Stereologischen Schätzung der dopaminergen Neuron Nummer in der Maus Substantia Nigra mit dem optischen Plasmafraktionierer und Standard-Mikroskopie-Ausrüstung

Zusammenfassung

Dieses Werk stellt eine schrittweise Protokoll für die unparteiischen stereologischen Schätzung der dopaminergen neuronalen Zellzahlen in der Maus Substantia Nigra mit standard-Mikroskopie-Ausrüstung (z. B. einem Lichtmikroskop eine motorisierte Objekttabelle (X, y, z Flugzeug) und Public Domain-Software für die digitale Bildanalyse.

Zusammenfassung

In präklinischen Krankheit Parkinson Forschung unbedingt Analyse des Nigrostriatal Trakt, einschließlich Quantifizierung der dopaminergen Neuronenverlust in der Substantia Nigra. Um die gesamte dopaminergen Neuron Anzahl abschätzen zu können, gilt unvoreingenommene Stereologie mit der optischen Plasmafraktionierer-Methode heute der Goldstandard. Da die Theorie hinter der optischen Plasmafraktionierer Methode Komplex ist und Stereologie schwierig ist, ohne spezielle Ausrüstung zu erreichen, sind mehrere handelsübliche komplette Stereologie-Systeme, die die notwendige Software enthalten, rein vorhanden für Zelle zählen Gründe. Da Kauf eine spezialisierte Stereologie Setup nicht immer möglich, aus vielen Gründen ist, dieser Bericht beschreibt eine Methode für die stereologischen Schätzung der dopaminergen neuronale Zelle mit standard-Mikroskopie zählt, einschließlich einem Lichtmikroskop eine motorisierte Objekttabelle (X, y, Z-Ebene) mit imaging-Software und einem Computer für Analyse. Eine schrittweise Erklärung wird zum stereologischen Quantifizierung der optischen Plasmafraktionierer Methode durchführen, und vorprogrammierte Dateien für die Berechnung der geschätzten Zellzahlen werden zur Verfügung gestellt. Um die Genauigkeit dieser Methode zu bewerten, wurde ein Vergleich mit Daten aus einem handelsüblichen Stereologie Apparat durchgeführt. Vergleichbare Zellzahlen wurden durch dieses Protokoll und dem Stereologie Gerät, so zeigen die Präzision dieses Protokolls für unvoreingenommene Stereologie gefunden.

Einleitung

Die Quantifizierung der neuronalen Zellennummer ist von zentraler Bedeutung in der präklinischen Krankheit Parkinson Forschung zur Bestimmung der Höhe der Neurodegeneration in der Substantia Nigra (SN)^1,2. Die unparteiische stereologischen Schätzung der Zellzahl in einer Region von Interesse gilt als der Goldstandard^3,4,5.

Vor dem Aufkommen der unvoreingenommene Stereologie wurde die Anzahl der Neuronen in den Abschnitten bewertet, durch Manipulation der gezählten Zelle Profile für die Variable Wahrscheinlichkeiten zu korrigieren, dass Neuronen in Sicht in einem Abschnitt kommen. Eine der am häufigsten verwendeten Methoden wurde die Korrektur des quantifizierten Zellenzahlen von Abercrombie⁶beschrieben. Diese Methode versucht, zu berücksichtigen, dass die Zellen mehr als einmal quantifiziert werden können, wenn in benachbarten Dünnschliffe Fragmente der gleichen Zelle gefunden werden. Aus diesem Grund generiert Abercrombie und anderen Autoren Gleichungen, die Annahmen über die Form, Größe und Ausrichtung der gezählten Zellen^7,8erforderlich. Diese Annahmen wurden jedoch in der Regel nicht realisiert und daher führte zu systematischen Fehlern und Abweichungen von der tatsächlichen Zellzahl (d. h. Bias). Darüber hinaus konnte die Vorspannung nicht durch zusätzliche Probenahme³reduziert werden.

Für die stereologischen Schätzung der Zelle Zahlen mit Hilfe der optischen Plasmafraktionierer sind mathematische Prinzipien angewandt, um direkt die Zellzahlen direkt in einem definierten, 3-dimensionale Volumen schätzen. Der Vorteil dieser Methode ist, dass es nicht Annahmen über die Form, Größe und Ausrichtung der Zellen gezählt werden. So geschätzte Zellzahlen sind näher an die wahren Werte und näher als die Größe der Stichprobe (d.h., unvoreingenommene)³erhöht. Weil viele Regeln befolgt werden müssen, wenn Sie Stereologie verwenden, um die Methode neutral zu halten, Ready-to-Use kommerzielle Stereologie Systeme wurden entwickelt (Übersicht finden Sie unter Schmitz und Hof, 2005-⁴). Spezialisierte Stereologie Systeme implementieren Sie Design-basierte stereologischen Methoden mit a priori definiert Sonden und Stichprobenpläne für stereologischen Bewertungen, die zur Unabhängigkeit von Form, Größe, räumliche Verteilung und Ausrichtung der führen die Zellen zu analysierten^4,9. Handelsübliche Stereologie Systeme sind jedoch teuer; Dies kann die Umsetzung in neue Forschung einschränken.

Das Ziel dieser Studie war es, eine brauchbare Technik für die Design-basierte stereologischen Schätzung der dopaminergen Zellzahlen in der Maus SN, beschäftigt die optische Plasmafraktionierer-Methode und mit standard-Mikroskopie Ausrüstung (z. B. Licht entwickeln Mikroskop, Mikroskop standard Software und einer motorisierten X, y, Z-Phase). Hierfür ist eine Anleitung, wie Sie Maus Hirngewebe zu verarbeiten und SN Zellzahlen mit Design-basierte unvoreingenommene Stereologie abzuschätzen vorgestellt. Darüber hinaus sind Vorlagen für die Berechnung der geschätzten Zellzahlen und Koeffizienten der Fehler (CE) zur Verfügung gestellt.

Die hier beschriebene Methode beschränkt sich nicht auf die Analyse der SN, aber für den Einsatz in anderen anatomisch definierten Regionen des Gehirns Maus oder Ratte angepasst werden kann. Zum Beispiel, wurde unvoreingenommene Stereologie zur neuronalen Zellzahlen in der Hippocampus-¹⁰ und den Locus Coeruleus¹¹zu schätzen. Darüber hinaus können auch Zelltypen als Neuronen, wie Astrozyten¹² und Mikroglia¹³, beurteilt werden. Diese Methode kann daher nützlich für Wissenschaftler, die unvoreingenommene Stereologie in ihrer Forschung durchführen wollen, aber nicht bereit sind, eine Menge Geld um ein Stereologie System zu kaufen.

Protokoll

allen anwendbare internationalen, nationalen und/oder institutionellen Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Tieren folgten. Das Protokoll wurde von den lokalen Behörden bei der Regierung von Unterfranken, Würzburg genehmigt.

1. Verarbeitung von Gewebe und Immunohistochemistry

1. einschläfern Mäuse mit CO ₂ oder einem anderen zugelassenen Methode.
2. Perfuse sechs 12 Wochen alten C56Bl/6N männliche Mäuse Transcardially mit 10 mL 0,1 M Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit einer 25-G-Nadel und eine Infusionspumpe, gefolgt von 70 mL 4 % Paraformaldehyd (PFA) in 0,1 M PBS.
   Vorsicht: PFA ist giftig, Allergene und karzinogen.
3. Sezieren das Gehirn der Maus in der koronalen Ebene mit einem Gehirn Matrix Hobel in der Region von +0,74 mm Bregma (Abbildung 25, Paxinos und Franklin Maus Gehirn Atlas ¹⁴).
4. Setzen die dorsale Teil des Gehirns, einschließlich der SN, in 4 % PFA in 0,1 M PBS für 1D bei 4 ° C für Immersion-Fixierung.
5. Tauschen die PFA für 30 % Saccharose/0,1 Mol PBS-Lösung für Cryo-Schutz und inkubieren Sie für ein weiteres 2 d bei 4 ° c
6. Put die dorsale Teil des Gehirns in eine Cryomold mit optimale Arbeitstemperatur (OCT gefüllt) zusammengesetzte und langsam Einfrieren des Gewebes in flüssigen Trockeneis gekühlte Isopentane.
   Vorsicht: Trockeneis ist extrem kalt (-78 ° C); Verwenden Sie persönliche Schutzausrüstung (PSA), einschließlich Handschuhe, während der Arbeit mit Trockeneis. Trockeneis verdampft in CO ₂; Daher arbeiten unter einer Abzugshaube.
7. Seriell 30 µm Cryo-Abschnitte in der koronalen Ebene schneiden und sammeln die Abschnitten 2,46 mm vom Bregma (Abbildung 51, Paxinos und Franklin Maus Gehirn Atlas ¹⁴) beginnend und endend bei 4,04 mm von Bregma (Abbildung 64, Paxinos und Franklin Maus Gehirn Atlas ¹⁴).
8. Speichern vier Serien in Röhren, die mit Kryoprotektivum (30 % Glycerin, Ethoxyethanol 30 % und 40 % PBS) bei-20 ° c gefüllt werden Während des speziellen Verfahrens kennzeichnen die rechte Hemisphäre durch Punktion ein kleines Loch in den oberen Bereich des Hirnstamm.
9. Für immunhistochemische Färbung, wählen Sie eine Reihe von Abschnitten per Mausklick. Preincubate frei schwebenden Abschnitte für 1 h in 10 % normalem Ziegenserum (NGS)/2% BSA/0.5% Waschmittel in 0,1 Mol PBS auf einem Boston-Shaker. Inkubieren Sie die Abschnitte mit Kaninchen Anti-Maus-Tyrosin Hydroxylase (TH; 1:1,000 Verdünnung) Antikörper in 2 % NGS/2% BSA/0.5% Waschmittel in 0,1 Mol PBS verdünnt über Nacht bei 4 ° c
10. Anwenden sekundäre Antikörper gegen Kaninchen Igs (1: 100 Verdünnung) für 2 h bei Raumtemperatur, gefolgt von Avidin/Biotin Reagenz (1: 100 Verdünnung). Inkubieren und Flecken mit 3,3-Diaminobenzidine-Tetrahydrochloride (DAB) und H ₂ O ₂. Montieren Sie die Abschnitte nach dem Färben sie auf beschichteten Objekt Folien.
    Hinweis: TH + dopaminergen SN Neuronen sind in Figur 1a angezeigt. Durch eine Reihe Färbung, sind durchschnittlich 13 SN Abschnitte, erstreckt sich von der Höhlung bis kaudalen Teile der SN Pars Compacta (SNpc) und Reticulata, pro Tier ( Abbildung 1 b) gefärbt. Die Bereiche werden von 120 µm (1/4 Serie) getrennt ( Abbildung 1 c).
    Vorsicht: DAB ist karzinogenverdächtig. Es ist giftig durch Kontakt und Inhalation. PSA zu verwenden, bei der Arbeit mit DAB.

2. Erwerb von Bildern

1. erfassen TH-Proteins gebeizt SN Abschnitte über digital imaging-Software, die an ein Mikroskop gekoppelt ist. Jeder Abschnitt einer Reihe separat zu analysieren.
2. Die Option Scan Dia der imaging-Software. Speichern im TIFF-Format für qualitativ hochwertige Bilder (Abbildung 2).
   Hinweis: Bildauflösung beträgt 312 Pixel pro cm.
3. Presse " erwerben " Erwerb Fenster (Abbildung 2a).
4. Soll das binning " 2 " für Graustufenbilder.
   Hinweis: Die Übernahme von Graustufenbildern statt Farbe Bilder reduziert die Größe der letzte Stapel-Image-Datei (Abbildung 2a).
5. Klicken Sie auf " Show Live " im Erfassungsfenster öffnet ein neues Fenster mit dem live-Bild des Abschnitts (Abbildung 2 ein und b).
6. Klicken Sie auf " Stufe " im Fenster "Übernahme". Wählen Sie " Scan-Dia " im Dropdown-Menü und aktivieren Sie das Kontrollkästchen (Abbildung 2 c).
   Hinweis: Dies ermöglicht den Erwerb und die Ausrichtung der stark vergrößerten SN Bilder (630 X Vergrößerung) in der X, y-Ebene sowie die Übernahme von Stapel Bilder mit einem Abstand zwischen aufeinanderfolgenden Bildern von 1 µm in der Z-Ebene, für eine Gesamtreichweite von 13 µ m.
7. Wählen Sie 2,5 X Ziel zu suchen, die SN.
8. Ändern Sie das Ziel auf 63 x.
9. Definieren Sie die obere linke Ecke (Hi) (Abbildung 2 c) und unten rechts (LowRight) (Abb. 2d) des Abschnitts durch Anklicken " Satz. "
10. Klicken Sie auf " Z-Serie " und überprüfen Sie die " Z-Plane Serie " Feld (Abb. 2e).
11. Bestimmen die tatsächliche montierten dicke Abschnitte an drei zufällig ausgewählte zählen Websites pro Abschnitt über die imaging-Software. Klicken Sie dazu auf " Ansicht oben versetzt " zu definieren, die oben im Abschnitt (Abb. 2e) und klicken dann auf " stoppen Blick Top " (Abb. 2f). Klicken Sie danach auf " Ansicht unten versetzt " (Abb. 2f) und klicken Sie dann auf " stoppen Ansicht unten " (Abbildung 2 g). Notieren Sie sich die Dicke des Abschnitts.
12. Subtrahieren 3 µm (Schutzbereichen) von oben versetzt und geben Sie das Ergebnis in den Top-Offset-Slot (Abb. 2 h). Subtrahieren Sie 13 µm (Höhe des optischen Disector) von der oberen Offset Nummer und geben Sie das Ergebnis in den unteren Versatz Schlitz (Abb. 2i). Wählen Sie die folgenden Parameter: Schritte, 14; Größe, 1.00 (Abbildung 2i).
    Hinweis: Dies entspricht einer Dicke in der Z-Ebene von 13 µm, mit einem 1-µm-Abstand zwischen aufeinanderfolgenden Bildern.
13. Wählen Sie das Verzeichnis zum Speichern der Datei (Abb. 2j).
14. Klicken Sie auf " Sequenz " den Erwerb (Abbildung 2j) beginnen.
15. Klicken Sie auf " Verarbeitung " und wählen Sie die folgenden Parameter: " allen Ebenen, " aus " Sequenz; " " Montage; " und die " schnell " und " Stitching " Boxen mit einer Bildüberlappung von 10 % (Abbildung 2-k). Beginnen Sie, die Bilder zu nähen, indem er auf " starten ".
    Hinweis: Dies erzeugt Bilder stapeln für die Analyse (Abbildung 2 l, Abbildung 3a -e).

3. Reihenfolge der stereologischen Bewertung

1. führen Sie die Analyse von SN Stapel Bilder mithilfe der NIH ImageJ Software-Version 4.7.
2. Die beiden Plugins, die benötigt werden von der ImageJ.nih.gov-Website herunterladen: die " Overlay-Netz " Plugin ¹⁵ und die " Cell Counter " Plugin ¹⁶. Beide Plugins zu installieren, wie beschrieben.
3. Für die unparteiischen stereologischen Bewertung, definieren Sie die Zählung Parameter wie folgt: Rastergröße, 130 x 130 µm; Counting Rahmen, 50 x 50 µm; und optische Disector Höhe, 13 & #181; m.
4. Öffnen Sie das Bild durch Anklicken " Datei " → " offene " (Abb. 4a) legen Sie die Bildgröße mithilfe der " Analyze " → " Set Maßstab " Befehl (Abbildung 4 b). In diesem Schritt ändern die definierte Größe von Pixel in µm (Abb. 4 c).
   Hinweis: Für die analysierten Bilder, 425 Pixel entspricht 100 µm.
5. Wählen Sie die " Plugins " → " Raster " → " Rastertyp: Linien " Befehl nach dem Zufallsprinzip ein Raster einfügen. Überprüfen Sie die " Random Offset " Feld. Definieren Sie die Größe von einem Quadratmeter innerhalb des Rasters (Planquadrat) 130 µm X 130 µm = 16.900 µm ² ( Abb. 3 b und Abbildung 4 d und e).
6. Änderung Bildtyp aus 16-Bit-RGB-Farbe (Klicken Sie auf " Bild " → " Typ " → " RGB-Farbe ") (Abb. 4f). Suchen Sie die SNpc wie von Baquet Et Al. beschrieben ¹⁷. umschließen die SNpc mit den " Pinsel-Werkzeug " (Breite Pinsel: 11) ( Abbildung 3 c und Abbildung 4 g -Ich).
7. "Rückgängig" der " Maßstab gesetzt " Befehl, indem Sie auf " Analyze " → " Skala eingestellt " → " maßstabsgetreu zu entfernen klicken Sie auf " (Abbildung 4j -l) um die Leistung der Berechnungen in Pixeln eher zu ermöglichen als µm.
8. Machen Sie einen Screenshot (Abbildung 4 m), die Image-Datei speichern und öffnen Sie die neue Datei mit ImageJ (Abbildung 4n). Wählen Sie " Punkt " (Abbildung 4o) und einer Bürste-Breite von 25 (Abbildung 4-p). Markieren Sie jedes Planquadrat, dass Kontakte der SN für die Platzierung von einem optischen Disector (Abbildung 4q). Analysieren von der Zellzahl in allen optischen Disectors, die vollständig lokalisiert werden oder teilweise innerhalb der skizzierten SN.
9. Wählen Sie ein Planquadrat, die Bauteile der SN enthält. Maßnahme die obere linke Ecke des Platzes mit dem Cursor in ImageJ zum Definieren der x und y Koordinaten um zu beginnen mit (Abbildung 4r).
   Hinweis: Koordinaten für optische Disector positionieren mit eingefügt werden die " optische Disector Position " (Abbildung 4 s), wie in Schritt 4 beschrieben.
10. Der optischen Disector Position zu berechnen, mit der Kalkulationstabelle Vorlage berechtigt, " optische Disector Lage, " wie in Schritt 4 beschrieben.
11. Kalibrieren der optischen Disector (Makro geschrieben von Christopher S. Ward, Ergänzende Datei) durch Anklicken " Plugins " → " Makros " → " bearbeiten " (Abbildung 4 t), öffnen Sie die " Opt_dis_ Grid.txt " Datei (Abbildung 4u), und definieren Sie die Größe von der " Usergrid " in Pixeln, die die x-und y-Dimension des optischen Disector (Abbildung 4v) entspricht. Wählen Sie eine Größe von 50 µm X 50 µm, so dass die Größe einer Seite von der Usergrid als 212,5 Pixel (50 x 4,25 Pixel) definiert ist.
12. Bestimmen Sie die Position des optischen Disector im Stapel Bild durch die ImageX und ImageY Koordinaten, die den Mittelpunkt der optischen Disector (Abbildung 4v) definieren einfügen. Führen Sie das Makro (" Makros " → " Makro ausführen ") (Abbildung 4w).
    Hinweis: Das Gitter wird aus dem Stapel Bild ( Abbildung 3d und Abbildung 4 X) verschwinden. Die optische Disector bleiben erhalten, wenn in der Z-Ebene ( Abbildung 3e und Abbildung 4 X) nach unten bewegen,.
13. Select " Plugins " → " Cell Counter " Cell Counter Plugin (Abbildung 4y) starten. Initialisieren Sie die Zelle-Zähler und wählen Sie einen Marker (Abbildung 4z). Vergrößern Sie das Bild (Klicken Sie auf " + "), und führen Sie die stereologischen Bewertung der Zelle Zahlen bei einer Vergrößerung von 200 %.
14. Identifizieren dopaminergen neuronale Perikarya durch ihre abgerundeten oder eiförmige Form und Zelle Größe ( Abbildung 1a). Die Anzahl der Zellen mit stereologischen Regeln zu quantifizieren.
    Hinweis: Da die optische Disector eines 3-dimensionalen Würfels ( Abb. 5a) ist, definieren Sie die Ausgrenzung Seiten als vorne, links, und Top Seiten des Würfels (rot). Also, don ' t Graf TH + Zellen kommen in Kontakt mit der roten Linie (links und vorne) oder die Oberseite. Die vorbereiteten Kalkulationstabellendatei berechtigt, die Ergebnisse der Zellzahlen hinzufügen " Berechnung der Zellzahl " (Schritt 5).
15. Nach dem SN-Bild berechnen der nächsten Planquadrat, legen Sie die optische Disector für die nächste Zellzahl mit x, y tritt die Größe des Rasters darüberliegenden ( Abb. 5 b) und die " optische Disector Position " Arbeitsblattvorlage, wie in Schritt 4 beschrieben.
16. Führen Sie eine Schätzung der Zelle Nummer mit Hilfe der " Berechnung der Zellzahl " Tabelle (Schritt 5).

4. Berechnung der optischen Disector Position mit Hilfe der " optische Disector Position " Arbeitsblattvorlage

1. zu berechnen, die Größe und Position der einzelnen optischen Disector in das darüber liegende Netz innerhalb der Gliederung der SN (platziert werden Abbildung 5 b) mit der " optische Disector position.xlsx " Tabellenkalkulationsdatei (Ergänzende Datei).
2. Legen Sie die Umwandlung von Pixel pro µm, entsprechend den Festlegungen der " Skala eingestellt " Befehl, in den gelben markierten Stellen von der " optische Disector position.xlsx " Datei ( Abbildung 6a und zusätzliche Datei ).
3. Der geplanten Größe des optischen Disector und die Größe des Platzes Raster des darüberliegenden Rasters, definiert durch die Länge einer Seite (in µm), in den orangenen markierten Stellen einfügen.
   Hinweis: Ergebnisse sind dargestellt in den roten Kästchen neben der orange Box.
4. Beginnen mit dem Planquadrat innerhalb der SN-Gliederung, die als Ausgangspunkt bestimmt wurde (ein Planquadrat wurde zunächst wie in Schritt 3.9, oben ausgewählt).
5. Legen Sie die x- und y-Koordinaten, gemessen in Schritt 3.9, in die grünen Felder der Datei (unter Verwendung dieser Werte, die X, y-Koordinaten für die Mitte des optischen Disector innerhalb dieser ersten Platz berechnet, und die Ergebnisse werden in den blauen Kästen dargestellt). Führen Sie das opt_dis_grid.txt-Makro (Ergänzende Datei).
6. Berechnen die x-, y-Koordinaten der aufeinander folgenden optischen Disectors durch Einfügen der Planquadrat Entfernung (gemessen in Anzahl der Quadrate) bezogen auf die erste Planquadrat (braune Kisten).
   Hinweis: + x: Planquadrat befindet sich auf der rechten Seite; -x: Planquadrat befindet sich auf der linken Seite; + y: Planquadrat befindet sich an der Unterseite; -y: Planquadrat befindet sich an der Spitze. Ergebnisse sind in die grauen Felder gezeigt.

5. Schätzung der Zelle Nummer mit Hilfe der " Berechnung der Zellzahl " Tabelle

1. die geschätzte Anzahl der TH + SN Zellen pro Tier (N) mit der Formel veröffentlicht berechnen von West Et Al., 1991 ³, wo ∑ Q ^– ist definiert als die Gesamtzahl der TH + Neuronen in allen optischen Disectors von einem Gehirn Abschnitt gezählt.
   Hinweis: Die Höhe der optischen Disector (h) in Bezug auf die gemessene Dicke der Sektion (t) ist in der Gleichung enthalten. Der Bereich Probenahme Bruch (Asf) ist definiert als der Anteil der Fläche (A) der optischen Disector (optische Disector) Bildgröße innerhalb der quadratischen Größe des Rasters (X, y-Schritt) (optische Disector/A X, y-Schritt) ( Abb. 3 b), und die Abschnitt Probenahme Bruchteil (Ssf) ist definiert als der Anteil der Abschnitte des gesamten seriell geschnittenen Gehirns:
   
   Sicherstellung qualitativ hochwertiger quantitative Schätzungen, der Koeffizient der Fehler (CE) sollte kleiner als 0,10 sein. Bestimmen der CE mit Hilfe der Formel von Keuker Et Al., 2001 ¹⁰:
   
2. für die stereologischen Schätzung der Zellzahl innerhalb der SN der einzelnen Maus, legen Sie die angegebenen Informationen über die Gesamtzahl der generierten Serie per Mausklick, die Höhe der optischen Disector, X, y-Bereich der optischen Disector (eine optische Disector in µm ²), X, y-Fläche von Planquadrat (X, y-Schritt im µm-²), und der Mittelwert gemessen Dicke des Abschnitts (in µm) in die gelben Felder mit den " Berechnung der Zelle count.xlsx " Tabellenkalkulationsdatei ( Abb. 6 b und ergänzende Datei ).
3. Abschnitts SN vom gleichen Tier, zu analysieren, wie in Schritt 5 beschrieben.
4. Insert Zelle zählt für jede optische Disector in die grauen Felder jeder Zeile bezieht sich auf eine SN-Sektion, unter Verwendung der " Berechnung der Zelle count.xlsx " Tabellenkalkulationsdatei (Ergänzende Datei).
   Hinweis: Die geschätzten Handynummer und die berechnete CE sind dargestellt in den blauen Kästen ( Abb. 6 b).

6. Schätzung der Anzahl von Zellen mit einem kommerziell verfügbaren Stereologie System

1. Start der Schätzung der dopaminergen SNpc Zelle Nummer durch Anklicken " Sonden " → " optische Plasmafraktionierer Workflow ", optische Plasmafraktionierer zu öffnen Workflow Fenster.
   Hinweis: Ein neues Fenster öffnet sich um festzustellen, ob eine neue Serie von SN wird gezählt werden.
2. Starten eine neue Serie von TH + SN Abschnitte mit einem Klick " starten Sie ein neues Thema " im Popupfenster.
3. Gehen durch die verschiedenen Schritte des optischen Plasmafraktionierer Workflows. Das Thema im ersten Schritt eingerichtet. Hierzu legen Sie die Ermittler ' Namen, den Betreff ' s Name (SN-Gruppe) und andere hilfreiche Informationen. Legen Sie die Anzahl der Abschnitte für diese SN rechnen. Legen Sie die Dicke der geschnittenen Gewebeschnitten. Fügen Sie das Abschnitt-Intervall vier in diesem Fall ist. Legen Sie die nach dem Zufallsprinzip ermittelten Abschnittsnummer zu.
4. Im zweiten Schritt legen Sie das Mikroskop zu geringe Vergrößerung (2 X Objektiv) und wählen " 2 X Mag Objektiv " aus dem Menü ".
5. In Schritt 3, zeichnen die Region von Interesse mit der linken Maustaste, die die SNpc wie von Baquet Et al. beschrieben., 2009 ¹⁷.
6. Stellen Sie das Mikroskop auf hohe Vergrößerung in Schritt 4. Dazu ändern Sie das Ziel auf 100 X und wählen Sie " 100 X Mag Objektiv " aus dem Dropdown-Menü.
7. Messen Sie die montierte Dicke in Schritt 5 durch die Konzentration auf der Oberseite und an der Unterseite des Abschnitts.
8. In Schritt 6, definieren die Counting Rahmengröße 50 x 50 µm; Dies ist die Größe des optischen Disector (X, y).
9. In Schritt 7 legen Sie die Größe des Rasters systematische Stichproben (SRS) 130 x 130 µm.
10. Geben Sie eine 3-µm-Schutzbereichen in Schritt 8.
11. Speichern Sie die Einstellungen in Schritt 9.
12. Zählen schließlich die TH + dopaminergen Zellen in jedem optischen Disectors innerhalb des SRS-Rasters in Schritt 10 des optischen Plasmafraktionierer Workflows. Hierzu starten Sie durch Anklicken der " zählen " Schaltfläche ".
13. Nach Abschluss einen Abschnitt, klicken Sie auf die " beginnen nächsten Abschnitt "-Taste, um die optische Plasmafraktionierer-Workflow des nächsten Abschnitts SN der gleichen SN Serie starten.
14. Wenn der letzte Abschnitt der SN einer SN Serie quantifiziert worden, klicken Sie auf " ich ' Ve Finished Counting. "
15. Klicken Sie auf die " View Results " Schaltfläche zum Anzeigen der Ergebnisse der Probenahmen Stereologie.

Ergebnisse

Die vorgestellte Methode, die geschätzte Anzahl der TH + dopaminergen Neuronen in der rechten Ecke SN lag zwischen 7.363 und 7.987 Zellen und in der linken SN, verwenden zwischen 7.446 und 7.904 Zellen. So war die durchschnittliche Anzahl von dopaminergen Neuronen (± SEM) 7.647 ± 83 Zellen für die Rechte SN und 7.675 ± 66 für die linke SN. Die berechneten CE für jedes Tier war niedriger als 0,08 (Bereich: 0.0.73.-0.079) (Abbildung 7). Um die Vergleichb...

Diskussion

Stereologie beginnt mit Gewebe Verarbeitung. Das serielle Schneiden von SN Gewebe muss sorgfältig durchgeführt werden, zur Verhinderung des Verlusts der Abschnitte während der stereologischen Analyse. Darüber hinaus ist ein wesentlicher Schritt, eine Hemisphäre zu kennzeichnen, um das Recht von links SN zu unterscheiden, bei der Durchführung der Stereologie. Platzieren ein kleines Loch am oberen Teil der Hirnstamm erzeugt die besten Ergebnisse in der vorgestellten Studie. Darüber hinaus schneiden da die Arbeit mit...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paxinos mouse atlas			The Mouse Brain George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet & created by Paul Halasz
brain matrix slicer mouse	Zivic Instruments	BSMAS 001-1
paraformaldehyde	Merck	1040051000
sucrose /D(+) Saccharose	Roth	4621.1
isopentane	Roth	3927.1
glycerol	Merck	1040931000
Ethanol	Sigma Aldrich	32205-1L
Name	Company	Catalog Number	Comments
phosphate buffered saline ingredients:
sodium chloride	Sigma Aldrich	31434-1KG-R
potassium dihydrogen phosphate	Merck	1048731000
di-sodium hydrogen phosphate dihydrate	Merck	1065801000
potassium chloride	Merck	1049360500
normal goat serum	Dako	X0907
bovine serum albumin	Sigma	A4503-100G
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-100ml	detergent
3,3-Diaminobenzidine-tetrahydrochlorid/DAB tablets 10mg pH 7.0	Kem En Tec	4170
H2O2/ Hydrogen peroxide 30%	Merck	1072090250
avidin/biotin reagent	Thermo Scientific	32050	Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100
rabbit anti mouse tyrosine hydroxylase antibody	abcam	Ab112	1:1000
biotinylated goat-anti-rabbit IgG H+L	vector laboratories	BA-1000	1:100
StereoInvestigator version 11.07	MBF
BX53 microscope	Olympus
Visiview	Visitron Systems GmbH	3.3.0.2
Axiophot2	Zeiss
ImageJ software	NIH	Version 4.7
Tissue-TEK OCT	Sakura	4583
dry ice
grid overlay plugin	Wayne Rasband		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html
cell counter plugin	Kurt de Vos		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html).
optical disector macro	Christopher Ward
C57Bl/6N male mice	Charles River, Germany
SuperFrost Plus coated object slides	Langenbrinck, Germany
25G needle Microlance 3	BD	300400
REGLO Analog Infusion pump	Ismatec	ISM 829
StereoInvestigator system			StereoInvestigator version 11.07
BX53 microscope			BX53 microscope
self-assorted stereology			Visiview
Axiophot2			Axiophot2