体内人淋巴组织和女性生殖器粘膜与人体免疫机能丧失病毒1和 Histoculture 的感染

摘要

人类组织感染人体免疫机能丧失病毒 (HIV) 的体内提供了一个有价值的3D 模型的病毒发病机制。在这里, 我们描述了处理和感染人体扁桃体和女性生殖器粘膜与 HIV-1 的组织标本的协议, 并在液体-空气界面保持他们在文化。

摘要

Histocultures 允许研究人体组织内的细胞间相互作用, 并可用于在受控实验室条件下模拟宿主-病原体的相互作用。人体组织与人体免疫机能丧失病毒 (HIV) 等病毒的体外感染已成功地用于研究早期疾病的发病机制, 以及检测抗病毒药物的功效和毒性的平台。在本议定书中, 我们解释如何处理和感染 HIV-1 组织外植体从人扁桃体和宫颈粘膜, 并保持他们在凝胶海绵顶部在液体-空气界面上大约两个星期的文化。这种非极化的培养环境最大限度地提高了培养基和氧气中营养素的摄取量, 虽然组织完整性和功能结构的逐渐丧失仍然是其主要局限性。此方法允许使用多种技术 (包括免疫分析、qPCR 和流式细胞仪) 监测 HIV-1 复制和发病机制。重要的是, 组织捐献者之间的生理变异性, 以及同一标本不同区域的外植体之间可能会对实验结果产生显著影响。为确保结果重现性, 在从多个实验中编译数据时, 使用足够数量的外植体、技术复制和供方匹配的控制条件来标准化实验处理结果是至关重要的 (i。, 使用不同捐赠者的组织) 进行统计分析。

引言

单型二维细胞培养, 这里称为常规, 不考虑组成组织和器官的各种细胞类型之间的空间和功能沟通。这方面对疾病的实验模型至关重要, 因为干扰稳态细胞间相互作用是所有病症的驱动因素。组织外植体为人类建模健康和疾病提供了主要的优势, 因为它们保留了细胞构筑和器官的许多重要功能方面, 因为它们在体内, 虽然在有限的时间量¹。例如, 在与召回抗原 (如白喉毒素或破伤风类毒素) 的体外挑战中, 扁桃体组织对抗原特异抗体²的剧烈生产作出反应。与任何其他的体外模型一样, histoculture 有其自身的局限性: 捐献者之间的变异性、组织极化、有限的组织生存和难以监测超过共聚焦显微镜深度¹的细胞。然而, 人类组织外植体仍然是研究人类稳态和致病性免疫过程的一种选择模式, 包括宿主-病原菌相互作用和潜在的治疗干预³。

HIV-1 发病的关键事件发生在组织中。生殖器粘膜的感染占全球所有 HIV-1 传输事件的大多数⁴。淋巴组织是急性感染过程中病毒复制的主要部位, 潜在感染细胞⁵, 其持续性是达到治愈⁶的主要障碍。人类淋巴和粘膜组织的培养和体外挑战为 HIV-1 的研究提供了比传统的孤立细胞系统更大的优势。例如, 在没有外源激活的情况下, 组织驻留细胞可以支持 HIV-1 感染, 而不是外周血单个核细胞¹。利用淋巴组织外植体, 可以更好地了解 CD4 T 细胞耗竭的一些关键机制,即旁观者效应⁷, 这是急性感染的标志。在淋巴组织⁸和女性生殖器黏膜外植体上皮中的 B 细胞卵泡的保存⁹提供了独特的机会, 在这些地点整合 HIV-1 感染的空间和功能特征。最后, histocultures 成功地用于模拟和研究 HIV-1 和疱疹病毒共感染^10、11以及抗逆转录病毒药物和多目标杀菌剂¹²的临床前测试,^13,14,15。

在这里, 我们描述了一个详细的协议, 从扁桃体和粘膜组织从下女性生殖器道 (子宫颈) 获得的人类组织外植体培养, 覆盖组织解剖, 以非极化方式 HIV-1 外植体挑战。在液体-空气界面的组织外植体的培养, 使用明胶海绵作为支撑, 最大限度地暴露在空气中的氧气, 同时通过海绵毛细血管获得培养基养分, 从而延缓其自然衰变。在我们的系统中评估 HIV-1 复制的最直接的方法是通过免疫分析或 qPCR 测量在外植体培养基中释放的病毒数量。HIV-1 感染和发病机制(CD4 T 细胞耗竭) 也可以通过大量 RNA/DNA 提取和 qPCR,原位染色, 或通过流式细胞术进行组织消化的单细胞分析来评估组织外植体。

研究方案

收集人体组织的议定书可能需要当地主管当局的道义上的批准。如扁桃体摘除和子宫切除术等所示手术, 标本并非专门为研究目的而收集, 研究也不被认为是人体研究 (国家卫生研究院)。人类学科研究。https://humansubjects.nih.gov/walkthrough-investigator#tabpanel11)。然而, 获得组织捐赠者的个人和医疗数据 (例如, 性别、年龄、当前药物使用、感染史等) 可能有助于解释实验结果, 对知情同意和隐私构成了关注, 必须在组织收集的协议中得到解决。

注意: 整个过程应在生物安全柜中进行。所有的人体标本, 包括那些来自 "健康" 的人, 都可能是感染性药物的港湾。即使实验不涉及使用 HIV, 操作人员也应接受与血源病原体一起工作的训练, 以安全地处理组织标本。应由训练有素的工作人员对组织解剖和感染 HIV 的程序进行风险评估, 以确保操作员和同事的安全。使用传染性 HIV 需要专门的生物安全等级2或3环境, 具体取决于国家和研究所针对危险生物制品和血源病原体的具体规定。

1. 明胶海绵的制备

注意: 虽然在组织解剖前不需要准备明胶海绵, 但遵循此处概述的顺序更为方便, 尤其是在处理大量组织和/或许多捐赠者时。

1. 准备培养基 (CM), 并补充抗生素溶液 (Tircacillin 克拉维酸混合物), 然后再使用, 使 CMT (材料表)。丢弃任何残留的抗生素溶液。
   注意: 替卡西林和克拉维酸在 CMT 中的稳定性较差。如果需要, 从准备工作大约24小时后再补充 CMT 与抗生素溶液。在培养过程中, 每24小时不需要将抗生素溶液添加到外植体培养基中。
2. 填充一个100毫米 x 20 毫米培养皿约20–30毫升的 CMT。
   注意: 此设置是最佳准备足够的明胶海绵为两个6孔板或一个12孔板在当时。如果需要许多板, 使用更广泛的培养皿和更大的 CMT 体积, 以加快准备。
3. 使用无菌钳将明胶海绵转移到培养皿中。在两侧浸湿海绵, 让海绵浸泡培养基1分钟. 使用无菌刮刀将海绵按培养皿底部按压2分钟。
   注意: 这一步是至关重要的, 因为海绵中气泡的存在将阻断培养基养分到达组织的毛细血管。在脱水时, 明胶海绵非常脆。用刮刀轻轻按压海绵, 特别是在开始时, 以避免破坏海绵。
4. 使用无菌剪刀将水化明胶海绵切成约1厘米²的相同大小的块。将1块海绵片用镊子放入培养板的每个孔中。将3–4毫升的 CMT 添加到每孔6孔板 (扁桃体) 和1毫升每孔到12孔板 (子宫颈)。将盘子放在孵化器中, 设置在37摄氏度, 5% CO₂, ≥90% 湿度, 直到组织外植体准备好装在海绵上。
   注: 要添加到板中的 CMT 的体积应调整到海绵的厚度, 以保持外植体在液体-空气界面。

2. 人体扁桃体组织的解剖

注意: 手术后应尽快处理扁桃体, 最好是手术当天。或者, 标本可以在4摄氏度的 CMT 中过夜。

1. 让 CM 足够的时间到达室温 (RT) 或将其放入水浴预热在37摄氏度。使用前用抗生素溶液 (CMT) 补充 CM。放弃任何遗留的抗生素溶液。将70% 乙醇溶液倒入干净的容器中, 在解剖过程中需要时浸泡镊子和手术刀。清洁工具并改变不同捐赠者解剖标本之间的刀刀。
2. 使用无菌钳将扁桃体从运输容器转移到含有10-20 毫升 CMT 的100毫米培养皿中。
   注意: 有烧灼、血腥或坏死组织的广泛区域的标本应丢弃。
3. 使用培养皿的盖子作为切割表面来解剖组织。用钳子轻轻握住纸巾, 用无菌手术刀和刀片将每个扁桃体切成几大块。
   小心: 使用锋利的工具解剖人体标本会增加受伤和污染的风险。操作员应考虑佩戴金属、网眼、防切割手套作为额外保护。
4. 使用镊子和手术刀去除烧灼、血腥和肌瘤组织, 以及含有 tonsilloliths (钙化材料) 和/或用绿褐色颜色的任何部位。
   注意: 在一张纸巾上工作时, 必须将其余的组织浸入培养基中以避免组织脱水。
5. 将每个组织片切成大约2毫米厚度的薄片。如上一步所示删除任何不需要的部件。将组织切片切成2毫米厚的条带。将组织条切成2毫米厚的方块。这将导致组织外植体大约8毫米³。
6. 将外植体转移到一个新的100毫米培养皿中, 包含10–20毫升的 CMT, 以避免组织干燥, 同时进行解剖。在解剖结束时, 旋转板以随机化外植体分布。使用镊子将9个组织外植体放在每个明胶海绵的顶部, 在6孔板上放置它们之间的空隙。把盘子还给孵化器。
   注意: 通常情况下, 外植体在夜间培养, 并在第二天进行 HIV-1 培养。这是为了确保没有细菌或真菌污染在文化中发展。此外, 细胞在解剖后往往出口扁桃体组织外植体。这一过程主要在文化¹的前24小时内完成。
7. 根据研究所关于处理危险生物制品和具体风险评估的规定, 处置恰当容器中的所有生物废物。

3. HIV-1 扁桃体组织外植体感染

注意: 为了减少独立实验之间的结果变异性, 应使用相同的病毒制剂进行整个研究。病毒可以在外部激活的外周血单个核细胞中传播, 然后培养上清液在-80 摄氏度下可按贮存, 避免重复冻结和解冻 (材料表)。

1. 将 CM 放在水浴中预热37摄氏度。使用前用抗生素溶液 (CMT) 补充 CM。丢弃任何残留的抗生素溶液。
2. 用吸管将6孔板中的介质吸入, 并将其丢弃在带有消毒剂溶液的容器中。倾斜盘子, 轻轻地将明胶海绵推到井的上部, 使培养基在底部聚集, 然后吸出并丢弃。每井加3-4 毫升的 CMT。
3. 在37摄氏度的水浴中解冻 HIV-1 病毒制剂。如有必要, 用 CM 稀释病毒库 (表 1)。
   注: 应稀释病毒库存, 使所选的接种剂包含在5–8µL 的体积中 (表 1)。为了有效感染, 使用解冻 HIV-1 制剂和感染组织外植体之间所需的最短时间是至关重要的。
4. 将病毒接种剂直接移到明胶海绵上9个外植体的顶部。一旦感染完成, 将盘子返回孵化器。丢弃任何残留病毒制剂。继续5节。
   注意: 为了准确地提供病毒接种者, 操作人员应考虑使用反向移液技术, 并为每一个油井更换尖端。这包括将移液器活塞向下推到清除位置 (第二站), 以绘制病毒接种, 并推动到第一个停止提供接种剂, 这有助于最小化气泡形成和与重复取样小的错误卷,即5–8µL。

4. 宫颈黏膜的解剖和感染

注意: 为了获得最佳效果, 应在手术后尽快处理和感染宫颈粘膜的外植体, 理想情况下手术当天。另外, 标本可在4摄氏度的 CMT 中储存, 并在解剖后立即感染。

1. 让 CM 足够的时间到达 RT 或把它放在水浴预热在37摄氏度。使用前用抗生素溶液 (CMT) 补充 CM。丢弃任何残留的抗生素溶液。将70% 乙醇溶液倒入干净的容器中, 在解剖过程中需要时浸泡镊子和手术刀。清洁工具和改变解剖的标本从多个捐赠者之间的手术刀刀片。
2. 使用无菌钳, 将样品从运输容器转移到含有10–20毫升 CMT 的100毫米培养皿中。
3. 使用培养皿的盖子作为切割表面来解剖组织。用钳子轻轻握住纸巾, 用手术刀和叶片将 ectocervix 和/或宫颈的粘膜与解剖体和肌肉组织 (粘膜下层) 分开, 以获得粘膜条。
   注意: 在一张纸巾上工作时, 必须将其余的组织浸入培养基中以避免组织脱水。
4. 将粘膜切成2毫米宽的条带, 尽可能去除和丢弃尽可能多的黏膜下层, 只留下2毫米厚的组织层。将条带切成2毫米厚的方块。这将导致组织外植体大约8毫米³。
   小心: 使用锋利的工具解剖人体标本会增加受伤和污染的风险。操作员应考虑佩戴金属、网眼、防切割手套作为额外保护。
5. 将组织外植体转移到一个新的100毫米培养皿中, 包含10–20毫升的 CMT, 以避免组织干燥, 同时进行解剖。在解剖结束时, 旋转板以随机化外植体分布。
6. 使用无菌钳, 将外植体转移到无菌1.5 毫升锥形管 (每管最多16个外植体)。使用移液器移除管中的任何介质。
7. 在37摄氏度的水浴中解冻 HIV-1 制剂。如有必要, 用 CM 稀释病毒库. 将病毒转移到含有外植体的试管中。丢弃任何残留病毒制剂。
   注: 应稀释病毒库存, 使所选的接种剂包含在至少0.5 毫升 (表 1) 的体积中。为了减少独立实验之间的结果变异性, 应使用相同的病毒制剂进行整个研究 (材料表)。
8. 将管子转换成热振动筛, 在37摄氏度下孵育2小时, 在 300 rpm 时摆动。每30–60分钟轻轻地反转管子几次。
   注意: 为了有效的感染, 使用解冻 HIV-1 准备和将管子转移到37摄氏度之间所需的最短时间是至关重要的。
9. 填充6孔板与3–4毫升每井无菌磷酸盐缓冲盐水 (PBS)。在孵化与 HIV-1, 丢弃所有病毒准备在管 (s) 到一个容器与消毒剂溶液使用吸管。使用镊子将外植体转移到含有 PBS 的6孔板中。
10. 允许外植体在 pbs 中停留1分钟, 然后通过轻轻地将 pbs 向上和向下移入井2-3 次来洗涤它们。使用吸管将 PBS 丢弃在带有消毒剂溶液的容器中。每井添加3–4毫升的新 PBS。再重复两次, 总共三洗涤。在将外植体转移到海绵之前先丢弃 PBS, 以避免组织干燥。
    注意: 宫颈黏膜的外植体, 特别是宫颈, 在感染期间释放大量粘液。这是至关重要的清洗和去除尽可能多的粘液, 因为非特异性保留在外植体和随后释放的病毒进入培养上清可以掩盖病毒复制。
11. 使用镊子, 在12孔板上的每个明胶海绵顶部转移5-8 个外植体。把盘子还给孵化器。
12. 根据研究所关于处理危险生物制品和具体风险评估的规定, 处置恰当容器中的所有生物废物。

5. Histoculture

1. 从感染时间开始每3天更换 CM, 直到12–15后感染。CM 和/或外植体可在整个培养时间内定期取样, 以评估 HIV-1 复制, 以及其他参数。
2. 将 CM 放在水浴中预热37摄氏度。
   注意: 在这个阶段, 不需要用抗生素溶液补充 CM。
3. 使用移液器收集 CM 样品, 并将其转移到无菌1.5 或 2 mL 螺钉盖管中, 以存储在-80 摄氏度。
   注: 从复制井的 CM 汇集在集合。
4. 用无菌镊子收割组织外植体, 将多余的培养基放在一张纸上 (可选), 将外植体转移到无菌1.5 或2毫升的螺帽管中。根据实验要求处理或储存组织样品。
   注意: 对于流式细胞术, 外植体立即被酶促鸡尾酒消化, 以获得单细胞悬浮液 (有关详细信息, 请参阅参考资料1、9、16和 17)。对于 rna 提取, 外植体保存在4摄氏度的 rna 稳定溶液中, 然后储存在-80 摄氏度。对于 DNA 提取或原位染色 (子宫颈), 外植体可在液氮或干冰/乙醇浆料中进行吸附冷冻, 储存在-80 摄氏度。另外, 扁桃体外植体可以通过浸没在 PBS 的溶液中和4% 多聚甲醛原位染色来固定。
5. 用吸管吸进井中残留的 CM, 然后用消毒剂溶液将其丢弃到容器中。倾斜盘子, 轻轻地将明胶海绵推到井的上部, 使培养基在底部聚集, 然后抽吸并丢弃。
6. 将3–4毫升的 CM 添加到每个井中。使用无菌钳, 将所有落入培养基中的组织外植体返回到明胶海绵中。把盘子还给孵化器。
7. 在文化的末端, 根据研究所关于处理危险生物制品的规定和具体的风险评估, 处置恰当容器中的所有生物废物。

结果

几种技术可用于评估组织外植体中的 HIV-1 复制。我们的标准读数是测量 HIV-1 p24_插科打诨释放在 CM 随着时间与免疫分析¹⁸的量。

不同捐献者的组织外植体, 感染同一 HIV-1 的相同接种剂, 可能产生不同数量的病毒 (表 1)。这是由于几个因素, 如 HIV-1 靶细胞的数量和状态和在组织^1...

讨论

使用人类组织外植体进行 HIV-1 感染的研究, 比传统的二维和单型实验系统 (如原代细胞或细胞系) 具有优势, 因为它们具有卓越的再现细胞间相互作用的能力和细胞功能 (如细胞因子的产生), 因为它们在体内。然而, 扁桃体和宫颈组织在许多方面都不同, 包括艾滋病毒靶细胞的数量、表型和功能特征^1、16。出于同样的原因, 不同的共同受体取向...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge	Pfizer	NDC:  0009-0315-08	Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue.
SPONGOSTAN Standard 70 × 50 × 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge	Ferrosan Medical Devices	MS0002	Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue.
RPMI 1640 with phenol red and glutamine	ThermoFisher Scientific	21875034	To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Modified Eagle's medium (MEM) non-essential aminoacids (100x)	ThermoFisher Scientific	11140035	To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Sodium pyruvate, 100 mM (100x)	ThermoFisher Scientific	11360070	To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Gentamicin 50 mg/mL (1000x)	ThermoFisher Scientific	15750037	To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Amphotericin B 250 μg/mL (100x)	ThermoFisher Scientific	15290018	To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Fetal bovine serum (FBS)			To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Ticarcillin disodium salt	Sigma-Aldrich	T5639-1G	Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3 g) and potassium clavulanate (100 mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT.
Potassium clavulanate	Sigma-Aldrich	33454-100MG	Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3 g) and potassium clavulanate (100 mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT.
Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red			To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage.
Sterile cell culture grade water
Sterile transportation container
70% ethanol solution
Disinfectant solution for biological waste disposal
Sterile metal forceps or tweezers
Sterile metal scissors
Sterile flat weighing metal spatula
Sterile scalpels and blades
6-well cell culture plates
12-well cell culture plates
Sterile Petri dish, 100 mm × 20 mm
Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL	NIH AIDS Reagent Program	510	The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing.
Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04	NIH AIDS Reagent Program	2522	The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing.
Lamivudine (3TC)	NIH AIDS Reagent Program	8146	Resuspend in DMSO at 10 mg/mL, aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing.
Biological safety cabinet
Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 °C, 5% CO2, ≥ 90% humidity
Water bath set at 37 °C
Sterile 1.5 and 2mL screw cap tubes
Dry bath shaker with heating block for 1.5 mL tubes, set at 37 °C, 300 rpm