Определение OTX1 и OTX2 как два возможных молекулярных маркеров для карциномы придаточных пазух носа и обонятельные нейробластомы

Резюме

Гомеобокс, регуляторных генов часто ассоциируется с опухолями в взрослых организмов. Мы исследовали их сравнительного выражения иммуногистохимических и анализ в реальном времени PCR, в нормальных и воспалительных носовой mucosae и придаточных пазух носа новообразования для того, чтобы использовать их в качестве возможных диагностических и терапевтических целей.

Аннотация

OTX (HB) гомеобокс выражаются во время эмбрионального морфогенеза и в ходе разработки обонятельного эпителия в взрослых организмов. Мутации, происходящие в этих генах часто связаны с tumorigenesis в человека. Данные не доступны сегодня относительно возможной корреляции между OTX генами и опухоли полости носа. Цель этой работы – понять, если OTX1 и OTX2 можно рассматривать как молекулярных маркеров в развитии Носовые опухоли. Мы выбрали носа и придаточных пазух носа аденокарциномы расследовать выражение генов OTX1 и OTX2 через иммуногистохимических и реальном времени ПЦР анализа. OTX1 и OTX2 были отсутствующими во всех пробах придаточных пазух носа аденокарциномы кишечной-типа (ITACs). Только в номера-кишечного типа аденокарциномы (NITACs) было выявлено OTX1 мРНК, пока только в обонятельные нейробластомы (УНС) была выражена OTX2 мРНК. Мы продемонстрировали, что дифференциального ген выражение для OTX1 и OTX2 генов может быть полезным молекулярных маркеров различать различные виды опухолей придаточных пазух носа.

Введение

OTX HB гены позвоночных гомолог Drosophila orthodenticle генов (ОДТ) и они кодировать транскрипционных факторов, которые обычно выражаются в ходе эмбрионального морфогенеза, но они также могут быть выражены в взрослого организма с различными функциями . Во время эмбрионального развития они контролируют спецификации клеток идентичности, дифференцировки клеток и позиционирования тела axis¹. Семейство OTX включает в себя OTX1 и OTX2 генов, которые отображают различные функции. OTX1 участвует в мозг и сензорный орган развития. Во взрослом организме он выражается в органы чувств и транскрибируется на низком уровне в передней доле гипофиза²; Она также играет роль в кроветворения, выраженные в кроветворных плюрипотентных и прогениторных клеток³. OTX2 участвует в развитии ростральной головы и его перевод белок действует как morphogen потому что он создает градиент через какие гены активирован или репрессированных в пространственно временных манере, тем самым способствуя ячейки пролиферации и дифференцировки. Во взрослом организме OTX2 находится исключительно в сосудистое сплетение и шишковидной железы⁴.

Мутации в генах OTX часто связаны с появление человека врожденной, соматического или метаболических дефектов. Прибыль или убыток мутаций в генах OTX могло бы способствовать tumorigenesis, если они не в состоянии должным образом контролировать клеточного роста и/или дифференциация⁵. В лейкозов и лимфом также, как и многих солидных опухолей (например, Медуллобластомы⁶, агрессивных non лимфомы Hodgkin², карциномы груди⁷, колоректального рака⁸и ретинобластома⁹) дерегулирование экспрессии генов OTX HB-хорошо документированы¹⁰. Кроме того OTX2 перегласовок были продемонстрированы в случаях¹¹ анофтальмия и microphtalmia из-за ключевую роль для этого гена в элементе управления развития глаз.

В контексте твердых опухолей Открытие молекулярной и фенотипические маркеры является важной задачей для диагностики, классификации и обращения нескольких видов опухоль¹¹, включая те, которые происходят в полости носа и околоносовых придаточных пазух носа. В самом деле несмотря на что эти районы занимают только скромный анатомические пространства, эпителия слизистых оболочек, желез, мягких тканей, костей, хряща или нейронных/нейроэктодермальная, и hematolymphoid клетки могут быть часто сайт для происхождения сложных и гистологически различных группы опухолей. Различные типы опухолей с участием урочище придаточных пазух носа представляют различные функции, которые позволяют преодолеть то, что обычно рассматривается в верхнем aerodigestive тракта или даже на протяжении большей части тела¹². Придаточных пазух носа злокачественных новообразований являются редкими и представить годовой заболеваемости картирование жителей во всем мире, и поэтому это предотвращает исследования относительно пути, участвующие в tumorigenesis и тестирование стратегий альтернативного лечения. Несмотря на это, прогресс в imaging технологии, хирургическими методами и радиотерапии улучшили клинического управления придаточных пазух носа рака. Кроме того развитие клеточных линий, а также Животные модели и генетического профилирования рака в настоящее время составляют основу для будущей целевой противоопухолевой терапии¹³. На сегодняшний день, есть никаких сообщений о OTX1 или OTX2 выражение в новообразований полости носа, околоносовых пазух и носоглотки. Поскольку ранее мы заметили, что OTX1 и OTX2 участвуют в груди Рак⁷, мы думали, если эти гены могут присутствовать не только в нормальной слизистой оболочки носа, но и в опухоли полости носа. Для достижения этой цели, которую мы получили от Департамента патологии «Ospedale di Circolo» в Варезе образцов и нормальной слизистой оболочки носа и придаточных пазух носа аденокарциномы собраны от 1985 до 2012 и классифицированы согласно Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) Классификация опухолей шеи и головы. Мы решили их анализировать с помощью реального времени анализ ПЦР и иммуногистохимии и мы оценивали OTX1 и OTX2 выражением, чтобы определить, если они могут считаться молекулярных маркеров для этих типов опухолей.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все исследования были проведены, согласно Декларации о Хельсинки (1975) с письменного информированного согласия и утверждены Этический Комитет университета Инсубрия в Варезе.

1. сбор образцов

1. Собирать и разделить различные подгруппы согласно классификации ВОЗ¹⁴головы и шеи опухоли всех человеческих образцов Formalin-Fixed Paraffin-Embedded (FFPE).
   Примечание: Здесь мы использовали следующие образцы: нормальный придаточных пазух носа слизистая оболочка как управления (10 образцов); Перевернутый папилломы (IP, код МКБ-O 8121/1); КППО придаточных пазух носа (ICD-O код 8144/3, 32 образцы); NITAC (12 образцов кода 8140/3, МКБ-O); Лимфоидной кистозный рак (АКК, код МКБ-O 8200/3); Плеоморфные аденомы (ПА, код МКБ-O 8941/3); НА (13 образцов кода 9522/3, МКБ-O); Слабо дифференцированной нейроэндокринной карцинома (PDNEC, МКБ-O кода 8041/3, 19 образцов); Нейроэндокринные опухоли (нетто, МКБ-O кода 8041/3).

2. Иммунохимия

1. Депарафинизации и регидратации секций
   1. Тепла образца слайдов в духовке при 60 ° C в течение 30 мин и увлажняет 3 µm толщиной FFPE секции с помощью алкоголя серии к воде.
   2. Кратко мыть слайды в ксилоле на 10 минут и повторите этот шаг; Вымойте слайды для 5 мин в 100% алкоголя и повторите этот шаг, серийно с использованием 95%, 85% и 75% алкоголя. Промойте слайды для 5 мин в дистиллированной воде.
2. Блокируя действие эндогенных
   1. Блокировать действие эндогенного, поместив слайды в 3% водного раствора пероксида водорода для 12 мин.
3. Антиген поиска
   1. Выполните поиск антигена с 10 мм цитрат буфере (рН 6) для 10 мин в СВЧ обработка.
4. Инкубация с основного антитела
   1. Мыть в подразделах TBS буфере (рН 7,4), а затем добавить блокировки решение для 10 мин.
   2. Мыть в подразделах TBS буфере (рН 7,4), а затем добавить 0,2% Тритон X.
   3. Инкубируйте на ночь при 4 ° C с OTX2 антитела разбавленный коза античеловеческие масштаба 1: 100.
5. Инкубация с вторичного антитела
   1. Инкубировать в разделах 1 ч при комнатной температуре с 1: биотинилированным кролик вторичного антитела анти коза разводят 200 следуют комплекс ABC-пероксидаза (см. Таблицы материалы).
6. Разработка immunoreaction
   1. Разработка с использованием 3, 3'-диаминобензидин tetrahydrochloride immunoreaction и counterstain ядер с Харрис гематоксилином.
7. Монтаж и обработка изображений
   1. Обезвоживает разделы, используя Полумесяца алкоголя шкалы и уточнить их с помощью очистки вещество терпеновые происхождения (см. Таблицу материалы). Внедрить секций в среде монтажа, Место разделы на микроскопа и наблюдать разделы через оптический микроскоп.

3. РНК добыча и реверс транскрипция

1. Извлечение RNA
   1. Извлечь РНК из разделов, выполняя первый шаг иммунопреципитации протокола (см. раздел 2.1) и хранить слайды в дистиллированной воде. Перекрытие неокрашенных разделы с соответствующими гематоксилином эозином, окрашенных разделы для того, чтобы определить фрагменты интерес.
   2. Выполните извлечение RNA, с использованием коммерческих РНК добыча комплект для FFPE образцов (см. Таблицу материалы) и следующими инструкциями.
2. Реверс транскрипции РНК
   1. Использование коммерческого набора для ретро транскрибировать РНК в cDNA (см. Таблицу материалы) после протокол. Ретро записать по крайней мере 1000 нг всего РНК для выполнения несколько анализов.

4. в реальном масштабе времени PCR и анализ данных

1. ПЦР в реальном времени
   1. Анализ количественных реального времени PCR (qRT ПЦР) с технологией на основе выборки (см. Таблицу материалы) и тепловая велосипедист.
2. Подготовка смеси реакции PCR
   1. Подготовьте смесь реакции PCR, используя 12,5 мкл мастер смесь на основе зонд, 1,25 мкл OTX1, OTX2 и ACTB зонды (см. Таблицу материалы), 50 нг cDNA и свободной от нуклеиназы воды до 25 мкл общего объема.
   2. Выполните все реакции в трех экземплярах, с использованием ACTB ген как внутреннего управления для нормализации уровни выражения гена.
   3. Центрифуга пластину на 1 109 g x 3 мин и хранить пластину, защищенном от света на 4 ° C до эксперимента.
3. Установка тепловой циклователь
   1. Набор, тепловая велосипедист профиль с первоначального горячий старт цикла при 50 ° C на 2 мин и 95 ° C в течение 10 мин, следуют 40 циклов при 95 ° C 15 s и окончательный цикл при 60 ° C за 1 мин.
4. Анализ уровня выражение гена
   1. Нормализуют уровни выражения гена через метод сравнительного цикла порог (ΔCt), с использованием ACTB ген как внутреннего управления.
   2. Оценивать уровни выражения гена, с помощью метода 2^-ΔCt и печати результатов.
5. Статистический анализ
   1. Проводить статистический анализ с использованием студента t-теста, учитывая статистически значимые результаты с p < 0,05.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

В нормальной слизистой наблюдается сильный и однородной ядерной реактивности генов OTX мерцательного эпителия псевдомногослойный дыхания типа и в подслизистую железистые клетки (рис. 1A). Мы нашли, что ядерные выражение для OTX1 во всех пробах NITACs, (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Это исследование показывает в первый раз, что, основываясь на уровни mRNA, HB генов OTX1 и OTX2 выражаются в нормальной придаточных пазух носа слизистая и подслизистую желез, воспалительные полипы, придаточных пазух носа Schneiderian папиллом и в различных эпителиальных и нейроэктодермальная новоо...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation	Applied Biosystem	AM1975
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystem	4368814
TaqMan Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG	Applied Biosystem	4326614
ABI Prism 7000	Applied Biosystem	270001857
ACTB probe	Applied Biosystem		Out of production. Sequence protected by copyright
OTX1 probe	Applied Biosystem		Out of production. Sequence protected by copyright
OTX2 probe	Applied Biosystem		Out of production. Sequence protected by copyright
Acqueous Hydrogen Peroxide	Merk	1072090250
Citrate Buffer	Sigma-Aldrich	20276292
Triton	Sigma-Aldrich	101473728
Tris	Merk	108382
NaCl	Merk	106404
Goat Anti-OTX2 Antibody	Vector Laboratories		Out of production. Catalog number not available
Rabbit Anti-Goat Antibody	Vector Laboratories	BA5000
ABC-Peroxidase Complex	Vector Laboratories	PK6100
3,3'-diaminobenzidine tetrahydrocloride (DAB)	Sigma-Aldrich	D5905
Harris Hematoxylin	Bioptica	0506004/L
Pertek	Kaltek SRL	1560
BioClear	Bioptica	W01030799