-10 мин на RT в темноте и.
      7. Остановка реакции, добавив 100 мкл/хорошо 0,2 N H 2 так 4. Читайте пластины на 450 Нм на читателя пластины ELISA.
      8. Вычесть значение, полученное в каждого разведения MDCK макет инфицированных 96-луночных пластину из значения, полученного в MDCK-инфицированных 96-луночных пластины. Вычислять средние значения для каждого разведения с различных сывороток и представляют их в график, показывающий стандартных отклонений (SD).
  3. Анализ нейтрализующих антител
    1. пробирного торможение гемагглютинации (HAI) ( рис. 5)
      1. перед выполнением анализа Хай, лечить sera мыши с рецепторов уничтожение фермента (эру), чтобы устранить все неспецифические ингибиторы в сыворотке крови. Добавить 1 объем сыворотки мыши 4 тома РДЭ рабочего разведения (сыворотка разрежения в настоящее время 1:5). Инкубировать O/N (12- 18 ч) в ванну воды 37 ° С.
      2. Тепло образцов сыворотки в 56 ° C за 30 минут, чтобы инактивировать РДЭ.
      3. Заранее определить действие гемагглютинации (ГАУ) от PR8 WT стандартных HA пробирного 28. После определения вирусных Гау, разбавить вирусные акции 8 Гау за 50 мкл в однократном ПБС.
      4. Подготовить два раза серийных разведений (12 разведений) РДЭ лечение сыворотки в 96-луночных V-днище. Используйте одну строку для каждого образца сыворотки (например, А1-A12).
        1. Добавить 25 мкл 1 x PBS от А1 до A12 скважин. Тестирование каждого из образцов сыворотки в одной строке. 25 мкл РДЭ лечение сыворотки (1:5), до 25 мкл ПБС в первой скважины столбце (А1). Первый разведения сыворотки составляет 1:10.
        2. После всех РДЭ лечение сера добавляются в первый столбец (например, A1, B1, C1), использовать многоканальные пипетки для смешивать sera и ПБС, закупорить вверх и вниз. Передача 25 мкл разбавленного сера из первого столбца во второй столбец (например, от A1 до A2). Измените советы между разведений и смешайте.
        3. Повторить шаги 5.3.1.4.2. до достижения последнего столбца (например, A12, B12, С12). Отказаться от 25 мкл от последнего столбца, сохраняя объем последовательной на всех скважинах (25 мкл). Содержать одну строку скважин, содержащие только 25 мкл ПБС без каких-либо сера как отрицательный контроль.
      5. Добавить 25 мкл IAV разбавляют до 8 Гау/50 мкл каждого из скважин с Сера в 96-луночных V-днище; окончательный объем в каждом хорошо-50 мкл, содержащий 4 Гау вируса. Смешайте содержимое, неоднократные закупорить. Инкубировать 1 час на RT.
      6. Добавьте 50 мкл Турции RBCs 0,5% для каждой из скважин. Смешайте содержимое, неоднократные закупорить. Инкубируйте пластину для 30-45 минут на льду. Читайте Хай assay визуально когда эритроцитов в скважинах управления (ПБС) образуют красный осадок (то есть, пеллетные) в нижней части скважины.
        Примечание: RBCs от других видов, таких как курица, морской свинки или лошадь может также использоваться.
      7. Вычисления Хай титры путем выявления последнего хорошо в котором RBCs формируют красный лепешки и гемагглютинации не происходит.
        Примечание: Взаимные этой разрежения значение титра Хай. Обратная величина умножается на коэффициент 20 исправить для 1:20 разведения сыворотки в первой строке.
    2. Вирус microneutralization проба (ВНА) ( рис. 6)
      1. за день до ВНА, подготовить MDCK клетки в плиту 96-луночных достичь слияния 80-90% на следующий день, как описано в шаге 5.2.1.1. Подготовить разрежения PR8 WT в средствах массовой информации инфекции иметь 200 мкл ФФУ/25.
      2. Неактивным sera мыши на 56 ° C в течение 1 ч. сделать 2 раза серийных разведений (12 разрежения) на мышь Сера в трех экземплярах с помощью 96-луночных плиты.
        1. Добавить 40 мкл сыворотки 160 мкл инфекции СМИ в первой скважины первой строки (например, A1) (сыворотка разбавления 1:5). Смешать, закупорить. 100 мкл носителей инфекции для других скважин (A2 Н12).
        2. Передачи 100 µL из первой строки на второй строке, чтобы сделать разведения 1:2 (например, от A1 до A2). Изменить советы между разведений и микс, закупорить. Повторите это до последней строки (например, А12). Отменить 100 µL из последней строки, сохраняя объем последовательной на всех скважинах (100 мкл).
      3. Добавить 100 мкл IAV разбавления всех скважин. Инкубировать 1 час на RT. Между тем, удалите средство культуры ткани из MDCK клеток в 96-луночных пластине с помощью вакуум отсос многоканальный адаптера и мыть дважды с 100 мкл/хорошо ПБС.
      4. В каждом 96-луночных пластины MDCK клеток, оставьте две строки для элементов управления. Одна строка является отрицательный контроль (клетки без вирусов и сера), и другие строка является положительный контроль инфекции (клетки с вирусом в отсутствие сера или сывороток от МОК инфицированных мышей).
      5. Передачи 50 мкл/колодец из пластину вирус антитела к 96-луночных пластины MDCK клеток. Положите пластины на платформу качалки для 1 h на RT, чтобы позволить вирусной адсорбции.
      6. Удаления вируса антитела посевным материалом, с помощью вакуум отсос многоканальный адаптера и добавить 100 мкл/хорошо послеоперационные инфекции носителя, содержащего 1 мкг/мл TPCK-лечение трипсина.
      7. Инкубируйте ~ 3-4 дней в 33 ° C или 37 ° C инкубатор с 5% CO 2 клетки, до тех пор, пока в положительный контроль (зараженных клеток в отсутствии сыворотки или сывороткой управления) наблюдается цитопатического эффекта (CPE).
      8. Удалить носитель культуры ткани, с помощью Вакуумный аспиратор многоканальный адаптер и добавьте 100 мкл/хорошо Фиолетовый Кристалл 0,1%. Инкубируйте 1 час на RT. Remove Фиолетовый Кристалл решения с помощью вакуум отсос многоканальный адаптер. Промойте лунки 3 раза с дистиллированной водой. Сухие пластины на RT.
      9. Вычисления ВНА титры путем выявления высокого разрежения, который сохраняет вырожденная ячейки монослоя клеток MDCK.
        Примечание: Взаимные этой соответствующей разрежения значение титр нейтрализующих антител. Обратная величина умножается на коэффициент 10 исправить 1:10 разведение сывороток в первой скважины строки.

6. Оценка защиты эффективность вакцин ( рис. 3)

  1. вакцинации и.н. группы женщин 6-в-8-week-old мышей C57BL/6 (n = 11) с PR8 LAIV доза для тестирования (ФФУ/мышь) и МОК вакцинировать другой группе мышей (n = 11) с 1 x стерильные PBS. Выполнять иммунизацию и.н. мыши, как описано в разделе 3.
  2. Четырнадцати дней после вакцинации, кровоточить мышей и собирать sera, как описано в разделе 3. Анализ на наличие общей и нейтрализующих антител против PR8 WT, как описано в разделе 5.1.1.
  3. Через 15 дней после вакцинации, измерьте и запишите вес тела мыши (день 0). Вызов и.н. мышей с смертельной дозой PR8 WT (гомологичных вызов) как описано в разделе 3.
  4. Измерение веса тела и выживания (n = 5 / группа) в течение 14 дней после вызов для оценки заболеваемости и смертности, производимые PR8 WT вызов в мышах прививку (статья 4.1).
  5. Восстановить мыши легких и слизистой оболочки носа (n = 3/день) в 2 день и день 4 после задача с PR8 массовая гомогенизации и анализировать легкие и слизистой оболочки носа, как описано в разделе 4.2 оценивает вирусной репликации PR8 WT в мышах прививку.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Характеристика вирусных патогенеза мышей

Патогенез IAV связано с заболеваемости и смертности, вызванных его инфекции. Эти два параметра могут оцениваться в мышей легко: IAV заболеваемости связано с потерей веса тела в зараженных мышей и п?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Модель мыши IAV широко используется в vivo исследований эффективности IAV патогенеза, иммуногенность и защиты. Небольшой размер мышей делает их легко манипулировать и сохранять по сравнению с другими животных моделей, таких как хорьки или морских свинок. Кроме того простота с точки зр?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Исследования на вирус гриппа в LM-S лаборатории финансируется частично Нью-Йорк гриппа центр повышения квалификации (NYICE), членом NIAID центров передового опыта для гриппа исследования и наблюдения (CEIRS). Мы благодарим Венди Bates за ее поддержку в исправления рукописи.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cellsATCCCCL-34
Six- to eight-week-old female C57BL/6 miceNational Cancer Institute (NCI)01XBE
Turckey red blod cellsBiolink IncStore at 4 °C
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)Corning Cellgro15-013-CVStore at 4 °C
Fetal Bovine Serum (FBS)Seradigm1500-050Store at -20 °C
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100xCorning30-009-CIStore at -20 °C
Penicillin/Streptomycin (PS) 100xCorning30-00-CIStore at -20 °C
Bovin Albumin solution (BA)Sigma-AldrichA7409Store at 4 °C
Bovin Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA9647Store at 4 °C
Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsinSigma-AldrichT8802Store at -20 °C
Neutral Buffered Formalin 10%EMD65346-85Store at RT
Triton X-100J.T.BakerX198-07Store at RT
Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65ATTCH16-L10-4R5Store at -20 °C
Polyclonal rabbit anti-mouse immunoglobulins/FITCDakoF0261Store at 4 °C
ECL Anti-mouse IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibodyGE HealthcareLNA931V/AGStore at 4 °C
TMB substrate setBioLegend421101Store at 4 °C
Vmax Kinetic plate readerMolecular Devices
Dounce Tissue GrindersThomas Scientific7722-7
Receptor destroying enzyme, RDE (II)Denka Seiken Co.370013Store at -20 °C
Crystal VioletFisher ScienctificC581-100Store at RT
96-well Cell Culture PlateGreiner Bio-one655-180
Cell Culture dishes 100 mmGreiner Bio-one664-160
Nunc MicroWell 96-Well MicroplatesThermo Fisher Scienctific269620
Nunc 96-Well Polystyrene Conical Bottom MicroWell PlatesThermo Fisher Scienctific249570
Puralub Vet OintmentDechra9N-76855
Fluorescent microscopeOlympusOlympus IX81

Ссылки

  1. Girard, M. P., Cherian, T., Pervikov, Y., Kieny, M. P. A review of vaccine research and development: human acute respiratory infections. Vaccine. 23 (50), 5708-5724 (2005).
  2. Arnold, S., Monto, M. D. Epidemiology and Virology of Influenza Illness. Am J Manag Care. 6, Suppl 5. 255-264 (2000).
  3. Palese, P., Shaw, M. L. Orthomyxoviridae: The Viruses and Their Replication. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A. , 5th ed, Lippincott Williams and Wilkins. (2007).
  4. Li, K. S., et al. Genesis of a highly pathogenic and potentially pandemic H5N1 influenza virus in eastern Asia. Nature. 430 (6996), 209-213 (2004).
  5. Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. Reverse Genetics Approaches for the Development of Influenza Vaccines. Int J Mol Sci. 18 (20), (2017).
  6. Kunisaki, K. M., Janoff, E. N. Influenza in immunosuppressed populations: a review of infection frequency, morbidity, mortality, and vaccine responses. Lancet Infect Dis. 9 (8), 493-504 (2009).
  7. Belshe, R. B. Live attenuated versus inactivated influenza vaccine in infants and young children. N Engl J Med. 356 (7), 685-696 (2007).
  8. Cox, A., Baker, S. F., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L., Dewhurst, S. Development of a mouse-adapted live attenuated influenza virus that permits in vivo analysis of enhancements to the safety of live attenuated influenza virus vaccine. J Virol. 89 (6), 3421-3426 (2015).
  9. Nogales, A., et al. Influenza A Virus Attenuation by Codon Deoptimization of the NS Gene for Vaccine Development. J Virol. 88 (18), 10525-10540 (2014).
  10. Nogales, A., DeDiego, M. L., Topham, D. J., Martinez-Sobrido, L. Rearrangement of Influenza Virus Spliced Segments for the Development of Live-Attenuated Vaccines. J Virol. 90 (14), 6291-6302 (2016).
  11. Nogales, A., Huang, K., Chauché, C., DeDiego, M. L., Murcia, P. R., Parrish, C. R., Martínez-Sobrido, L. Canine influenza viruses with modified NS1 proteins for the development of live-attenuated vaccines. Virology. 500 (2017), 1-10 (2016).
  12. Garcia-Sastre, A., et al. Influenza A virus lacking the NS1 gene replicates in interferon-deficient systems. Virology. 252 (2), 324-330 (1998).
  13. Lowen, A. C. Blocking interhost transmission of influenza virus by vaccination in the guinea pig model. J Virol. 83 (7), 2803-2818 (2009).
  14. Mubareka, S. Transmission of influenza virus via aerosols and fomites in the guinea pig model. J Infect Dis. 199 (6), 858-865 (2009).
  15. Nogales, A., Baker, S. F., Martinez-Sobrido, L. Replication-competent influenza A viruses expressing a red fluorescent protein. Virology. 476C, 206-216 (2014).
  16. Margine, I., Krammer, F. Animal Models for Influenza Viruses: Implications for Universal Vaccine Development. Pathogens. 3 (4), 845-874 (2014).
  17. Bouvier, N., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).
  18. Pica, N., Iyer, A., Ramos, I., Bouvier, N. M., Fernandez-Sesma, A., García-Sastre, A., Lowen, A. C., Palese, P., Steel, J. The DBA.2 mouse is susceptible to disease following infection with a broad, but limited, range of influenza A and B viruses. J Virol. 85 (23), 12825-12829 (2011).
  19. Watanabe, H., Numata, K., Ito, T., Takagi, K., Matsukawa, A. Innate immune response in Th1- and Th2-dominant mouse strains. Shock. 22 (5), 460-466 (2004).
  20. Srivastava, B., Blazejewska, P., Hessmann, M., Bruder, D., Geffers, R., Mauel, S., Gruber, A. D., Schughart, K. Host genetic background strongly influences the response to influenza a virus infections. PLoS One. 4 (3), e4857(2009).
  21. Lowen, A. C., Bouvier, N. M., Steel, J. Transmission in the Guinea Pig Model. Curr Top Microbiol Immunol. 385, 157-183 (2014).
  22. Schickli, J. H. Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356 (1416), 1965-1973 (2001).
  23. Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A. Generation of recombinant influenza virus from plasmid DNA. J Vis Exp. (42), (2010).
  24. National Research Council (U.S.) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals., Institute for Laboratory Animal Research (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. , 8th ed, National Academies Press (U.S.). (2011).
  25. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene. 27 (3), 493-497 (1938).
  26. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34 (9), 39-43 (2005).
  27. Nogales, A. A temperature sensitive live-attenuated canine influenza virus H3N8 vaccine. J Virol. , (2016).
  28. Eisfeld, A. J., Neumann, G., Kawaoka, Y. Influenza A virus isolation, culture and identification. Nat Protoc. 9 (11), 2663-2681 (2014).
  29. Guo, H., Baker, S. F., Martinez-Sobrido, L., Topham, D. J. Induction of CD8 T cell heterologous protection by a single dose of single-cycle infectious influenza virus. J Virol. 88, 12006-12016 (2014).
  30. CDC: Centers for Disease Control and Prevention. Antigenic Characterization. , Available from: http://www.cdc.gov/flu/professionals/laboratory/antigenic.htm (2017).
  31. He, W., Mullarkey, C. E., Miller, M. S. Measuring the neutralization potency of influenza A virus hemagglutinin stalk/stem-binding antibodies in polyclonal preparations by microneutralization assay. Methods. , (2015).
  32. Gulati, U. Antibody epitopes on the neuraminidase of a recent H3N2 influenza virus (A/Memphis/31/98). J Virol. 76 (23), 12274-12280 (2002).
  33. Beare, A. S., Webster, R. G. Replication of avian influenza viruses in humans. Arch Virol. 119, 37-42 (1991).
  34. Rowe, T. Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays. J Clin Microbiol. 37 (4), 937-943 (1999).
  35. Stephenson, I., Wood, J. M., Nicholson, K. G., Zambon, M. C. Sialic acid receptor specificity on erythrocytes affects detection of antibody to avian influenza haemagglutinin. J Med Virol. 70 (3), 391-398 (2003).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

127A

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены