Ex Vivo Инфекции половых слизистой лимфоидной ткани человека и женщин с вирусом иммунодефицита человека 1 и Histoculture

Резюме

Инфекция тканях человека с вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) ex vivo обеспечивает ценный 3D модель патогенеза вирусов. Здесь мы описываем протокол для обработки и заразить пробах тканей человека миндалин и женских половых mucosae с ВИЧ-1 и поддерживать их в культуре в интерфейсе жидкости воздух.

Аннотация

Histocultures позволяют изучать межклеточных взаимодействий в тканях человека, и они могут быть использованы для модели взаимодействия хост возбудитель контролируемых лабораторных условиях. Ex vivo инфекции человека тканей с вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), среди других вирусов, успешно используется для расследования ранних патогенеза заболеваний, а также платформу для тестирования эффективности и токсичности противовирусных препаратов. В настоящем протоколе мы объясним, как обрабатывать и заразить эксплантов ткани ВИЧ-1 от человека миндалин и шейки матки mucosae и поддерживать их в культуре на вершине желатин губки на интерфейсе жидкости воздуха около двух недель. Этот параметр-поляризованных культуры увеличивает доступ к питательных веществ в питательной среды и кислорода, хотя прогрессирующая потеря целостности тканей и функциональной архитектуры остается основным ограничением. Этот метод позволяет мониторинга репликации ВИЧ-1 и патогенез, используя несколько методов, в том числе immunoassays, ПЦР и проточной цитометрии. Значение физиологическое изменчивость между донорами ткани, а также между эксплантов из разных областей же образца, может существенно повлиять на результаты экспериментов. Для обеспечения воспроизводимости результатов, важно использовать достаточное количество эксплантов, технические реплицирует и доноров соответствием контроля условий для нормализации результаты экспериментального лечения при компиляции данных из нескольких экспериментов (т.е. ., проведенные с помощью ткани от различных доноров) для статистического анализа.

Введение

Монотипические Би мерного клеточных культур, здесь упоминаемые как обычных, не учитывают пространственная и функциональная связь между большим разнообразием типов клеток, которые составляют ткани и органы. Этот аспект имеет первостепенное значение для экспериментальных моделях болезней, как вмешательство в гомеостатических межклеточных взаимодействий является движущим фактором всех патологий. Ткани эксплантов предлагают преимущества для моделирования здоровья и болезни среди людей, поскольку они сохраняют cytoarchitecture и многие важные аспекты функциональных органов, как они находятся в естественных условиях, хотя за ограниченное количество времени¹. Например после ex vivo вызов с антигенами напомнить, например, дифтерии анатоксином или столбняка, миндалин ткани реагирует с энергичной производства антиген специфические антитела². Как и любой другой ex vivo модели, histoculture имеет свои собственные ограничения: изменчивость между донорами, ткань поляризации, выживание ограничены ткани и сложности в мониторинге клетки за пределы глубины confocal микроскопии¹. Тем не менее эксплантов тканей человека остаются модель выбора для изучения гомеостаза и патогенных иммунологические процессы в организме человека, в том числе хост возбудитель взаимодействий и потенциальных терапевтических вмешательств³.

Критические события патогенеза ВИЧ-1, имели место в тканях. Инфицирования слизистой оболочки половых органов приходится большинство всех ВИЧ-1 передачи события во всем мире⁴. Лимфоидной ткани является основной сайт репликации вируса во время острой инфекции и гаваней значительный пул латентно инфицированных клеток⁵, и их сохранение представляет собой основное препятствие для достижения лечения⁶. Культура и ex vivo вызов человека лимфоидных и слизистых тканей обеспечивают ряд преимуществ перед обычными системами на основе изолированных клеток для изучения ВИЧ-1. Например клетки ткани резидент может поддерживать инфекции ВИЧ-1 в отсутствие внешних активации, в отличие от мононуклеаров периферической крови¹. Использование эксплантов лимфоидной ткани позволило лучше понять некоторые ключевые механизмы, лежащие в основе CD4 T клеток истощениет.е., прохожий эффект⁷, который является отличительной чертой острой инфекции. Сохранение структуры как B клеток фолликулов в лимфоидной ткани⁸ и эпителия в женских половых слизистой эксплантов⁹ предлагает уникальную возможность интегрировать пространственные и функциональные особенности ВИЧ-1 инфекции на этих сайтах. Наконец histocultures были успешно использованы модели и исследования герпеса и ВИЧ-1 инфекции^10,11, а также для Доклинические испытания антиретровирусных препаратов и multitarget бактерицидные^{12, 13 , 14 , 15}.

Здесь мы описываем подробный протокол для культуры тканей человека эксплантов, полученные из миндалин и слизистых тканей от нижней женских половых органов (матки), охватывающих рассечение тканей в explant вызов с ВИЧ-1-поляризованных способом. Культура ткани эксплантов в жидкость воздуха интерфейс, с помощью губки желатин в качестве поддержки, максимизирует воздействие воздуха кислорода, обеспечивая доступ к питательной среды питательные вещества через Губка капилляров, затягивая тем самым их естественного распада. Наиболее непосредственным способом оценки репликации ВИЧ-1 в нашей системе заключается в том, чтобы измерить количество вируса, выпущенное в среде культуры экспланта со временем иммуноанализа или ПЦР. Инфекции ВИЧ-1 и патогенез (например., CD4 T клеток истощения) могут также быть оценены в ткани эксплантов путем массового извлечения РНК/ДНК и ПЦР, в situ пятнать или единого анализа клеток после переваривания ткани проточной цитометрии.

протокол

Протокол для коллекции ткани человека может потребовать этические утверждения местными компетентными органами. В случае указанной операции как удаление миндалин и гистерэктомия образцы не являются собранные специально для цели исследования и исследования не считается человеческих субъектов исследования (национальные институты здравоохранения. Исследования на человеке. HTTPS://humansubjects.nih.gov/Walkthrough-investigator#tabpanel11). Однако, получение личной и медицинской данных доноров ткани (например., пол, возраст, текущего употребления наркотиков, история инфекции, и т.п.) которые могут помочь интерпретировать результаты экспериментов, позы обеспокоенность осознанного согласия и конфиденциальности, которые должны быть обратился в протоколе для коллекции тканей.

Предупреждение: Вся процедура должна осуществляться в биологической безопасности кабинета. Все образцы человека, в том числе от «здоровый» лиц, может гавани инфекционных агентов. Оператор должен получить подготовку для работы с кровью патогенов безопасно обрабатывать образцов тканей, даже если эксперименты не связаны с использованием ВИЧ. Оценку риска процедура рассечение тканей и инфекции с ВИЧ должны осуществляться квалифицированного персонала для обеспечения безопасности оператора и coworkers. Для использования инфекционных ВИЧ требуется выделенный биобезопасности сред уровня 2 или 3 в зависимости от страны и Института конкретных правил опасных биологических и патогенов.

1. Подготовка желатин губки

Примечание: Хотя это не строго необходимо подготовить желатин губки до рассечение тканей, это более удобно следовать порядку, изложенные здесь, особенно при обработке большого объема ткани и/или от многих доноров.

1. Подготовка питательной среды (CM) и дополнить его с антибиотик раствор (Tircacillin клавуланат микс) перед использованием, чтобы сделать CMT (Таблица материалов). Отменить любые остатки антибиотиков решение.
   Примечание: Ticarcillin и клавуланата в CMT плохо стабильной. Если необходимо, повторно дополнить CMT Антибиотик раствор после около 24 h от подготовки. Он не требуется для добавления Антибиотик раствор для explant среднего каждые 24 часа во время культуры.
2. Заполните 100 мм х 20 мм Петри с около 20 – 30 мл CMT.
   Примечание: Этот параметр является оптимальным подготовить достаточно желатин губки для двух пластин 6-ну или один 12-ну пластины в то время. Если требуются многие плиты, используйте широкий Петри и больший объем CMT ускорить подготовку.
3. Передача sponge(s) желатин в Петри с помощью стерильный пинцет. Влажные губки с обеих сторон и позволяют губки понежиться средний 1 мин пресс губки против нижней части Петри для около 2 мин, с использованием стерильных шпателем.
   Примечание: Этот шаг имеет решающее значение, потому что наличие воздушных пузырей в Губка будет блокировать капилляров, через которые культуры среднего питательных веществ достичь ткани. Желатин губки являются чрезвычайно хрупким, когда обезвоженной. Аккуратно надавите на губку с лопаткой, особенно в начале, чтобы избежать нарушения губки.
4. Использование стерильными ножницами вырезать Регидратированные желатин губки на куски одинакового размера около 1 см². Передача 1 кусок губки с помощью щипцов в каждой скважине плиты культуры. Добавьте 3 – 4 мл CMT в каждой скважине 6-ну плиты (миндалины) и 1 мл на колодец в 12-ну плиту (шейка матки). Поместите пластины в инкубаторе, задать при 37 ° C, 5% CO₂, ≥ 90% влажности, до тех пор, пока ткань эксплантов готовы быть загружены на губки.
   Примечание: Объем CMT для добавления в пластину следует скорректировать до толщины Губка держать эксплантов в интерфейсе жидкости воздух.

2. рассечение тканей человека миндалин

Примечание: Миндалин должны быть обработаны как можно скорее после операции, в идеале в тот же день операции. Кроме того образцы можно оставить на ночь погруженным в CMT при 4 ° C.

1. Разрешить см достаточно времени, чтобы достичь комнатной температуры (RT) или положить его в водяной бане предварительно нагревают при 37 ° C. Дополнить см раствором антибиотиков (CMT) перед использованием. Отменить любой антибиотик раствор, осталось. Залейте раствор 70% этанола в чистый контейнер замочить щипцы и скальпеля всякий раз, когда требуется во время процедуры вскрытия. Очистите инструменты и измените лезвие скальпеля между Анатомирование образцов от различных доноров.
2. Передача миндалин от транспортировки контейнера в 100 мм Петри блюдо, содержащих 10-20 мл CMT, с использованием стерильный пинцет.
   Примечание: Образцы с широкой области прижигание, кровавый, или некротических тканей должны быть отброшены.
3. Используйте крышку Петри блюдо как поверхность резки для рассечения тканей. Проведение ткани аккуратно пинцетом, нарезать каждый миндалин несколько большой помощью стерильным скальпель и лезвие.
   Предупреждение: Острые инструменты обработки для того чтобы рассечь человеческих образцов увеличивает риск повреждения и загрязнения. Оператор должен рассмотреть носить металла, сетка, порезам перчаток в качестве дополнительной защиты.
4. Обезболивающий укол, кровавый, удалить и миомы ткани и любой части содержащие tonsilloliths (кальцинированные материалы) и/или с Грин коричневого цвета с помощью щипцов и скальпеля.
   Примечание: Во время работы на один кусок ткани, важно сохранить остальной части ткани, погруженной в среде, чтобы избежать высыхания ткани.
5. Каждый кусок ткани нарежьте ломтиками около 2 мм в толщину. Удалите любые нежелательные части как в предыдущем шаге. Порезать кусочками ткани на 2 мм толстой полоски. Нарежьте полосками ткани 2 мм толстой блоков. Это должно привести к ткани эксплантов примерно 8 мм³.
6. Перенесите эксплантов в новой 100 мм Петри, содержащих 10 – 20 мл во избежание высыхания ткани во время разбирательства с рассечение. В конце рассечение вихрем пластину в случайном порядке распределения экспланта. 9 место ткани эксплантах на вершине каждой желатин Губка в 6-ну пластине с помощью щипцов, позволяя пространства между ними. Возвращение пластины в инкубаторе.
   Примечание: Как правило, эксплантов культивируемых на ночь и прививка культур с ВИЧ-1 выполняется следующий день. Это чтобы убедиться, что нет бактериальной или грибковой загрязнение развивается в культуре. Кроме того клетки, как правило, выход ткани миндалин эксплантов после вскрытия. Во многом этот процесс завершается в течение первых 24 ч культуры¹.
7. Удаление всех биологических отходов в подходящих контейнерах согласно правилам Института на обработку опасных биологических и оценки конкретных рисков.

3. инфекции миндалин ткани эксплантах с ВИЧ-1

Примечание: Чтобы уменьшить результат изменчивости между независимыми эксперименты, же вирус подготовки должно использоваться для всего исследования. Вирус может распространяться в экзогенно активированные периферической крови мононуклеаров и затем супернатанта культуры может быть aliquoted для хранения при температуре-80 ° C избегать повторного замораживания и оттаивания (Таблица материалов).

1. Положите см в ванне с водой, предварительно нагревают при 37 ° C. Дополнить см раствором антибиотиков (CMT) перед использованием. Отменить любые остатки антибиотиков решение.
2. Аспирационная среднего в знаке 6-колодец с пипетки и отменить его в контейнер с дезинфицирующим раствором. Наклона пластины и аккуратно вставьте желатин губки в верхней части колодца разрешить средне-собрать на дне и аспирационная и выбросьте его. Добавьте 3-4 мл CMT в каждой скважине.
3. Оттепель подготовка вирус ВИЧ-1 в водяной бане при температуре 37 ° C. При необходимости разбавьте запасов вируса с см (Таблица 1).
   Примечание: Вирус запас следует разбавить таким образом, чтобы выбранные посевным материалом содержится в объеме 5-8 мкл (Таблица 1). Для эффективной инфекции важно использовать минимальное время, необходимое между оттаивания подготовка ВИЧ-1 и заражая эксплантов ткани.
4. Пипетка посевным материалом вируса непосредственно поверх каждого из 9 эксплантов на губку желатина. Возвращение знаке в инкубатор, как только инфекция будет завершена. Отменить любые остаточные вирус подготовки. Далее в разделе 5.
   Примечание: Точно доставить вирус посевные оператор следует с использованием обратного дозирования техники и изменение подсказки для каждой скважины. Это предполагает, что толкает поршень пипетку до продувки позиции (вторая остановка) разработать вирус посевным материалом, и толкает к первой остановки доставить посевным материалом, который помогает минимизировать образование пузыря и ошибки связанные с повторных проб малых тома, то есть, 5 – 8 мкл.

4. Вскрытие и инфекции слизистой оболочки шейки матки

Примечание: Для получения оптимальных результатов, эксплантов шейки матки mucosae следует обработать и инфицированных как можно скорее после операции, в идеале в тот же день операции. Кроме того образцы можно хранить погруженным в CMT на 4 ° C на ночь и инфицированных сразу после вскрытия.

1. Разрешить см достаточно времени, чтобы достичь RT или положить его в водяной бане предварительно нагревают при 37 ° C. Дополнить см раствором антибиотиков (CMT) перед использованием. Отменить любые остатки антибиотиков решение. Залейте раствор 70% этанола в чистый контейнер замочить щипцы и скальпеля всякий раз, когда требуется во время процедуры вскрытия. Очистите инструменты и измените лезвие скальпеля между Анатомирование образцов от нескольких доноров.
2. С помощью стерильный пинцет, передача образца от транспортировки контейнера в 100 мм Петри, содержащих 10 – 20 мл CMT.
3. Используйте крышку Петри блюдо как поверхность резки для рассечения тканей. Проведение ткани аккуратно пинцетом, отделить слизистой оболочки ectocervix и/или эндоцервикса от под стромы и мышечной ткани (подслизистой) с скальпель и лезвие для получения полосы слизистой.
   Примечание: Во время работы на один кусок ткани, важно сохранить остальной части ткани, погруженной в среде, чтобы избежать высыхания ткани.
4. Нарезать полоски 2 мм шириной слизистой оболочки, снимите и выбросьте столько подслизистой как можно, оставив только 2 мм толщиной слоя ткани. Вырежьте полосы в 2 мм толстой блоков. Это должно привести к ткани эксплантов примерно 8 мм³.
   Предупреждение: Острые инструменты обработки для того чтобы рассечь человеческих образцов увеличивает риск повреждения и загрязнения. Оператор должен рассмотреть носить металла, сетка, порезам перчаток в качестве дополнительной защиты.
5. Передача ткани эксплантов в новой 100 мм Петри, содержащих 10 – 20 мл во избежание высыхания ткани во время разбирательства с рассечение. В конце рассечение вихрем пластину в случайном порядке распределения экспланта.
6. Стерильным пинцетом передачи эксплантов в стерильных 1,5 мл Конические трубки (максимум 16 эксплантов в трубу). Удалите любые средства в трубе с помощью пипетки.
7. Оттепель ВИЧ-1 подготовки в водяной бане при температуре 37 ° C. При необходимости разбавьте запасов вируса с см. Передача вируса в трубки, содержащие эксплантов. Отменить любые остаточные вирус подготовки.
   Примечание: Вирус запас следует разбавить таким образом, чтобы выбранные посевным материалом содержится в объеме минимум 0,5 мл (Таблица 1). Чтобы уменьшить результат изменчивости между независимыми эксперименты, же вирус подготовки должны использоваться для всего исследования (Таблица материалов).
8. Передача трубы в термо шейкер и проинкубируйте втечение 2 ч при 37 ° C, покачиваясь на 300 об/мин. Аккуратно переворачивают трубы несколько раз каждые 30 – 60 мин.
   Примечание: Для эффективного инфекции, важно использовать минимальное время, необходимое между оттаивания ВИЧ-1 подготовки и передачи трубы до 37 ° C.
9. Заполните 6-ну тарелку с 3 – 4 мл на хорошо стерильных фосфатный буфер (PBS). При инкубации с ВИЧ-1, отбросить все вирус подготовки в трубки в контейнер с дезинфицирующим раствором с помощью пипетки. Передача эксплантов в пластину 6-а, содержащий PBS с помощью щипцов.
10. Разрешить эксплантов отдых в PBS 1 мин на RT и затем промойте их, мягко закупорить прихваченного PBS в колодец 2 - 3 раза. Выбросите PBS в контейнер с дезинфицирующим раствором с помощью пипетки. Добавьте 3 – 4 мл новой PBS в каждой скважине. Повторите еще два раза в общей сложности три автомойки. Выбросите PBS просто перед передачей эксплантов губки, чтобы избежать высыхания ткани.
    Примечание: Эксплантов слизистой оболочки шейки матки и в частности эндоцервикса, освободить большое количество слизи во время инфекции. Важно, чтобы вымыть и удалить столько слизь как можно скорее, потому, что неспецифические удержания на эксплантов и последующего выпуска в надосадке культуры вируса может маскировать репликации вируса.
11. С помощью щипцов, передачи 5-8 эксплантов поверх каждого желатин Губка в пластине 12-хорошо. Возвращение пластину в инкубаторе.
12. Удаление всех биологических отходов в подходящих контейнерах согласно правилам Института на обработку опасных биологических и оценки конкретных рисков.

5. Histoculture

1. Измените см каждые 3 дня, начиная с момента заражения до дня 12 – 15 послеоперационные инфекции. СМ и/или эксплантов можно отведать на регулярной основе на протяжении всего времени культуры оценки репликации ВИЧ-1 среди других параметров.
2. Положите см в ванне с водой, предварительно нагревают при 37 ° C.
   Примечание: Это не требуется для дополнения см с антибиотиком решение на данном этапе.
3. Собрать образец см с пипетки и перевести его в стерильных 1,5 или 2 мл колпачок трубки для хранения при температуре-80 ° C.
   Примечание: См от реплицировать скважин объединяются в коллекции.
4. Урожай ткани эксплантов стерильным пинцетом, удалить избыток среды на эксплантов, поместив их на листе бумаги (опционально) и передачи эксплантов в стерильных 1,5 или 2 мл трубки колпачок. Обрабатывать или хранить образцы тканей как предусмотрено эксперимент.
   Примечание: Для проточной цитометрии, эксплантов немедленно усваиваются с ферментативной коктейль для получения одной ячейки подвеска (для более подробную информацию см. ссылки 1, 9, 16 и 17). Для извлечения РНК эксплантов хранятся в РНК стабилизации раствор при температуре 4 ° C на ночь перед их сохранением в-80 ° C. Для экстракции ДНК или в situ окрашивание (шейка матки) эксплантов может оснастки замороженные в жидкого азота или сухого льда/этанол пульпы и хранится при температуре-80 ° C. В качестве альтернативы миндалин эксплантов может устанавливаться путем погружения в раствор PBS и 4% параформальдегида для пятнать в situ .
5. Аспирационная остаточного см в скважины с дозатор и отменить его в контейнер с дезинфицирующим раствором. Наклона пластины и осторожно надавите желатин губки в верхней части колодца разрешить средне-собрать на дне и затем аспирационная и отменить его.
6. Добавьте мл 3 – 4 см к каждой скважины. С помощью стерильный пинцет, возвращаемое любой ткани эксплантах, упал в средне-Губка желатина. Возвращение пластину в инкубаторе.
7. В конце культуры распоряжаться всех биологических отходов в подходящих контейнерах согласно правилам Института на обработку опасных биологических и оценки конкретных рисков.

Результаты

Некоторые методы могут использоваться для оценки репликации ВИЧ-1 в эксплантов ткани. Наши стандартные считывания необходимо измерить количество ВИЧ-1 p24_gag выпущен в см с течением времени с иммуноанализа¹⁸.

Эксплантов...

Обсуждение

Использование тканей человека эксплантах для изучения инфекции ВИЧ-1 обеспечивает преимущества над традиционными Би мерной и съедобные экспериментальных систем, таких как главные ячейки или клеточных линий, из-за их высокая способность воспроизводить межклеточных взаимодействий и С...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge	Pfizer	NDC:  0009-0315-08	Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue.
SPONGOSTAN Standard 70 × 50 × 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge	Ferrosan Medical Devices	MS0002	Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue.
RPMI 1640 with phenol red and glutamine	ThermoFisher Scientific	21875034	To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Modified Eagle's medium (MEM) non-essential aminoacids (100x)	ThermoFisher Scientific	11140035	To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Sodium pyruvate, 100 mM (100x)	ThermoFisher Scientific	11360070	To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Gentamicin 50 mg/mL (1000x)	ThermoFisher Scientific	15750037	To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Amphotericin B 250 μg/mL (100x)	ThermoFisher Scientific	15290018	To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Fetal bovine serum (FBS)			To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Ticarcillin disodium salt	Sigma-Aldrich	T5639-1G	Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3 g) and potassium clavulanate (100 mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT.
Potassium clavulanate	Sigma-Aldrich	33454-100MG	Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3 g) and potassium clavulanate (100 mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT.
Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red			To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage.
Sterile cell culture grade water
Sterile transportation container
70% ethanol solution
Disinfectant solution for biological waste disposal
Sterile metal forceps or tweezers
Sterile metal scissors
Sterile flat weighing metal spatula
Sterile scalpels and blades
6-well cell culture plates
12-well cell culture plates
Sterile Petri dish, 100 mm × 20 mm
Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL	NIH AIDS Reagent Program	510	The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing.
Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04	NIH AIDS Reagent Program	2522	The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing.
Lamivudine (3TC)	NIH AIDS Reagent Program	8146	Resuspend in DMSO at 10 mg/mL, aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing.
Biological safety cabinet
Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 °C, 5% CO2, ≥ 90% humidity
Water bath set at 37 °C
Sterile 1.5 and 2mL screw cap tubes
Dry bath shaker with heating block for 1.5 mL tubes, set at 37 °C, 300 rpm