otx1 和 otx2 作为鼻窦癌和嗅觉神经母细胞瘤的两种可能的分子标记物的鉴定

摘要

同源基因是调节基因, 通常与成人生物中的肿瘤有关。我们通过免疫组织化学和实时 pcr 分析, 在正常和炎症性鼻黏膜和鼻窦肿瘤中研究了它们的比较表达, 以便将它们作为可能的诊断和治疗靶点。

摘要

otx同源 (hb) 基因在胚胎形态发生过程中和成人生物嗅觉上皮发育过程中被表达。这些基因中发生的突变通常与人类肿瘤的发生有关。目前还没有关于otx基因与鼻腔肿瘤之间可能存在的相关性的数据。这项工作的目的是了解是否 otx1和otx2 可以被认为是鼻腔肿瘤发展中的分子标记。我们选择鼻窦腺癌通过免疫组织化学和实时 pcr 分析来研究otx1和otx2基因的表达。所有的肠型腺癌 (itac) 样本中都没有otx1和otx2 。只有在非肠型腺癌 (nitc) 中发现了 otx1 mrna, 而otx2 mrna 仅在嗅觉神经母细胞 (ont) 中表达。我们已经证明,不同基因表达的 otx1和otx2基因可能是一个有用的分子标记, 以区分不同类型的鼻窦肿瘤。

引言

otxhb 基因是果蝇正畸基因 (otd) 的脊椎动物同源体, 它们编码了通常在胚胎形态发生过程中表达的转录因子, 但它们也可以在具有不同功能的成虫体内表达.在胚胎发育过程中, 它们控制着细胞的特性、细胞分化和身体轴的定位。otx家族包括显示不同功能的 otx1和otx2基因。otx1参与大脑和感觉器官的发育。在成虫体内, 它在感觉器官中表达, 并在垂体2的前叶中在低水平转录;它在造血中也有一定的作用, 表达于造血多能和祖细胞³。otx2参与了根头的发育, 它的转化蛋白起到了语素的作用, 因为它产生了一个梯度, 通过梯度激活或抑制其他基因以时空的方式被激活或抑制, 从而对细胞做出贡献增殖和分化。在成虫体内, otx2 只存在于脉络丛和松果体⁴中。

otx基因的突变通常与人类先天、身体或代谢缺陷的出现有关。otx基因的得失突变如果不能正确控制细胞生长和分化, 就会促进肿瘤的发生.在白血病和淋巴瘤以及许多实体瘤 (例如,髓母细胞^{瘤 6}、攻击性非霍奇金淋巴瘤²、乳腺癌⁷、结直肠癌8和视网膜母细胞^{瘤 9}),otx hb 基因的放松表达有据可查^{的 10}。此外, 由于 otx2 基因在控制眼睛发育方面的关键作用, 在眼邻症和微孔瘤11的病例中已经显示出otx2突变。

在固体肿瘤的背景下, 分子和表型标记的发现是诊断、分类和治疗几种类型的肿瘤11的一个重要挑战, 包括那些源于鼻腔和鼻窦的肿瘤鼻窦。事实上, 尽管这些区域只占一个适度的解剖空间, 粘膜上皮, 腺体, 软组织, 骨骼, 软骨或神经外皮, 和造血细胞往往可以是复杂和组织学不同的起源的网站组的肿瘤。涉及窦冬道的不同类型的肿瘤呈现了各种特征, 克服了通常在上空气消化道甚至在身体大部分部位^看到的特征12。鼻窦恶性肿瘤是罕见的, 每年的发病率为全世界1:10000 居民, 因此, 这妨碍了有关肿瘤发生的途径的研究和替代治疗策略的测试。尽管如此, 成像技术、手术方法和放射治疗的进步改善了鼻窦癌的临床管理。此外, 细胞系的发展以及动物模型和癌症基因分析目前构成了未来有针对性的抗癌疗法¹³的基础。到目前为止, 还没有关于otx1和/或otx2在鼻腔肿瘤、鼻窦和鼻咽的报告。由于我们之前观察到otx1和otx2 参与了乳腺癌⁷, 我们想知道这些基因是否不仅存在于正常的鼻黏膜中, 也存在于鼻腔肿瘤中。为了达到这一目标, 我们从病理学系获得了1985年至2012年收集并根据世界卫生组织 (世卫组织) 分类的正常黏膜、鼻和鼻窦腺癌的 varese 样本中的 "osedale di circolo"头颈部肿瘤的分类。我们选择通过实时 pcr 和免疫组织化学分析对它们进行分析, 并评估otx1和otx2的表达, 以确定它们是否可以被视为这些类型肿瘤的分子标记。

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研究方案

所有这些研究都是根据《赫尔辛基宣言》 (1975年) 在书面知情同意的情况下进行的, 并得到了瓦雷塞的因苏里亚邦大学道德委员会的批准。

1. 样品的收集

1. 根据世卫组织对头颈部肿瘤的分类, 收集和将所有人类福尔马林固定石蜡包埋物 (ffpe) 样本^分成不同的亚群。
   请注意:在这里, 我们使用了以下样品: 正常的鼻窦黏膜作为对照 (10个样品);倒置状瘤 ( ip , icd - o 代码 812 / 1 ) ;sinonasal itac (icd-o 代码 814n", 32个样本);nitac (icd-o 代码 8140", 12个示例);腺样体囊性癌 (acc, icd-o 代码 8200);多形性腺瘤 (pa, icd-o 代码 8945%);on (icd-o 代码 9522 +, 13个示例);分化不良的神经内分泌癌 (pdnec, icd-o 代码 804培养基, 19个样本);神经内分泌肿瘤 (net, icd-o 代码 804-5)。

2. 免疫化学

1. 部分的去黑塞哥维那和补液
   1. 将样品在60°c 的烤箱中加热 30分钟, 并使用酒精系列将3微米厚的 ffpe 部分再加提水。
   2. 在二甲苯中简单清洗滑块 10分钟, 然后重复此步骤;用100% 酒精清洗幻灯片 5分钟, 并连续使用95%、85% 和75% 的酒精重复此步骤。用蒸馏水冲洗滑梯5分钟。
2. 阻止内生活动
   1. 将滑块放入3% 的过氧化氢水中 12分钟, 阻断内源性活动。
3. 抗原回收
   1. 在微波治疗中, 用 10 mm 柠檬酸缓冲器 (ph 6) 进行10分钟的抗原回收。
4. 与原代抗体的培养
   1. 清洗 tbs 缓冲液中的切片 (ph 值 7.4), 然后加入阻塞溶液10分钟。
   2. 清洗 tbs 缓冲液中的切片 (ph 值 7.4), 然后加入0.2% 的 triton x。
   3. 用山羊抗人 otx2 抗体稀释1:100 在4°c 下过夜。
5. 用二级抗体进行培养
   1. 用生物素化兔抗山羊二级抗体稀释 1:200, 然后是 abc-过氧化物酶复合物 (见材料表), 在室温下将切片加氢1小时。
6. 开发免疫反应
   1. 利用 3, 3 '-二胺苯胺四盐酸盐和哈里斯血红素对抗核的免疫反应。
7. 安装和成像
   1. 使用新月醇刻度使切片脱水, 并使用三烯来源的清除物质对其进行澄清 (见材料表)。将切片嵌入安装介质中, 将切片放置在显微镜幻灯片上, 并通过光学显微镜观察切片。

3. rna 提取和反向转录

1. rna 提取
   1. 通过执行免疫沉淀协议的第一步 (见第2.1 节), 从各部分中提取 rna, 并将幻灯片保存在蒸馏水中。将未染色的部分与相应的血红素-eosin 染色部分重叠, 以识别感兴趣的片段。
   2. 使用 ffpe 样品的商业 rna 提取试剂盒 (参见材料表) 并按照制造商的说明进行 rna 提取。
2. rna 逆转录酶
   1. 使用商业试剂盒将 rna 逆转录酶追溯到 cdna 中 (见材料表)。逆转录酶至少 1, 000 纳克的总 rna 进行了几项分析。

4. 实时 pcr 和数据分析

1. 实时 pcr
   1. 使用基于原的技术 (见材料表) 和热循环器进行定量实时 pcr 分析 (qrt-pcr)。
2. pcr 反应混合物的制备
   1. 使用12.5 μl 的探针主混合物、0.25μl 的 otx1、otx2 和 actb 探针 (见材料表)、50 ng 的 cdna 和高达最大为最大体积25μl 的无核酸水制备 pcr 反应混合物。
   2. 利用 actb 基因作为内源性对照, 进行三式三份的所有反应, 使基因表达水平正常化。
   3. 将板材以 1, 109 x克离心 3分钟, 并将板保存在4°c 时不受光线照射, 直到实验结束。
3. 设置热循环器
   1. 将热循环曲线设置为在50°c 下的初始热启动周期为 2分钟, 95°c 为 10分钟, 然后在95°c 下进行40次循环, 在15秒内, 最终循环在60°c 下, 以1分钟。
4. 基因表达水平分析
   1. 利用 actb 基因作为内源对照, 通过比较周期阈值 (ct) 方法对基因表达水平进行归一化。
   2. 利用^2-ct方法评估基因表达水平, 并绘制结果图。
5. 统计分析
   1. 使用学生t-测试进行统计分析, 考虑到有统计学意义的结果和p < 0.05。

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结果

在正常粘膜中, 我们观察到 otx 基因的强核反应性, 无论是在纤毛假分层型呼吸上皮和粘膜下腺体细胞 (图 1a)。我们在所有 nitac 样本中都发现了 otx1 的核表达 (图 1 b), 而在 itac 中, 免疫反应很少或不存在 (图 1B)。所有的只能存在强烈的免疫反应性 (图 1d);在 pdnec 中, otx 表达在阳性细胞?...

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讨论

本研究首次表明 , 根据 mrna 水平 , hb 基因 otx1 和 otx2 在正常鼻窦黏膜和粘膜下腺体、炎症息肉、鼻窦施奈德里安状瘤以及不同的上皮和神经外皮中表达肿瘤, 包括鳞状癌、非肠型鼻窦腺癌、唾液腺型肿瘤、神经内分泌肿瘤和国家统计局。

修改和故障排除:

为了避免 rna 降解, 我们在病理学实验室执行了分离协议。在我们划破滑梯后, 所有的样品都被迅速冷却并...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation	Applied Biosystem	AM1975
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystem	4368814
TaqMan Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG	Applied Biosystem	4326614
ABI Prism 7000	Applied Biosystem	270001857
ACTB probe	Applied Biosystem		Out of production. Sequence protected by copyright
OTX1 probe	Applied Biosystem		Out of production. Sequence protected by copyright
OTX2 probe	Applied Biosystem		Out of production. Sequence protected by copyright
Acqueous Hydrogen Peroxide	Merk	1072090250
Citrate Buffer	Sigma-Aldrich	20276292
Triton	Sigma-Aldrich	101473728
Tris	Merk	108382
NaCl	Merk	106404
Goat Anti-OTX2 Antibody	Vector Laboratories		Out of production. Catalog number not available
Rabbit Anti-Goat Antibody	Vector Laboratories	BA5000
ABC-Peroxidase Complex	Vector Laboratories	PK6100
3,3'-diaminobenzidine tetrahydrocloride (DAB)	Sigma-Aldrich	D5905
Harris Hematoxylin	Bioptica	0506004/L
Pertek	Kaltek SRL	1560
BioClear	Bioptica	W01030799