Stereologiche stima del numero di neuroni dopaminergici nel Nigra di Substantia del Mouse utilizzando il frazionatore ottica e microscopia Standard attrezzature

Riepilogo

Questo lavoro presenta un protocollo passo-passo per la valutazione imparziale stereologiche dei numeri di un neurone delle cellule dopaminergiche nel nigra di substantia del mouse utilizzando attrezzature di microscopia standard (cioè, un microscopio ottico, una tabella di oggetto motorizzato (x, y, z aereo) e software di pubblico dominio per analisi digitale delle immagini.

Abstract

Nella ricerca pre-clinica la malattia del Parkinson, analisi del tratto nigrostriatal, compresa la quantificazione di perdita di neuroni dopaminergici nel nigra di substantia, è essenziale. Per stimare il numero di neuroni dopaminergici totale, imparziale stereology utilizzando il metodo ottico frazionatore è attualmente considerato il gold standard. Poiché la teoria dietro il metodo ottico frazionatore è complessa e stereology è difficile da raggiungere senza attrezzature specializzate, esistono vari sistemi commercialmente disponibili stereology completi che includono il software necessario, puramente per cella contando i motivi. Dal momento che l'acquisto di un setup stereology specializzato non è sempre fattibile, per molte ragioni, questo rapporto descrive un metodo per la stima stereologiche del cellulare di un neurone dopaminergico conteggi mediante microscopia standard attrezzature, compreso un microscopio ottico, un tavola di oggetto (x, y, z aereo) motorizzata con software di imaging e un computer per l'analisi. È dato una spiegazione dettagliata su come eseguire stereologiche quantificazione mediante il metodo ottico frazionatore, e file di pre-programmati per il calcolo dei conteggi delle cellule stimato vengono forniti. Per valutare la precisione di questo metodo, è stato effettuato un confronto con i dati ottenuti da un apparato di stereology commercialmente disponibili. Numeri paragonabili delle cellule sono stati trovati usando questo protocollo e il dispositivo stereology, dimostrando così la precisione di questo protocollo per stereology imparziali.

Introduzione

La quantificazione del numero di cellulare di un neurone è fondamentale nella ricerca pre-clinica la malattia del Parkinson per determinare il livello della neurodegenerazione nel nigra di substantia (SN)^1,2. La valutazione imparziale stereologiche del numero delle cellule in una regione di interesse è considerata il gold standard^3,4,5.

Prima dell'avvento di stereology imparziale, il numero dei neuroni nelle sezioni è stato valutato mediante la manipolazione delle cellule contate profili per correggere le probabilità variabile che neuroni entrano in vista in una sezione. Uno dei metodi più comunemente usati era la correzione dell'emocromo quantificati descritto da Abercrombie⁶. Questo metodo ha tentato di prendere in considerazione che le cellule possono essere quantificate in più di una volta se frammenti della stessa cella si trovano nelle sezioni sottili adiacenti. Di conseguenza, Abercrombie e altri autori generato equazioni che ha richiesto le ipotesi circa la forma, dimensione e orientamento delle cellule contate^7,8. Tuttavia, questi presupposti erano solitamente non realizzati e quindi portati a errori sistematici e divergenza dal numero effettivo della cella (cioè, polarizzazione). Inoltre, il bias non potrebbe essere ridotto di campionamento supplementare³.

Per la stima stereologiche di numeri di cellulare usando il frazionatore ottico, principi matematici sono applicati per valutare direttamente i numeri di cellulare direttamente in un volume definito, 3-dimensionale. Il vantaggio di questo metodo è che non comporta ipotesi circa la forma, dimensione e orientamento delle cellule contate. Così, i numeri di cellulare stimato sono più vicini ai valori true e avvicinarsi man mano che aumenta la dimensione del campione (cioè, imparziali)³. Perché molte regole devono essere seguite quando usando stereology per mantenere il metodo imparziale, sono stati sviluppati sistemi di ready-to-use commerciale stereology (per la revisione, Vedi Schmitz e Hof, 2005,⁴). Sistemi specializzati stereology implementano metodi stereologiche basati su progettazione con aprioristicamente definite sonde e sistemi di campionamento per le valutazioni stereologiche che portano all'indipendenza dalla forma, dimensione, distribuzione spaziale e orientamento della cellule per essere analizzati^4,9. Tuttavia, i sistemi di stereology commercialmente disponibili sono costosi; Questo potrebbe limitare implementazione nella ricerca di nuove.

Lo scopo di questo studio era quello di sviluppare una tecnica utilizzabile per la stima stereologiche basati su progettazione della conta delle cellule dopaminergiche nel topo SN, impiegando il metodo ottico frazionatore e utilizzando attrezzature di microscopia standard (cioè, luce microscopio, microscopio standard software e un motorizzato x, y, z fase). Per questo, è presentata una guida passo passo su come elaborare del tessuto di cervello di topo e come stimare i numeri di cell SN utilizzando stereology imparziali basati su progettazione. Inoltre, sono disponibili modelli per il calcolo dei numeri di cellulare stimato e coefficienti di errore (CE).

Il metodo qui descritto non è limitato all'analisi dello SN, ma può essere adattato per l'uso in altre regioni anatomicamente definite del cervello di topo o ratto. Per esempio, stereology imparziale è stato utilizzato per stimare i numeri di cellulare di un neurone l' ippocampo¹⁰ e il locus coeruleus¹¹. Inoltre, tipi cellulari diversi da neuroni, astrociti¹² e microglia¹³, possono essere valutati come bene. Pertanto, questo metodo può essere utile agli scienziati che intendono attuare stereology imparziale nella loro ricerca, ma non sono disposti a spendere un sacco di soldi per l'acquisto di un sistema di ansia.

Protocollo

tutte le linee guida internazionali, nazionali e/o istituzionali applicabili per la cura e l'uso di animali sono state seguite. Il protocollo è stato approvato dalle autorità locali presso il Regierung von Unterfranken, Wuerzburg, Germania.

1. trasformazione del tessuto e Immunohistochemistry

1. Euthanize topi con CO ₂ o qualsiasi altro metodo approvato.
2. Profumi sei via di topo maschio C56Bl/6N 12-week-old con 10 mL di 0.1 M tampone fosfato salino (PBS) utilizzando un ago 25-G e una pompa di infusione, seguito da 70 mL di paraformaldeide al 4% (PFA) in PBS 0.1 M.
   Attenzione: PFA è tossici, allergenici e cancerogeni.
3. Sezionare il cervello di topo nell'aereo della corona con un'affettatrice di matrice cervello alla regione di +0,74 mm dal Bregma (Figura 25, Paxinos e Franklin del mouse brain atlas ¹⁴).
4. Mettere la parte dorsale del cervello, compreso il SN, nel 4% PFA in 0.1 M PBS per 1D a 4 ° C per immersione-fissazione.
5. PFA per soluzione al 30% saccarosio/0.1 mol PBS per cryo-protezione di exchange e incubare per un altro 2 d a 4 ° C.
6. Mettere la parte dorsale del cervello in un cryomold riempita con temperatura di taglio ottimale (OCT) compound e lentamente congelare il tessuto in isopentano raffreddato a ghiaccio secco liquido.
   Attenzione: Il ghiaccio secco è estremamente freddo (-78 ° C); utilizzare dispositivi di protezione individuale (PPE), inclusi i guanti, mentre si lavora con ghiaccio secco. Ghiaccio secco evapora in CO ₂; Pertanto, lavorare sotto cappa aspirante.
7. In serie tagliare 30-µm cryo-sezioni nell'aereo della corona e raccogliere le sezioni, a partire 2,46 mm dal Bregma (Figura 51, Paxinos e Franklin del mouse brain atlas ¹⁴) e termina a 4,04 mm dal Bregma (Figura 64, Paxinos e Franklin del mouse brain atlas ¹⁴).
8. Memorizzare quattro serie in tubi che sono pieni di crioprotettore (30% glicerolo, ethoxyethanol 30% e 40% PBS) a-20 ° C. Durante la procedura di taglio, contrassegnare l'emisfero destro perforando un piccolo foro nella regione superiore del tronco cerebrale.
9. Per la macchiatura di immunohistochemical, seleziona una serie di sezioni per topo. Preincubate digalleggiante sezioni per 1 h a 10% di siero di capra normale (NGS)/2% BSA/0.5% detergente a 0.1 mol PBS su un agitatore. Incubare le sezioni con anticorpo di coniglio anti-topo tirosina idrossilasi (TH; 1:1,000 diluizione) diluito in 2% NGS/2% BSA/0.5% detergente a 0.1 mol PBS durante la notte a 4 ° C.
10. Applica secondaria anticorpi contro coniglio Igs (diluizione 1: 100) per 2 h a temperatura ambiente, seguita da reagente avidina/biotina (diluizione 1: 100). Incubare e macchia con 3,3-diaminobenzidina-tetrahydrochloride (DAB) e H ₂ O ₂. Montare i profili dopo la loro colorazione su vetrini rivestiti oggetto.
    Nota: TH + i neuroni dopaminergici SN sono mostrati in Figura 1a. Macchiando di una serie, una media di 13 sezioni di SN, che si estende dalla rostrale caudale porzioni del SN pars compacta (SNpc) e reticulata, sono macchiati per animale ( Figura 1b). Le sezioni sono separate da 120 µm (1/4 serie) ( Figura 1C).
    Attenzione: DAB è un sospetto cancerogeno. È tossico per inalazione e contatto. Uso dei DPI quando si lavora con DAB.

2. Acquisizione di immagini

1. TH catturare immunohistochemically macchiate sezioni SN digitalmente utilizzando software di imaging che è accoppiato ad un microscopio. Analizzare separatamente ogni sezione della one serie.
2. Utilizzare l'opzione di diapositiva di scansione del software di imaging. Salvare in formato TIFF per immagini di alta qualità (Figura 2).
   Nota: La risoluzione dell'immagine è 312 pixel per cm.
3. Press " Acquire " per aprire la finestra di acquisizione (Figura 2a).
4. Impostare il binning " 2 " per le immagini in scala di grigi.
   Nota: L'acquisizione di immagini in scala di grigi invece di immagini a colori riduce le dimensioni del file di immagine dello stack finale (Figura 2a).
5. Fare clic su " Show Live " nella finestra di acquisizione per aprire una nuova finestra che mostra l'immagine dal vivo della sezione (Figura 2 un e b).
6. Fare clic su " palco " nella finestra di acquisizione. Scegliere " Scan Slide " nel menu a discesa e selezionare la casella (Figura 2C).
   Nota: In questo modo l'acquisizione e l'allineamento delle immagini SN altamente ingrandite (630 ingrandimenti) in x, y-aereo, nonché l'acquisizione di immagini di pila con una distanza tra due immagini consecutive di 1 µm nel piano z, che coprono una gamma totale di 13 µ m.
7. selezionare l'obiettivo X 2,5 per cercare il SN.
8. Cambiare l'obiettivo a 63 x.
9. Definire l'angolo superiore sinistro (TopLeft) (Figura 2C) e l'angolo inferiore destro (LowRight) (figura 2d) della sezione cliccando su " Set. "
10. Fare clic su " serie Z " e controllare la " serie Z-Plane " scatola (Figura 2e).
11. Determinare lo spessore effettivo montato delle sezioni a conteggio scelti tre siti per ogni sezione utilizzando il software di imaging. Per questo, fare clic su " Vista Top Offset " per definire la parte superiore della sezione (Figura 2e) e quindi fare clic su " interrompere Vista Top " (Figura 2f). Successivamente, fare clic su " vista inferiore Offset " (Figura 2f) e quindi fare clic su " smettere di vedere a fondo " (Figura 2 g). Annotare lo spessore della sezione.
12. Sottrarre 3 µm (zona di guardia) dall'alto offset e digitare il risultato nello slot offset superiore (Figura 2 h). Sottrarre 13 µm (altezza del disector ottico) dal numero di offset superiore e digitare il risultato nello slot offset inferiore (Figura 2i). Selezionare i seguenti parametri: passaggi, 14; dimensioni, 1.00 (Figura 2i).
    Nota: Questo corrisponde allo spessore del piano z-13 µm, con una distanza da 1 µm tra due immagini consecutive.
13. Selezionare la directory dove salvare il file (Figura 2j).
14. Fare clic su " sequenza " per avviare l'acquisizione (Figura 2j).
15. Fare clic su " elaborazione " e selezionare i seguenti parametri: " tutti i piani, " da " di sequenza; " " Montage; " e la " veloce " e " impunture " scatole, con una sovrapposizione di immagine del 10% (Figura 2 k). Iniziare a cucire le immagini cliccando su " avviare ".
    Nota: Questo genererà immagini dello stack per l'analisi (Figura 2 l, Figura 3a -e).

3. Sequenza di valutazione stereologiche

1. eseguire l'analisi di immagini di stack SN utilizzando il NIH ImageJ software versione 4.7.
2. Scaricare i due plugin che sono necessari dal sito ImageJ.nih.gov: la " griglia Overlay " plugin ¹⁵ e la " contatore di cellule " plugin ¹⁶. Installare entrambi i plugin come descritto.
3. Per valutazione stereologiche imparziali, definire i parametri di conteggio come segue: dimensione della griglia, 130 x 130 µm; counting frame, 50 x 50 µm; e ottica disector altezza, 13 & n.181; m.
4. Aprire l'immagine facendo clic sul " File " → " aperto " (Figura 4a) impostare la scala dell'immagine utilizzando la " Analyze " → " Imposta scala " comando (Figura 4b). Per questo passaggio, modificare le dimensioni definite da pixel a µm (Figura 4c).
   Nota: Per le immagini analizzate, 425 pixel corrisponde a 100 µm.
5. Seleziona il " plugin " → " griglia " → " tipo di griglia: linee " comando per inserire in modo casuale una griglia. Verifica la " Offset casuale " casella. Definire le dimensioni di un quadrato all'interno della griglia (griglia-Piazza) come 130 µm x 130 µm = 16.900 µm ² ( Figura 3b e Figura 4 d ed e).
6. Cambiamento di immagine tipo da 16-bit di colore RGB (fare clic su " immagine " → " tipo " → " colore RGB ") (Figura 4f). Individuare la Scissura, come descritto da Baquet et al. ¹⁷. circondare la Scissura con il " strumento pennello " (larghezza della spazzola: 11) ( c nella figura 3 e Figura 4 g -io).
7. Annulla la " Imposta scala " comando facendo clic su " Analyze " → " Imposta scala " → " fare clic su per rimuovere scala " (Figura 4j -l) per consentire l'esecuzione di calcoli in pixel piuttosto di µm.
8. Fare uno screenshot (Figura 4 m), salvare il file di immagine e aprire il nuovo file con ImageJ (Figura 4n). Selezionare " punto " (Figura 4o) e una larghezza del pennello di 25 (p di figura 4). Contrassegnare ogni quadrato della griglia che contattano il SN per il posizionamento di un ottico disector (Figura 4q). Eseguire l'analisi del numero delle cellule in tutti i disectors ottici che sono localizzate completamente o parzialmente all'interno il delineato SN.
9. Selezionare un quadrato della griglia che include parti dello SN. Misura l'angolo superiore sinistro di questa piazza con il cursore in ImageJ per definire gli assi x e y coordinate per iniziare con (Figura 4r).
   Nota: Le coordinate verranno inserite per ottica disector posizionamento utilizzando il " ottico disector posizione " (Figura 4s), come descritto nel passaggio 4.
10. Calcolare la posizione di disector ottico utilizzando il modello di foglio di calcolo dal titolo, " ottica disector posizione, " come descritto nel passaggio 4.
11. Calibrare l'ottica disector (macro scritta da Christopher S. Ward, File supplementare) cliccando su " plugin " → " macro " → " modifica " (Figura 4t), aprire il " opt_dis_ Grid.txt " il file (Figura 4u) e definire le dimensioni del " usergrid " in pixel che corrisponde con la x, dimensione y della disector ottico (Figura 4B). Selezionare una dimensione di 50 µm x 50 µm, in modo che la dimensione di un lato della usergrid è definita come 212,5 pixel (pixel 50 x 4,25).
12. Determinare la posizione del disector ottico nell'immagine dello stack inserendo le coordinate ImageX e ImageY che definiscono il centro della disector ottico (Figura 4B). Eseguire la macro (" macro " → " Esegui Macro ") (Figura 4w).
    Nota: La griglia sparirà dall'immagine dello stack ( figura 3d e Figura 4 x). L'ottica disector verranno mantenute quando si abbassa il piano z ( Figura 3e e Figura 4 x).
13. Selezionare " plugin " → " contatore di cellule " per avviare il plugin di contatore di cellule (Figura 4y). Inizializzare il contatore di cella e selezionare un tipo di marcatore (Figura 4z). Ingrandire l'immagine (fare clic su " + ") ed eseguire la valutazione stereologiche dei numeri delle cellule ad un ingrandimento del 200%.
14. Identificazione dopaminergici neuronale perikarya dalla loro arrotondati o ovoidale delle cellule e forma dimensione ( Figura 1a). Quantificare il numero di celle utilizzando regole STEREOLOGICHE.
    Nota: Poiché il disector ottico è un cubo 3-dimensionale ( Figura 5a), definire i lati di esclusione come davanti, a sinistra e i lati superiore del cubo (rosso). Di conseguenza, don ' conteggio t TH + cellule che vengono a contatto con la linea rossa (sinistra e frontale) o il lato superiore. Aggiungere i risultati dei conteggi delle cellule per il file di foglio di calcolo preparato dal titolo, " calcolo del conteggio delle cellule " (passo 5).
15. Secondo l'immagine di SN, calcolare il quadrato della griglia successivo in cui inserire il disector ottico per il successivo conteggio delle cellule, utilizzando x, y passi la dimensione della griglia sovrastante ( Figura 5b) e il " ottico disector posizione " modello di foglio di calcolo, come descritto nel passaggio 4.
16. Eseguire una stima della cella numero utilizzando il " calcolo del conteggio delle cellule " foglio di calcolo (passo 5).

4. Calcolo di ottica Disector posizione utilizzando il " ottico Disector posizione " Spreadsheet Template

1. calcolare la dimensione e la posizione di ogni ottico disector per essere inserito in griglia sovrastante all'interno della struttura del (SN Figura 5b) utilizzando il " ottico disector position.xlsx " file di foglio di calcolo (File supplementare).
2. Inserire la conversione del pixel al µm, come definito dal " Imposta scala " comando, nelle posizioni di giallo marcate del " ottico disector position.xlsx " file ( Figura 6a e File supplementare ).
3. Inserire la dimensione prevista del disector ottico e la dimensione del quadrato della griglia della griglia sovrastante, definita dalla lunghezza di un lato (in µm), nelle posizioni contrassegnate arancione.
   Nota: I risultati sono raffigurati nelle caselle accanto alle caselle arancione rosse.
4. Iniziare con il quadrato della griglia all'interno della struttura di SN che è stata determinata come il punto di partenza (un-quadrato della griglia è stato selezionato per cominciare, come al punto 3.9, sopra).
5. Inserisci le coordinate x e y, come misurato nel passaggio 3.9, nelle caselle verdi del file (utilizzando questi valori, la x, y coordinate per il centro della disector ottico all'interno di questa piazza prima vengono calcolate e i risultati sono raffigurati nelle caselle blu). Eseguire la macro opt_dis_grid.txt (File supplementare).
6. Calcolare la x, y coordinate del disectors ottico consecutivi inserendo la distanza del quadrato della griglia (misurata in numero di quadrati) rispetto al primo quadrato della griglia-(scatole marroni).
   Nota: + x: quadrato della griglia si trova a destra; -x:-quadrato della griglia si trova a sinistra; + y:-quadrato della griglia si trova nella parte inferiore; -y:-quadrato della griglia si trova nella parte superiore. Risultati sono riportati nelle caselle grigie.

5. Stima della cella numero utilizzando il " calcolo del conteggio delle cellule " foglio di calcolo

1. Calcola la stima del numero di cellule TH + SN per animale (N) utilizzando la formula pubblicata da West et al., 1991 ³, dove ∑ Q ^– è definito come il numero totale di TH + neuroni contati in tutte le disectors ottico della sezione di un cervello.
   Nota: L'altezza dell'ottica disector (h) in relazione allo spessore misurato della sezione (t) è incluso nell'equazione. La frazione di campionamento di zona (asf) è definita come la proporzione della zona (A) delle dimensioni della cornice ottica disector (un disector ottico) nelle dimensioni del quadrato della griglia (x, y passo) (un ottico disector/A x, y passo) ( Figura 3b) e la frazione di campionamento di sezione (ssf) è definita come la proporzione delle sezioni del cervello intero in serie taglio:
   
   per garantire alta qualità quantitativa una stima, il coefficiente di errore (CE) deve essere inferiore a 0,10. Determinare la CE utilizzando la formula di Keuker et al., 2001 ¹⁰:
   
2. per la stereologiche stima del numero di ogni cella all'interno del SN mouse, inserire le informazioni indicate per quanto riguarda il numero totale di serie generato per topo, l'altezza della disector ottico, la x, y della disector ottico (un disector ottico, in µm ²), x, y zona del quadrato della griglia (x, y passo in µm ²), e il valore medio misurato lo spessore della sezione (in µm) nelle caselle gialle utilizzando il " calcolo della cella count.xlsx " file di foglio di calcolo ( Figura 6b e File supplementare ).
3. Analizzare ogni sezione SN dall'animale stesso, come descritto nel passaggio 5.
I conteggi delle cellule
4. insert per ogni ottica disector nelle caselle grigie, ogni riga che fa riferimento a una sezione di SN, utilizzando il " calcolo della cella count.xlsx " file di foglio di calcolo (File supplementare).
   Nota: Il numero stimato delle cellule e la CE calcolata sono raffigurati nelle caselle blu ( Figura 6b).

6. Stima del numero di cellule utilizzando un sistema Stereology commercialmente disponibili

numero di cellulare

1. Start la stima di dopaminergici SNpc cliccando su " sonde " → " ottico frazionatore Workflow " aprire il frazionatore ottico Finestra Workflow.
   Nota: Una nuova finestra apparirà per determinare se una nuova serie di SN sta per essere contati.
2. Avviare una nuova serie di sezioni di TH + SN facendo " avviare un nuovo soggetto " nella finestra pop-up.
3. Passare attraverso le varie fasi del flusso di lavoro frazionatore ottico. Impostare il soggetto nel primo passaggio. Per questo, inserire l'investigatore ' s nome, l'oggetto ' nome s (SN group) e altre informazioni utili. Inserire i numeri delle sezioni a contare per questo SN. Inserire lo spessore del taglio delle sezioni del tessuto. Inserire l'intervallo di sezione, che in questo caso è di quattro. Inserire il numero a caso determinata sezione per iniziare con.
4. Nel secondo passaggio, impostare il microscopio a basso ingrandimento (obiettivo 2 X) e selezionare " Mag obiettivo 2x " dal menu.
5. Nel passaggio 3, tracciare l'area di interesse con il tasto sinistro del mouse, che è la Scissura, come descritto da Baquet et al., 2009 ¹⁷.
6. Impostare il microscopio ad alto ingrandimento nel passaggio 4. Per questo, modificare l'obiettivo a 100 X e selezionare " lente X Mag 100 " dal menu a discesa.
7. Misurare lo spessore montato nel passaggio 5 di messa a fuoco verso l'alto e verso il basso della sezione.
8. Nel passaggio 6, definire le dimensioni della cornice di conteggio come 50 x 50 µm; questa è la dimensione dell'ottica disector (x, y).
9. Nel passaggio 7, impostare la dimensione della griglia di campionamento casuale sistematico (SRS) come 130 x 130 µm.
10. Entrare in una zona di guardia 3-µm nel passaggio 8.
11. Salvare le impostazioni nel passaggio 9.
12. Infine, contare le cellule dopaminergiche TH + in ognuna del disectors ottico all'interno della griglia SRS nel passaggio 10 del Workflow frazionatore ottico. Per questo, avviare cliccando sul " conteggio " pulsante.
13. Dopo aver terminato una sezione, fare clic sui " iniziare la sezione successiva " pulsante per avviare il flusso di lavoro frazionatore ottico della prossima sezione SN della stessa serie e SN.
14. Quando l'ultima sezione di SN della serie SN one è stata quantificata, fare clic su " ho ' ve finito Counting. "
15. Fare clic sul " Visualizza i risultati del " pulsante per visualizzare i risultati del campionamento stereology.

Risultati

Usando il metodo presentato, il numero stimato di TH + neuroni dopaminergici in SN ha variato fra cellule 7.363 e 7.987 a destra e, nella parte sinistra SN, tra le celle di 7.446 e 7.904. Così, il numero medio dei neuroni dopaminergici (± SEM) era 7.647 ± 83 cellule per il diritto SN e 7.675 ± 66 per la sinistra SN. La CE calcolata per ciascun animale è stato inferiore a 0,08 (gamma: 0,073-0,079) (Figura 7). Per accertare la comparabilità di questo meto...

Discussione

Stereology inizia con lavorazione del tessuto. Il taglio seriale del tessuto SN deve essere eseguito con attenzione per evitare la perdita delle sezioni durante l'analisi STEREOLOGICHE. Inoltre, un passo essenziale consiste nel contrassegnare un emisfero al fine di distinguere la destra dalla sinistra SN durante l'esecuzione di ansia. Immissione di un piccolo foro nella parte superiore del tronco cerebrale generato i risultati migliori nello studio presentato. Inoltre, dal lavorare con le esigenze di metodo frazionatore ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paxinos mouse atlas			The Mouse Brain George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet & created by Paul Halasz
brain matrix slicer mouse	Zivic Instruments	BSMAS 001-1
paraformaldehyde	Merck	1040051000
sucrose /D(+) Saccharose	Roth	4621.1
isopentane	Roth	3927.1
glycerol	Merck	1040931000
Ethanol	Sigma Aldrich	32205-1L
Name	Company	Catalog Number	Comments
phosphate buffered saline ingredients:
sodium chloride	Sigma Aldrich	31434-1KG-R
potassium dihydrogen phosphate	Merck	1048731000
di-sodium hydrogen phosphate dihydrate	Merck	1065801000
potassium chloride	Merck	1049360500
normal goat serum	Dako	X0907
bovine serum albumin	Sigma	A4503-100G
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-100ml	detergent
3,3-Diaminobenzidine-tetrahydrochlorid/DAB tablets 10mg pH 7.0	Kem En Tec	4170
H2O2/ Hydrogen peroxide 30%	Merck	1072090250
avidin/biotin reagent	Thermo Scientific	32050	Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100
rabbit anti mouse tyrosine hydroxylase antibody	abcam	Ab112	1:1000
biotinylated goat-anti-rabbit IgG H+L	vector laboratories	BA-1000	1:100
StereoInvestigator version 11.07	MBF
BX53 microscope	Olympus
Visiview	Visitron Systems GmbH	3.3.0.2
Axiophot2	Zeiss
ImageJ software	NIH	Version 4.7
Tissue-TEK OCT	Sakura	4583
dry ice
grid overlay plugin	Wayne Rasband		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html
cell counter plugin	Kurt de Vos		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html).
optical disector macro	Christopher Ward
C57Bl/6N male mice	Charles River, Germany
SuperFrost Plus coated object slides	Langenbrinck, Germany
25G needle Microlance 3	BD	300400
REGLO Analog Infusion pump	Ismatec	ISM 829
StereoInvestigator system			StereoInvestigator version 11.07
BX53 microscope			BX53 microscope
self-assorted stereology			Visiview
Axiophot2			Axiophot2