Identifikation von OTX1 und OTX2 als zwei mögliche molekulare Marker für sinunasalen Karzinome und olfaktorischen Neuroblastome

Zusammenfassung

Homeobox Gene sind regulatorische Gene, die oft im Zusammenhang mit Tumoren in den Erwachsenen Organismen. Wir untersuchen ihre vergleichende Ausdruck durch immunhistochemische und Echtzeit-PCR-Analyse, in normalen und entzündlichen nasale Schleimhäute und sinunasalen Neoplasmen um sie als mögliche diagnostische und therapeutische Ziele zu verwenden.

Zusammenfassung

OTX (HB) Homeobox Gene werden während der embryonalen Morphogenese und bei der Entwicklung des olfaktorischen Epithel im erwachsenen Organismus exprimiert. Mutationen in diesen Genen auftreten beziehen sich oft auf Tumorgenese beim Menschen. Über die mögliche Korrelation zwischen OTX Gene und Tumoren der Nasenhöhle sind keine Daten verfügbar heute. Das Ziel dieser Arbeit ist es zu verstehen, wenn OTX1 und OTX2 als molekulare Marker in der Entwicklung der nasalen Tumoren angesehen werden kann. Wir haben Nasal und sinunasalen Adenokarzinome, die Expression von OTX1 und OTX2 Genen durch immunhistochemische und Echtzeit-PCR-Analysen zu untersuchen. OTX1 und OTX2 fehlten in den Proben der sinunasalen Darm-Typ Adenokarzinome (ITACs). OTX1 -mRNA wurde nur in Non-intestinalen Typ Adenokarzinome (NITACs) identifiziert, während OTX2 mRNA nur in olfaktorische Neuroblastome (ONs) zum Ausdruck kam. Wir haben bewiesen, dass die differenzielle Genexpression für OTX1 und OTX2 Gene möglicherweise nützliche molekulare Marker, die verschiedenen Arten von sinunasalen Tumoren zu unterscheiden.

Einleitung

OTX HB-Gene sind die Landwirbeltiere homolog der Drosophila Orthodenticle Gene (Otd) und sie codieren für Transkriptionsfaktoren, die normalerweise während der embryonalen Morphogenese ausgedrückt werden, aber sie können auch im erwachsenen Organismus mit unterschiedlichen Funktionen ausgedrückt werden . Während der Embryonalentwicklung steuern sie die Spezifikation der Zelle Identität, Zelldifferenzierung und die Positionierung des Körpers axis¹. Die OTX -Familie umfasst OTX1 und OTX2 Gene, die verschiedene Funktionen angezeigt. OTX1 ist im Gehirn und Sinnesorgan Entwicklung beteiligt. Im erwachsenen Organismus es drückt sich in Sinnesorganen und ist auf einem niedrigen Niveau in der vorderen Lappen von der Hypophyse (Hirnanhangdrüse)²transkribiert; Es spielt auch eine Rolle in der Hämatopoese, ausgedrückt in hämatopoetischen pluripotenten und Progenitor-Zellen-³. OTX2 engagiert sich in der Entwicklung von der Höhlung Kopf und seine übersetzten Protein fungiert als ein Morphogen denn sie einen Farbverlauf durch welche andere Gene erzeugt aktiviert oder in einer räumlich-zeitliche Weise, damit einen Beitrag zur Zelle unterdrückt Proliferation und Differenzierung. Im adulten Organismus ist OTX2 ausschließlich im choroid Plexus und Zirbeldrüse⁴gefunden.

Mutationen in den Genen OTX beziehen sich oft auf die Darstellung des menschlichen angeborenen, somatische oder metabolische Mängel. Gewinn oder Verlust Mutationen in Genen OTX könnte Tumorgenese fördern, wenn sie nicht in der Lage, richtig zu steuern, zelluläre Wachstum und/oder Differenzierung⁵sind. In Leukämien und Lymphomen sowie in vielen soliden Tumoren (z. B. Medulloblastome⁶, aggressiven non-Hodgkin-Lymphome², Brust Karzinome⁷, Kolorektale Karzinome⁸und Retinoblastom⁹) die deregulierten Ausdruck der OTX HB Gene ist gut dokumentierte¹⁰. Darüber hinaus wurden OTX2 Mutationen in Fällen von Anophthalmien und Microphtalmia¹¹ aufgrund der entscheidenden Rolle für dieses Gen bei der Kontrolle der Augenentwicklung nachgewiesen.

Im Rahmen von soliden Tumoren ist die Entdeckung der molekulare und phänotypische Markierungen eine wichtige Herausforderung für die Diagnose, Klassifikation und Behandlung von mehreren Arten von Tumor¹¹, einschließlich derer, die ihren in der Nasenhöhle und der Nasennebenhöhlen Ursprung Nebenhöhlen. In der Tat, trotz, dass diese Gebiete zu besetzen, nur einen bescheidenen anatomischen Raum, Schleimhaut-Epithel, Drüsen, Weichteile, Knochen, Knorpel oder neuronale/Neuroectodermal und Hematolymphoid Zellen sind oft die Website für den Ursprung des komplexen und histologisch unterschiedlichen Gruppen von Tumoren. Verschiedene Arten von Tumoren mit sinunasalen Trakt präsentieren eine Vielzahl von Funktionen, die zu überwinden, was in der Regel in den oberen Aerodigestive Trakt oder sogar in den meisten Teilen des Körpers¹²gesehen wird. Sinunasalen Malignomen sind selten und eine jährlichen Inzidenz von 1: 100.000 Einwohner weltweit zu präsentieren, und so verhindert diese Studien über die Wege der Tumorgenese und die Prüfung von alternativen Behandlungsstrategien beteiligt. Trotz dieser, die Fortschritte in der bildgebenden Verfahren, haben chirurgische Ansätze und Strahlentherapie die klinische Behandlung von sinunasalen Krebs verbessert. Darüber hinaus die Entwicklung von Zell-Linien und Tiermodellen sowie Krebs genetische Profilierung derzeit bilden die Grundlage für die zukünftige gezielte Anti-Krebs-Therapien-¹³. Bisher gibt es keine Berichte über OTX1 und/oder OTX2 Ausdruck in Tumoren der Nasenhöhle, Nasennebenhöhlen und Nasenrachenraum. Da wir bisher beobachtet haben, dass Brust-Krebs-⁷ OTX1 und OTX2 beteiligt sind, fragten wir uns, wenn diese Gene nicht nur in der normalen Nasenschleimhaut sondern auch in Tumoren der Nasenhöhle vorhanden sein könnte. Um dieses Ziel zu erreichen, die wir von der Abteilung für Pathologie des "Ospedale di Circolo" in Varese Proben der normalen Schleimhaut und Nasen- und sinunasalen Adenokarzinome von 1985 bis 2012 gesammelt und klassifiziert nach der Weltgesundheitsorganisation (WHO) erhalten Klassifizierung von Kopf und Hals-Tumoren. Wir wählen sie durch Real-Time PCR und immunhistochemische Analysen zu analysieren und bewerten wir OTX1 und OTX2 Ausdruck, um festzustellen, ob sie molekulare Marker für diese Arten von Tumoren angesehen werden können.

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Protokoll

Die Untersuchungen wurden durchgeführt gemäß der Deklaration von Helsinki (1975) schriftliche Einwilligung nach Aufklärung und genehmigt von der Ethikkommission der Universität Insubria in Varese.

1. Erfassung der Proben

1. Sammeln Sie und teilen Sie alle menschlichen Formalin-Fixed Paraffin-Embedded (FFPE) Proben in verschiedenen Untergruppen entsprechend der WHO-Klassifikation von Kopf und Hals-Tumoren¹⁴.
   Hinweis: Hier haben wir die folgenden Beispielen verwendet: normale sinunasalen Schleimhaut als Kontrolle (10 Proben); Invertiertes Papillom (IP, ICD-O Codes 8121/1); Sinonasal ITAC (ICD-O Code 8144/3, 32 Proben); NITAC (ICD-O Code 8140/3, 12 Proben); Adenoide zystische Karzinom (ACC, ICD-O Codes 8200/3); Pleomorphes Adenom (PA, ICD-O Codes 8941/3); (ICD-O-Code 9522/3, 13 Proben); Schlecht differenzierte neuroendokrine Karzinom (PDNEC, ICD-O Codes 8041/3, 19 Proben); Neuroendokrine Tumoren (NET, ICD-O-Code 8041/3).

(2) Immundiagnostik

1. 4.wenn und Rehydrierung der Abschnitte
   1. Erhitzen Sie die Probe-Folien in einem Ofen bei 60 ° C für 30 min und rehydrieren Sie 3 µm Dicke FFPE Abschnitte mit einem Alkohol-Serie zu Wasser.
   2. Kurz waschen Sie die Objektträger in Xylol für 10 min und wiederholen Sie diesen Schritt; Waschen Sie die Folien für 5 min in 100 % Alkohol und wiederholen Sie diesen Schritt mit 95 %, 85 % und 75 % Alkohol seriell. Spülen Sie die Folien für 5 min in destilliertem Wasser.
2. Blockierung der endogenen Aktivität
   1. Blockieren Sie die endogene Aktivität, indem man die Dias in wässrigen Wasserstoffperoxid 3 % für 12 min.
3. Antigen-retrieval
   1. Durchführen Sie Antigen-Retrieval durch die Behandlung mit 10 mM Citrat-Puffer (pH 6) für 10 min in eine Mikrowellen-Behandlung.
4. Inkubation mit primären Antikörper
   1. Waschen Sie die Abschnitte in TBS-Puffer (pH 7,4), dann fügen Sie blockierende Lösung für 10 Minuten.
   2. Waschen Sie die Abschnitte in TBS-Puffer (pH 7,4), dann fügen Sie 0,2 % Triton X.
   3. Inkubation über Nacht bei 4 ° C mit Ziege Anti-Human OTX2 Antikörper verdünnt 1: 100.
5. Inkubation mit Sekundärantikörper
   1. Die Abschnitte für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren, mit biotinylierte Kaninchen Anti-Ziege Sekundärantikörper verdünnt 1: 200 gefolgt von ABC-Peroxidase-Komplex (siehe Tabellen der Materialien).
6. Entwicklung der Immunantwort
   1. Die Immunantwort mit 3, 3'-Diaminobenzidine Tetrahydrochloride zu entwickeln und die Kerne mit Harris Hematoxylin counterstain.
7. Montage und Bildgebung
   1. Die Abschnitte mit einer Sichel Alkohol-Skala zu entwässern und klären sie über eine Lichtung Substanz Terpene (siehe Tabelle der Materialien). Betten Sie Abschnitte in Eindeckmedium ein, legen Sie in den Abschnitten auf einen Objektträger und beobachten Sie die Abschnitten durch ein optisches Mikroskop zu.

(3) RNA-Extraktion und Reverse Transkription

1. RNA-Extraktion
   1. Extrahieren Sie RNA aus den Abschnitten zu, indem Sie den ersten Schritt der Immunopräzipitation Protokoll (siehe Abschnitt 2.1) durchführen und halten Sie die Folien in destilliertem Wasser. Überschneiden sich die ungefärbte Abschnitte mit den entsprechenden Hämatoxylin-Eosin gefärbt Abschnitte um Fragmente von Interesse zu identifizieren.
   2. Durchzuführen Sie die RNA-Extraktion mit einem kommerziellen RNA Extraktion Kit für FFPE-Proben (siehe Tabelle der Materialien) und folgende Angaben des Herstellers.
2. RNA-Reverse Transkription
   1. Verwenden Sie eine kommerzielle Kit Retro-transkribieren RNA in cDNA (siehe Tabelle der Materialien) nach dem Protokoll. Retro-Transkribieren von mindestens 1.000 ng von Gesamt-RNS, mehrere Analysen durchzuführen.

(4) Real-Time PCR und Datenanalyse

1. Real-Time PCR
   1. Quantitative Echtzeit-PCR-Analysen (qRT-PCR) mit Sonde basierende Technologie durchführen (siehe Tabelle der Materialien) und einem Thermocycler.
2. Vorbereitung der PCR-Reaktion-Mix
   1. Vorbereiten des PCR-Reaktion-Mixes mit 12,5 µL Testbasierte master-Mix, 1,25 µL des OTX1, OTX2 und ACTB Sonden (siehe Tabelle der Materialien), 50 ng cDNA, und Nuklease-freies Wasser bis zu 25 µL Gesamtvolumen.
   2. Führen Sie alle Reaktionen in dreifacher Ausfertigung mit der ACTB-gen als die endogene Steuerung gen Ausdruck Niveaus zu normalisieren.
   3. Die Platte 1.109 x g für 3 min Zentrifugieren und lichtgeschützt bei 4 ° C bis das Experiment Platte zu speichern.
3. Einstellung der Thermocycler
   1. Satz der Thermocycler-Profil mit einer anfänglichen hot-Start-Zyklus bei 50 ° C für 2 min und 95 ° C für 10 min, gefolgt von 40 Zyklen bei 95 ° C für 15 s und einer letzten Zyklus bei 60 ° C für 1 min.
4. Genexpressionsanalysen Ebene
   1. Die gen-Ausdruck-Ebenen durch die vergleichende Zyklus Schwelle (ΔCt) Methode mit der ACTB-gen als die endogene Steuerung zu normalisieren.
   2. Gen-Ausdruck-Ebenen mit der 2^-ΔCt -Methode zu bewerten und die Ergebnisse Plotten.
5. Statistische Analysen
   1. Statistische Analysen mit der Student t-Test, wenn man statistisch signifikante Ergebnisse mit p < 0,05.

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Ergebnisse

In der normalen Schleimhaut beobachteten wir starke und homogene nuklearen Reaktivität für OTX Gene sowohl in pseudostratified Flimmerepithel der Atemwege-Typ submucosal Drüsenzellen (Abbildung 1A). Wir fanden, dass nukleare Ausdruck für OTX1 in allen NITACs Proben (Abbildung 1 b), während wenig oder fehlende Immunoreactivity in ITACs (Abbildung 1) hervorgehoben wurde. Intensive Immunoreactivity...

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Diskussion

Diese Studie zeigt zum ersten Mal, die, basierend auf mRNA-Niveaus, die HB-Gene OTX1 und OTX2 werden ausgedrückt in normalen sinunasalen Schleimhaut und submucosal Drüsen, entzündliche Polypen, sinunasalen Schneiderian Papillome und in den verschiedenen epithelialen und Neuroectodermal Tumoren, einschließlich plattenepithelialen Karzinome, nicht intestinalen Typ sinunasalen Adenokarzinome, Speicheldrüse-Typ Tumoren, neuroendokrinen Tumoren und ONs.

Modifikationen und Fehlerbehebung:

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation	Applied Biosystem	AM1975
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystem	4368814
TaqMan Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG	Applied Biosystem	4326614
ABI Prism 7000	Applied Biosystem	270001857
ACTB probe	Applied Biosystem		Out of production. Sequence protected by copyright
OTX1 probe	Applied Biosystem		Out of production. Sequence protected by copyright
OTX2 probe	Applied Biosystem		Out of production. Sequence protected by copyright
Acqueous Hydrogen Peroxide	Merk	1072090250
Citrate Buffer	Sigma-Aldrich	20276292
Triton	Sigma-Aldrich	101473728
Tris	Merk	108382
NaCl	Merk	106404
Goat Anti-OTX2 Antibody	Vector Laboratories		Out of production. Catalog number not available
Rabbit Anti-Goat Antibody	Vector Laboratories	BA5000
ABC-Peroxidase Complex	Vector Laboratories	PK6100
3,3'-diaminobenzidine tetrahydrocloride (DAB)	Sigma-Aldrich	D5905
Harris Hematoxylin	Bioptica	0506004/L
Pertek	Kaltek SRL	1560
BioClear	Bioptica	W01030799