用光学分馏塔和标准显微镜设备对小鼠黑质多巴胺能神经元数的视学估计

摘要

这项工作提出了一个 step-by 步协议的无偏视学估计多巴胺能神经元细胞数在小鼠黑质使用标准显微镜设备 (即,光显微镜, 机动对象表 (x, y, z平面) 和公有域软件进行数字图像分析。

摘要

在临床前帕金森病的研究中, 对体道的分析, 包括对黑质中多巴胺能神经元损失的定量, 是必不可少的。为了估计总的多巴胺能神经元数, 采用光分馏法的无偏视学目前被认为是金标准。因为光分馏塔方法的理论是复杂的, 因为视学是难以实现的, 没有专门的设备, 一些商业上可用的完整的视学系统, 包括必要的软件确实存在, 纯粹细胞计数的原因。由于购买专门的视学设置并不总是可行的, 由于许多原因, 本报告描述了使用标准显微镜设备对多巴胺能神经元细胞计数进行视学估计的方法, 包括光学显微镜、带有成像软件的机动对象表 (x、y、z 平面) 和用于分析的计算机。给出了用光学分馏塔法进行视学量化的 step-by 步骤说明, 并给出了计算估计单元数的预编程文件。为了评估这种方法的准确性, 对从商用视学仪器中获得的数据进行了比较。使用此协议和视学设备发现可比较的单元数, 从而证明了该协议对于无偏视学的精确性。

引言

神经元细胞数的定量是临床前帕金森病研究的关键, 以确定黑质 (SN)^1,2内神经的水平。对感兴趣区域中的单元格数的无偏视学估计被认为是金标准^3、4、5。

在无偏视学的出现之前, 部分神经元的数量通过操纵计数的细胞剖面来进行评估, 以纠正神经元在一节中进入视线的可变概率。最常用的方法之一是修正由⁶所描述的量化单元计数。如果在相邻的薄片中发现同一单元格的碎片, 则此方法试图考虑到单元格可以多次量化。因此, 在计算单元的形状、大小和方向方面需要假设的公式^7,8。但是, 这些假设通常没有实现, 因此导致了系统的错误和与实际单元格数 (即偏倚) 的背离。此外, 还不能通过附加采样³来减少偏差。

对于使用光学分馏塔的细胞数的视学估计, 应用数学原理直接在定义的3维体积中直接估计细胞数。这种方法的优点是它不涉及被计算单元的形状、大小和方向的假设。因此, 估计的单元格数更接近于真实值, 并且随着样本大小的增加 (即,无偏)³变得更接近。由于使用视学保持方法无偏时必须遵循许多规则, 因此已开发现成的商业视学系统 (供审查, 请参阅 2005⁴)。专门的视学系统实现了设计视学方法与先验定义的探针和抽样方案的视学评估, 导致独立的形状, 大小, 空间分布, 和方向要分析的单元格^4,9。然而, 商业上可用的视学系统是昂贵的;这可能会限制新研究的实施。

本研究的目的是开发一种可用的技术设计视学估计多巴胺能细胞计数在小鼠 SN, 采用光学分馏塔方法和使用标准显微镜设备 (即,光显微镜, 标准显微镜软件, 和机动的 x, y, z 阶段)。为此, 提出了如何处理小鼠脑组织和如何使用设计无偏视学估计 SN 细胞数的 step-by 步骤指南。此外, 还提供了计算估计单元数和误差系数 (CE) 的模板。

这里描述的方法不限于对 SN 的分析, 但可以适应在其他的解剖定义的老鼠或老鼠大脑区域使用。例如, 无偏视学被用来估计海马体的神经元细胞数¹⁰和轨迹斑¹¹。此外, 还可以评估除神经元以外的其他细胞类型, 如星状细胞¹²和小胶质红细胞¹³。因此, 这种方法对于打算在研究中实现无偏视学的科学家是有用的, 但他们不愿意花很多钱购买视学系统。

研究方案

对动物的照顾和使用的所有适用的国际、国家和/或机构准则都得到遵守。该议定书由德国 Wuerzburg Regierung Unterfranken 的地方当局批准.

1. 组织处理和免疫组化

1. 安乐与 CO ₂ 或任何其他已批准方法的小鼠.
2. 灌注六12周老 C56Bl/6N 雄性小鼠 transcardially 10 毫升0.1 米的磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 使用25克针和输液泵, 其次70毫升4% 甲醛 (粉煤灰) 在 0.1 M PBS.
   警告: 煤灰是有毒、过敏和致癌的.
3. 在 +0.74 mm Bregma (图 25, Paxinos 和富兰克林鼠脑图谱 ¹⁴ ) 的区域内, 用大脑矩阵切片器解剖在日冕平面上的小鼠大脑.
4. 将大脑的背侧部分, 包括 SN, 在0.1 米 PBS 中的4% 粉煤灰中, 1 d 在4和 #176; 浸泡固定的 C.
5. 将30% 蔗糖/0.1 摩尔 PBS 溶液交换为低温保护, 并在4和 #176 中孵育另 2 d; C.
6. 将大脑的背部部分放入一个 cryomold 填充最佳切削温度 (OCT) 化合物, 并在液态干冰冷却戊中缓慢冻结组织.
   警告: 干冰非常冷 (-78 和 #176; C);使用个人防护设备 (PPE), 包括手套, 同时处理干冰。干冰在 CO ₂ 中蒸发;因此, 在通风罩下工作.
7. 连续剪切 30 #181; m 在冠状面上的冰冻切片, 并收集剖面, 从 Bregma (图 51, Paxinos 和富兰克林鼠脑图谱 ¹⁴ ) 起2.46 毫米开始, 在4.04 毫米从 Bregma (图 64, Paxinos 和富兰克林鼠脑图谱 ¹⁴ ).
8. 存储四系列的管中充满剂 (30% 甘油, 30% 乙二醇, 40% PBS) 在-20 和 #176;在切片过程中, 通过在脑干的上部区域穿刺一个小孔来标记右半球.
9. 对于免疫组织化学染色, 每只老鼠选择一组切片。Preincubate 自由漂浮部分1小时在10% 正常山羊血清 (NGS)/2% BSA/0.5% 洗涤剂在0.1 摩尔 PBS 在一个振动筛上。用兔 anti-mouse 酪氨酸羟化酶 (TH; 1:1, 000 稀释) 在0.1 摩尔 PBS 中稀释 2% NGS/2%bsa/0.5% 洗涤剂, 在4和 #176; C.
10. 在室温下应用二次抗体对抗家兔 (1:100 稀释) 2 小时, 其次是素/生物素试剂 (1:100 稀释)。孵育和染色 33-diaminobenzidine-tetrahydrochloride (民建联) 和 H ₂ O ₂ 。在涂层对象幻灯片上着色后, 将其装入这些部分.
    注: TH + 多巴胺能 SN 神经元在 图 1a 中显示。通过染色一个系列, 平均 13 sn 部分, 从侧延伸到尾部部分的 sn 致密 (SNpc) 和福橘, 染色每动物 ( 图 1b )。各节以120和 #181 分隔; m (1/4 系列) ( 图 1c ).
    警告: 民建联是一种可疑的致癌物。它是有毒的接触和吸入。在与民建联合作时使用 PPE.

2。获取图像

1. 使用与显微镜耦合的图像软件捕获 TH 免疫着色的 SN 剖面。分别分析一个系列的每个部分.
2. 使用图像处理软件的扫描幻灯片选项。以 TIFF 格式保存高质量图像 ( 图 2 ).
   注意: 图像分辨率是每 cm 312 像素.
3. 按 #34; 获取和 #34; 打开获取窗口 ( 图 2a ).
4. 将分设置为和 #34; 2 和 #34; 用于灰度图像.
   注意: 获取灰度图像而不是彩色图片会减小最终堆栈图像文件的大小 ( 图 2a ).
5. 单击并 #34; 显示实况和 #34; 在获取窗口中打开一个新窗口, 其中显示该节的实时图像 ( 图 2 a 和 b ).
6. 单击并 #34; 舞台和 #34; 在获取窗口中。选择和 #34; 扫描幻灯片和 #34; 在下拉菜单中检查该框 ( 图 2c ).
   注意: 这使得在 x、y 平面上的高度放大的 SN 图像 (630X 放大) 的获取和对准, 以及在1和 #181 的连续图像之间的距离的堆栈图像的获取; m 在 z 平面中, 覆盖总范围为13和 #181;m.
7. 选择2.5X 目标以搜索 SN.
8. 将目标更改为 63x.
通过单击和 #34,
9. 定义该节的左上角 (TopLeft) ( 图 2c ) 和右下角 (LowRight) ( 图 2d ); 设置. 和 #34;
10. 单击并 #34; z 系列和 #34; 检查 #34; z 平面系列和 #34; 框 ( 图 2e ).
11. 使用成像软件确定每节三随机选取的计数点的实际安装厚度。为此, 请单击 #34; 查看顶部偏移量和 #34; 若要定义节的顶部 ( 图 2e ), 然后单击并 #34; 停止查看顶部和 #34; ( 图 2f )。然后, 点击和 #34; 查看底部偏移量和 #34; ( 图 2f ), 然后单击并 #34; 停止查看底部和 #34; ( 图 2g )。记下剖面的粗细.
12. 从顶部偏移量中减去3和 #181; m (保护区域), 并将结果键入顶部偏移槽 ( 图 2h )。从顶部偏移数减去13和 #181; m (光学 disector 的高度), 并将结果键入底部偏移槽 ( 图 2i )。选择以下参数: 步骤, 14;大小, 1.00 ( 图 2i ).
    注: 这对应于13和 #181 的 z 平面上的厚度; m, 具有1和 #181; 连续图像之间的距离.
13. 选择要保存文件的目录 ( 图 2j ).
14. 单击并 #34; 序列和 #34; 启动获取 ( 图 2j ).
15. 单击 #34;P 加工和 #34, 然后选择以下参数: #34; 所有飞机、#34、#34、序列、#34、#34、蒙太奇、#34; 和 #34; 快速和 #34; 和 #34; 拼接和 #34; 框, 图像重叠为 10% ( 图 2k )。开始通过点击和 #34 来缝合图像; 开始和 #34;.
    注意: 这将生成用于分析的堆栈图像 ( 图 2 l, 图 3a e )。

3。视学评估序列

1. 使用 NIH ImageJ 软件版本4.7 执行对 SN 堆栈图像的分析.
2. 下载 ImageJ.nih.gov 网站所需的两个插件: #34; 网格叠加和 #34; 插件 ¹⁵ 和 #34; 单元计数器和 #34; 插件 ¹⁶ 。按所述安装两个插件.
3. 对于无偏视学评估, 请按如下所示定义计数参数: 网格大小、130 x 130 和 #181; 计数帧、50 x 50 和 #181; m; 和光学 disector 高度, 13 和 #181; m.
4. 通过单击 #34 打开图像; 文件和 #34; #160; #8594; #34; 打开和 #34; ( 图 4a ) 通过使用和 #34; 分析与 #34; #160; #8594; #34; 设置缩放和 #34; 命令 ( 图 4b )。对于此步骤, 请将定义的大小从像素更改为和 #181; m ( 图 4c ).
   注意: 对于分析的图像, 425 像素对应于100和 #181; m.
5. 选择 #34;P lugins 和 #34; #160; #8594; #34; 网格和 #34; #160; #8594; #34; 网格类型: 线和 #34; 命令随机插入网格。检查 #34; 随机偏移和 #34; 框。定义网格中一个正方形的大小 (网格正方形) 为130和 #181; m x 130 和 #181; m = 16900 和 #181; m ² ( 图 3b 和 图 4d 和 e ).
6. 将图像类型从16位更改为 RGB 颜色 (单击和 #34; 图像和 #34; #160; #8594; #34; 类型和 #34; #160; #8594; #34; rgb 颜色和 #34;) ( 图 4f )。找到 SNpc, 如 Baquet et al. 所述 ¹⁷ . 将 SNpc 与 #34;P aintbrush 工具和 #34 包围; (画笔宽度:11) ( 图 3c 和 图 4g i ).
7. 撤消和 #34; 设置缩放和 #34; 命令通过单击和 #34; 分析和 #34; #8594; #34; 设置规模和 #34; #8594; #34; 单击以删除缩放和 #34; ( 图 4j -l ) 以像素为单位启用计算的性能, 而比和 #181; m.
8. 制作截图 ( 图 4m ), 保存图像文件, 然后用 ImageJ ( 图 4n ) 打开新文件。选择和 #34;P 点和 #34; ( 图 4o ) 和画笔宽度 25 ( 图 4p )。标记与 SN 联系的每个网格正方形, 以放置一个光学 disector ( 图 4q )。对在所述 SN 中完全或部分局部化的所有光学 disectors 中的单元格数进行分析.
9. 选择一个包含 SN 部分的网格正方形。用 ImageJ 中的光标测量此正方形的左上角, 以定义要开始的 x 和 y 坐标 ( 图 4r ).
   注: 使用 #34; 光学 disector 位置和 #34; ( 图 4s ), 如步骤4所述, 将为光学 disector 定位插入坐标.
10. 计算光学 disector 位置的方法是使用 "电子表格模板", #34; 光学 disector 位置, #34; 如步骤4所述
11. 校准光学 disector (由克里斯托弗· s 沃德编写的宏, 补充文件 ) 通过单击 #34;P lugins 和 #34; #8594; #34; 宏和 #34; #8594; #34; 编辑和 #34; 图 4t ), 打开和 #34; opt_dis_grid.txt 和 #34; 文件 ( 图 4u ), 并定义 #34 的大小; usergrid 和 #34; 以像素为单位, 与光学 disector ( 图 4v ) 的 x、y 维度相对应。选择大小为50和 #181; m x 50 和 #181; m, 使 usergrid 的一侧的大小定义为212.5 像素 (50 x 4.25 像素).
12. 通过插入定义光学 disector ( 图 4v ) 中心的 ImageX 和 ImageY 坐标来确定光盘 disector 在堆栈图像中的位置。运行宏 (#34; 宏和 #34; 和 #8594; #34; 运行宏和 #34;) ( 图 4w ).
    注意: 网格将从堆栈图像 ( 图 3d 和 图 4x ) 中消失。在 z 平面 ( 图 3e 和 图 4x ) 中向下移动时, 光学 disector 将持续.
13. 选择和 #34;P lugins 和 #34; #160; #8594; #34; 单元格计数器和 #34 启动单元计数器插件 ( 图 4y )。初始化单元格计数器并选择一个标记类型 ( 图 4z )。放大图像 (点击和 #34; + 和 #34;) 和执行视学评估的细胞数放大 200%.
14. 通过圆形或卵球形的形状和细胞大小来识别多巴胺能神经元 perikarya ( 图 1a )。使用视学规则量化单元格的数量.
    注意: 由于光学 disector 是一个3维多维数据集 ( 图 5a ), 因此将排除边定义为多维数据集的前、左和上侧 (红色)。因此, don 和 #39, 不要计算与红线 (左和前) 或顶部接触的 TH 细胞。将单元格计数的结果添加到已准备好的电子表格文件中, #34; 计算单元计数和 #34; (步骤 5).
15. 根据 SN 图像, 计算下一个网格正方形, 用于将光学 disector 用于下一单元格计数, 使用 x、y 步骤覆盖上覆网格的大小 ( 图 5b ) 和 #34; 光学 disector 位置和 #34;电子表格模板, 如步骤4所述.
16. 使用 and #34 对单元格数进行估计; 计算单元计数和 #34; 电子表格 (步骤 5).

4。光学 Disector 位置的计算 #34; 光学 Disector 位置和 #34; 电子表格模板

1. 计算每个光学 Disector 的大小和位置, 将其放置在 SN 轮廓内的上覆盖网格中 ( 图 5b )使用和 #34; 光学 disector 位置. xlsx 和 #34; 电子表格文件 ( 补充文件 ).
2. 插入按 #34 定义的每 #181 像素的转换; 设置缩放和 #34; 命令, 进入和 #34 的黄色标记位置; 光学 disector 位置. xlsx 和 #34; 文件 ( 图 6a 和 补充文件).
3. 插入 disector 的计划大小和上覆网格的网格正方形的大小, 由一侧 (在和 #181; m) 的长度定义, 到橙色标记的位置.
   注意: 结果在橙色方框旁边的红色方框中描述.
4. 从作为起点的 SN 轮廓中的网格正方形开始 (在上面的步骤3.9 中选择一个网格正方形作为开始).
5. 将 x 和 y 坐标 (如步骤3.9 所示) 插入文件的绿色框中 (通过使用这些值, 计算第一个正方形内的光学 disector 中心的 x、y 坐标, 并在蓝色框中描述结果)。运行 opt_dis_grid 的. txt 宏 ( 补充文件 ).
6. 相对于第一个网格正方形 (棕色框), 通过插入网格平方距离 (以平方数度量) 来计算连续光学 disectors 的 x、y 坐标.
   注: + x: 方格位于右侧;-x: 网格正方形位于左边;+ y: 网格正方形位于底部;-y: 网格广场位于顶端。结果显示在灰色框中.

5。使用 and #34 估计单元格数; 计算单元数和 #34; 电子表格

1. 使用已发布的公式计算每个动物 (N) 的估计数 + SN 单元格个数由西部 et al ., 1991 ³ , 在哪里和 #8721; Q ^- 定义为在一个脑部的所有光学 disectors 中计数的 TH + 神经元总数.
   注意: 该方程中包含了光学 disector (h) 与截面 (t) 的测量厚度有关的高度。区域取样分数 (asf) 定义为在网格的平方大小 (a x, 光学 disector) 帧大小的光 disector (一个光学的) 的面积 (a) 的比例 (y 步) (光学 disector/x、y 步) ( 图 3b ) 和切片取样分数是指整个序列切脑部分的比例:
   
   以确保高质量的定量估计, 系数错误 (CE) 应低于0.10。通过 Keuker et al 来确定 CE 的使用公式, 2001 ¹⁰ :
   
2. 视学估计每个鼠标, 插入有关每个鼠标生成的系列总数的指示信息, 光学 disector 的高度, 光学 disector 的 x、y 区域 (光学 disector, 在和 #181; m ² ), 网格正方形的 x、y 区域 (x、y 步, #181; m ² ), 以及使用 and #34 的黄色框中的截面 (#181; m) 的平均测量厚度; 计算单元数. xlsx 和 #34; 电子表格文件 ( 图 6b 和补充文件 ).
3. 从同一动物中分析每个 SN 段, 如步骤5所述.
4. 在灰色框中插入每个光学 disector 的单元格计数, 每一行引用一个 SN 节, 使用 and #34; 计算单元计数. xlsx 和 #34; 电子表格文件 ( 补充文件 ).
   注意: 在蓝色方框 ( 图 6b ) 中描述了估计的单元数和计算出的 CE.

6。使用商业上可用的视学系统估计单元格数

1. 通过单击 #34;P 长袍和 #34 开始估计多巴胺能 SNpc 细胞数; #8594; #34; 光学分馏塔工作流和 #34; 打开光学分馏塔工作流窗口.
   注意: 将弹出一个新窗口, 以确定是否要计算新的 SN 系列.
2. 通过单击和 #34 启动新的 "TH + SN" 系列; 开始新的主题和 #34; 在弹出窗口中.
3. 遍历光分馏塔工作流的不同步骤。在第一步中设置主题。为此, 请插入调查员和 #39 的名称、主题和 #39; s 名称 (SN 组) 以及其他有用的信息。插入此 SN 要计数的节数。插入切口组织切片的厚度。插入节间隔, 在本例中为四。插入随机确定的节编号以开始.
4. 在第二步中, 将显微镜设置为低放大率 (2X 目标), 并选择和 #34; 2X Mag 透镜和 #34; 从菜单中.
5. 在步骤3中, 用鼠标左键跟踪感兴趣的区域, 这是 SNpc, 如 Baquet et al ., 2009 ¹⁷ .
6. 在步骤4中将显微镜设置为高倍放大倍数。为此, 将目标更改为 100X, 然后选择和 #34; 100X Mag 透镜和 #34; 从下拉菜单中.
7. 通过聚焦到节的顶部和底部来测量步骤5中的已装入厚度.
8. 在步骤6中, 将计数帧大小定义为 50 x 50 和 #181; m; 这是光学 disector (x、y) 的大小.
9. 在步骤7中, 将系统随机抽样 (SRS) 网格的大小设置为 130 x 130 和 #181; m.
10. 在步骤8中输入3和 #181; m 保护区域.
11. 在步骤9中保存设置
12. 最后, 在光学分馏塔工作流的步骤10中, 计算 SRS 网格中每个光学 disectors 中的 TH + 多巴胺能细胞。为此, 请先点击 #34; 计数和 #34; 按钮.
13. 完成一节后, 单击 #34; 开始下一节和 #34; 按钮以启动同一 sn 系列的下一个 sn 段的光学分馏塔工作流.
14. 当一个 sn 系列的最后一个 sn 部分被量化后, 单击 #34; 我和 #39; 我已经完成计数. #34;
15. 单击 #34; 查看结果和 #34; 按钮以显示视学采样的结果.

结果

使用所提出的方法, 右 sn 中的 TH + 多巴胺能神经元的估计数介于7363和7987细胞之间, 在左 sn 中, 7446 和7904细胞之间。因此, 平均多巴胺能神经元 (± SEM) 为右 sn 为7647±83细胞, 左 sn 为7675±66。每个动物的计算 CE 值低于 0.08 (范围: 0.073-0. 079) (图 7)。为了确定此方法与商用和专用视学系统的可比性, 还使用视学设置 (图 8) 对 SN 单元数进...

讨论

视学从组织加工开始。在视学分析过程中, 必须小心地进行 SN 组织的连续切割, 以防止节段丢失。另外, 一个重要的步骤是标记一个半球, 以便在执行视学时区分左 SN 的右侧。在脑干上部放置一个小孔, 在所提出的研究中产生了最好的结果。此外, 由于使用光学分馏塔方法, 要求组织被切割在厚的部分约30-40 µm, 而不是5-10 µm 更常用的免疫组化, 抗体和其他培养液组织渗透期间免疫组织化学染色必须?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paxinos mouse atlas			The Mouse Brain George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet & created by Paul Halasz
brain matrix slicer mouse	Zivic Instruments	BSMAS 001-1
paraformaldehyde	Merck	1040051000
sucrose /D(+) Saccharose	Roth	4621.1
isopentane	Roth	3927.1
glycerol	Merck	1040931000
Ethanol	Sigma Aldrich	32205-1L
Name	Company	Catalog Number	Comments
phosphate buffered saline ingredients:
sodium chloride	Sigma Aldrich	31434-1KG-R
potassium dihydrogen phosphate	Merck	1048731000
di-sodium hydrogen phosphate dihydrate	Merck	1065801000
potassium chloride	Merck	1049360500
normal goat serum	Dako	X0907
bovine serum albumin	Sigma	A4503-100G
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-100ml	detergent
3,3-Diaminobenzidine-tetrahydrochlorid/DAB tablets 10mg pH 7.0	Kem En Tec	4170
H2O2/ Hydrogen peroxide 30%	Merck	1072090250
avidin/biotin reagent	Thermo Scientific	32050	Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100
rabbit anti mouse tyrosine hydroxylase antibody	abcam	Ab112	1:1000
biotinylated goat-anti-rabbit IgG H+L	vector laboratories	BA-1000	1:100
StereoInvestigator version 11.07	MBF
BX53 microscope	Olympus
Visiview	Visitron Systems GmbH	3.3.0.2
Axiophot2	Zeiss
ImageJ software	NIH	Version 4.7
Tissue-TEK OCT	Sakura	4583
dry ice
grid overlay plugin	Wayne Rasband		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html
cell counter plugin	Kurt de Vos		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html).
optical disector macro	Christopher Ward
C57Bl/6N male mice	Charles River, Germany
SuperFrost Plus coated object slides	Langenbrinck, Germany
25G needle Microlance 3	BD	300400
REGLO Analog Infusion pump	Ismatec	ISM 829
StereoInvestigator system			StereoInvestigator version 11.07
BX53 microscope			BX53 microscope
self-assorted stereology			Visiview
Axiophot2			Axiophot2