Sinonasal Carcinomas과 후 각 Neuroblastomas에 대 한 두 가지 가능한 분자 마커로 OTX1 OTX2의 식별

요약

Homeobox 유전자는 종종 종양 성인 유기 체와 관련 된 규제 유전자. 우리 immunohistochemical와 실시간 PCR 분석, 정상 및 염증 코 거칠어 고 가능한 진단 및 치료 대상으로 그들을 사용 하려면 sinonasal 신생 그들의 비교 식을 조사.

초록

OTX homeobox (HB) 유전자는 배아 morphogenesis 그리고 성인 유기 체에 있는 후 각 상피의 개발에 표현 됩니다. 이 유전자에서 발생 하는 돌연변이 종종 인간의 tumorigenesis 관련이 있습니다. 데이터가는 OTX 유전자와 비 강 종양 간의 가능한 상관 관계에 관한 오늘 사용할 수 있습니다. 이 작품의 목적은 경우 OTX1 및 OTX2 분자 마커 비 강 종양의 개발에서로 간주 될 수 있습니다 이해 하는 것입니다. 우리가 선택한 immunohistochemical 및 실시간 PCR 분석 통해 OTX1 및 OTX2 유전자의 표정을 조사 하 강과 sinonasal adenocarcinomas. 모두 OTX1 OTX2 했다 결 석 sinonasal Intestinal 형 Adenocarcinomas (ITACs)의 모든 샘플에서. OTX1 mRNA OTX2 mRNA 후 각 Neuroblastomas (기능)에 표현 하는 동안 비 장 유형 Adenocarcinomas (NITACs)에 확인 되었다. 우리 OTX1 와 OTX2 유전자에 대 한 차동 유전자 발현 sinonasal 종양의 종류를 구별 하는 유용한 분자 마커 수 있습니다 설명 했다.

서문

OTX HB 유전자 초파리 orthodenticle 유전자 (otd)의 척추 homologue 그리고 그들은 일반적으로 배아 morphogenesis 동안 표현 녹음 방송 요인에 대 한 인코딩 하지만 그들은 또한 다른 기능을 가진 성인 유기 체에 표현 될 수 있습니다. . 배아 개발 하는 동안 그들은 셀 정체성, 세포 분화, 및 몸 axis¹의 위치 지정을 제어 합니다. OTX 가족 포함 OTX1 와 OTX2 유전자는 서로 다른 기능을 표시 합니다. OTX1 두뇌와 감각 기관이 개발에 참여 하고있다. 성인 유기 체에서 그것은 감각 기관에서 표현 되며 뇌²;의 앞쪽 엽의 낮은 수준에서 복사했습니다 그것은 또한 조, 만능 조 혈 및 조상 세포³에 표현 되 고 있는 역할을 하고있다. OTX2 rostral 머리의 개발에 참여 하 고는 morphogen로 그것의 번역된 단백질 행위는 다른 유전자를 통해 그라데이션 생성 하기 때문에 활성화 또는 따라서 셀에 기여 spatio 시간적 방식 억압 확산 그리고 감 별 법입니다. 성인 유기 체에서 OTX2 맥락 막 신경 총 및 송과선⁴에서 독점적으로 발견 된다.

종종 OTX 유전자에 있는 돌연변이 인간의 선 천 적, 체세포, 또는 신진 대사 결함의 모양을 관련이 있습니다. 이득 또는 손실 OTX 유전자에 있는 돌연변이 세포 성장 및 분화⁵를 제대로 제어할 수 없는 경우 tumorigenesis 홍보 수 있습니다. Leukemias과 lymphomas 또한 많은 고체 종양 (예를 들어, medulloblastomas⁶, 적극적인 비 Hodgkin 림프 종², 유 방 carcinomas⁷, 대 장 암⁸및 retinoblastoma⁹)로 규제 완화 표현의 OTX HB 유전자는 잘 문서화 되어¹⁰입니다. 또한, OTX2 돌연변이 눈 개발의 컨트롤에이 유전자에 대 한 중요 한 역할 때문에 anophthalmia와 microphtalmia¹¹ 의 경우에 증명 했습니다.

단단한 신생에서 분자 및 phenotypic 마커의 발견은 진단, 분류, 그리고 종양¹¹, 비 강 및 코에를 포함 하 여 여러 종류의 치료에 대 한 중요 한 도전 sinuses입니다. 사실, 그럼에도 불구 하 고이 지역을 차지할만 겸손 해 부 공간, 점 막 상피, 샘, 부드러운 조직, 뼈, 연골 또는 신경/neuroectodermal, 및 hematolymphoid 세포는 종종 복잡 하 고 다른 조직학의 기원에 대 한 사이트가 될 수 있습니다. 종양의 그룹입니다. 신생 sinonasal로 관련 된 다른 유형의 다양 한 기능 위 aerodigestive로 또는 본문¹²의 대부분의 부품에 걸쳐도 본 것 일반적으로 극복을 제시. Sinonasal 악성 드물다 전세계 1:100,000 주민의 연간 발생률을 제시 하 고 그래서이 방지는 tumorigenesis와 대체 치료 전략의 테스트에 관련 된 경로 관한 연구. 그럼에도 불구 하 고, 영상 기법, 진보 수술 방법과 방사선 치료 sinonasal 암의 임상 관리를 개선 했습니다. 또한, 셀 라인으로 동물 모델 및 암 유전자 프로 파일링의 개발 현재¹³미래 표적으로 한 항 암 치료 대 한 기초를 구성 한다. 날짜 하려면, 비 강, paranasal sinuses과 nasopharynx의 신생에 OTX1 또는 OTX2 식에 관한 보고 있다. 이후 우리가 이전 OTX1 와 OTX2 유 방 암⁷에 참여 관찰, 우리가이 유전자는 정상적인 비 강 점 막 뿐만 아니라 비 강에 종양에 존재 수 궁금해. 우리는 "스타지오네 디 Circolo" 바레 세 샘플에 정상적인 점 막, 그리고 2012 년 1985에서 수집 하 고 분류 하는 세계 보건 기구 (WHO)에 따르면 코와 sinonasal adenocarcinomas의의 병 리 학과에서 얻은이 목표에 도달 하 머리와 목 종양의 분류입니다. 우리 실시간 PCR 및 immunohistochemistry 분석을 통해 분석을 선택 하 고 우리가 만약 그들이 이러한 유형의 종양에 대 한 분자 마커 간주 될 수 있습니다 확인 하려면 OTX1 및 OTX2 식 평가.

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프로토콜

모든 연구 동의 서 면 및 바레 세에서 Insubria의 대학 윤리 위원회에 의해 승인와 (1975) 헬싱키의 선언에 따르면 수행 했다.

1입니다. 샘플의 수집

1. 수집 하 고 모든 인간 Formalin-Fixed Paraffin-Embedded (FFPE) 샘플¹⁴머리와 목 종양의 WHO 분류에 따라 서로 다른 하위 그룹으로 나눕니다.
   참고: 여기 우리는 다음 예제 사용: 일반 sinonasal 점 제어 (10 샘플); 거꾸로 유 두 종 (IP, ICD O 코드 8121/1); Sinonasal 그것 (ICD O 코드 8144/3, 32 샘플); NITAC (ICD O 코드 8140/3, 12 샘플); Adenoid 낭 성 암 (ACC, ICD O 코드 8200/3); Pleomorphic Adenoma (PA, ICD O 코드 8941/3); (ICD O 코드 9522/3, 13 샘플); 가난 하 게 분화 신경 내 분 비 암 종 (PDNEC, ICD O 코드 8041/3, 19 샘플); 신경 내 분 비 종양 (NET, ICD O 코드 8041/3).

2입니다. immunochemistry

1. Deparaffinization 및 리하이드레이션 섹션의
   1. 30 분 동안 60 ° C에 오븐에 있는 샘플 슬라이드를 열 고 3 µ m 두께 FFPE 사용 하 여 섹션 물 알코올 시리즈를 rehydrate.
   2. 간단히 10 분 동안 크 실 렌에 슬라이드를 세척 하 고 반복이 단계; 100% 술에 5 분에 대 한 슬라이드를 세척 하 고 직렬로 95%, 85%, 및 75% 알코올을 사용 하 여이 단계를 반복. 증류수에 5 분에 대 한 슬라이드를 씻어.
2. 생 활동 차단
   1. 12 분 동안 3% 수성 수소 과산화물에 슬라이드를 삽입 하 여 내 인 성 활동을 차단 합니다.
3. 항 원 복구
   1. 10 m m 구 연산 염 버퍼 (pH 6) 치료를 전자 레인지에 10 분 동안 치료 하 여 항 원 복구를 수행 합니다.
4. 1 차적인 항 체를 가진 외피
   1. TBS 버퍼 (pH 7.4)에 섹션을 씻어 다음 10 분 동안 차단 솔루션을 추가 합니다.
   2. TBS 버퍼 (pH 7.4)에 섹션을 씻어 다음 0.2% 트리톤 X를 추가 합니다.
   3. 염소 안티 인간 OTX2 항 체 희석 1: 100으로 4 ° C에서 밤새 품 어.
5. 이차 항 체를 가진 외피
   1. ABC-과산화 효소 복잡 한 뒤에 biotinylated 토끼 반대로 염소 이차 항 체 희석 1: 200으로 실 온에서 1 h에 대 한 섹션을 품 어 ( 테이블의 자료를 참조).
6. immunoreaction 개발
   1. 3, 3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride를 사용 하 여 immunoreaction를 개발 하 고 해리스 Hematoxylin와 핵을 counterstain.
7. 장착 및 이미징
   1. 초승달 알코올 규모를 사용 하 여 섹션을 탈수 하 고 명확히 terpene 근원의 개간 물질을 사용 하 여 ( 재료의 표참조). 설치 중간에 섹션을 포함, 섹션 현미경 슬라이드에 놓고 광학 현미경을 통해 섹션을 관찰 합니다.

3. RNA 추출 및 역-전사

1. RNA 추출
   1. Immunoprecipitation 프로토콜 (참조 섹션 2.1)의 첫 번째 단계를 수행 하 여 섹션에서 RNA를 추출 하 고 증류수에 슬라이드를 유지 합니다. 해당 되며 오신 관심의 조각 식별 섹션 스테인드과 흠 없는 섹션을 겹칩니다.
   2. RNA 추출 FFPE 샘플 ( 재료의 표참조) 및 다음 제조업체의 지침에 대 한 상업적인 RNA 추출 키트를 사용 하 여 수행 합니다.
2. RNA 리버스-전사
   1. 상업 키트를 사용 하 여 cDNA로 RNA 복고풍 녹음 ( 재료의 표참조) 다음 프로토콜. 여러 가지 분석을 수행 하기 위해 총 RNA의 레트로 녹음 적어도 1000 ng

4. 실시간 PCR 및 데이터 분석

1. 실시간 PCR
   1. 프로브 기반 기술로 양적 실시간 PCR 분석 (qRT-PCR) 수행 ( 재료의 표참조) 및 열 cycler.
2. PCR 반응 혼합의 준비
   1. 프로브 기반 마스터 믹스의 12.5 µ L를 사용 하 여 PCR 반응 혼합 준비, 1.25 µ L 각 OTX1, OTX2, 및 ACTB의 프로브 ( 재료의 표참조), 50 ng cDNA, 그리고 nuclease 무료 물 총 볼륨의 최대 25 µ L.
   2. 3 중 유전자 표현 레벨을 정상화 하 생 컨트롤로 ACTB 유전자를 사용 하 여 모든 반응을 수행 합니다.
   3. 1109 x g 3 분에 격판덮개 원심 고 실험까지 4 ° C에서 빛에서 보호 하는 접시를 저장.
3. 열 cycler 설정
   1. 설정 열 cycler 프로필 초기 뜨거운 시작 2 분 및 10 분 동안 95 ° C 50 ° C에서 사이클 15 95 ° C에서 40 주기 다음 s와 1 분 동안 60 ° C에서 최종 주기.
4. 진 식 수준 분석
   1. 생 제어 ACTB 유전자를 사용 하 여 비교 주기 임계값 (ΔCt) 메서드를 통해 유전자 표현 레벨을 정상화.
   2. 2^-ΔCt 메서드를 사용 하 여 유전자 식 레벨을 평가 하 고 결과 플롯.
5. 통계 분석
   1. 학생의 t를 사용 하 여 통계 분석을 수행- p < 0.05를 통계적으로 유의 한 결과 고려 하 고 테스트.

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결과

정상 점 막에서 OTX 유전자 ciliated pseudostratified 형 호흡 상피와 submucosal 선 세포 (그림 1A)에 대 한 강력 하 고 동종 핵 반응을 관찰합니다. 우리는 모든 NITACs 샘플에 (그림 1B), 작은 동안 또는 immunoreactivity 결 석 OTX1 핵 식을 ITACs (그림 1C)에서 강조 했다 발견. 강렬한 immunoreactivity는 모든 기능 (?...

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토론

이 연구는, mRNA 수준에 따라 처음으로 보여줍니다 OTX1 및 OTX2 HB 유전자가 정상적인 sinonasal 점 막과 submucosal 선, 염증 성 폴립, sinonasal Schneiderian 갑, 그리고 다른 표현 상피와 neuroectodermal 신생, 편평 carcinomas, 비-장의 유형 sinonasal adenocarcinomas, 침 샘 타입 종양, 신경 내 분 비 신생 및 기능을 포함 하 여

수정 및 문제 해결:

RNA 저하를 방지 하려면 우리 병 리의 실?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation	Applied Biosystem	AM1975
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystem	4368814
TaqMan Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG	Applied Biosystem	4326614
ABI Prism 7000	Applied Biosystem	270001857
ACTB probe	Applied Biosystem		Out of production. Sequence protected by copyright
OTX1 probe	Applied Biosystem		Out of production. Sequence protected by copyright
OTX2 probe	Applied Biosystem		Out of production. Sequence protected by copyright
Acqueous Hydrogen Peroxide	Merk	1072090250
Citrate Buffer	Sigma-Aldrich	20276292
Triton	Sigma-Aldrich	101473728
Tris	Merk	108382
NaCl	Merk	106404
Goat Anti-OTX2 Antibody	Vector Laboratories		Out of production. Catalog number not available
Rabbit Anti-Goat Antibody	Vector Laboratories	BA5000
ABC-Peroxidase Complex	Vector Laboratories	PK6100
3,3'-diaminobenzidine tetrahydrocloride (DAB)	Sigma-Aldrich	D5905
Harris Hematoxylin	Bioptica	0506004/L
Pertek	Kaltek SRL	1560
BioClear	Bioptica	W01030799