È necessario avere un abbonamento a JoVE per visualizzare questo. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Method Article
Infezione dei tessuti umani con il virus di immunodeficenza umana (HIV) ex vivo fornisce un prezioso modello 3D della patogenesi del virus. Qui, descriviamo un protocollo per elaborare e infettare i campioni di tessuto da tonsille umane e delle mucose genitali femminile con HIV-1 e mantenerli nella cultura presso l'interfaccia liquido-aria.
Histocultures permettono di studiare le interazioni intercellulari all'interno dei tessuti umani, e possono essere impiegati per interazioni ospite-patogeno modello in condizioni di laboratorio controllate. Ex vivo l'infezione dei tessuti umani con il virus di immunodeficenza umana (HIV), tra altri virus, è stato utilizzato con successo per studiare la patogenesi della malattia precoce, così come una piattaforma per testare l'efficacia e la tossicità dei farmaci antivirali. Nel presente protocollo, spieghiamo come elaborare e infettare con HIV-1 espianti di tessuto umane tonsille e mucose cervicali e mantenute in coltura in cima spugne di gelatina all'interfaccia liquido-aria per circa due settimane. Questa impostazione non polarizzato cultura massimizza accesso alle sostanze nutrienti nel terreno di coltura e di ossigeno, anche se la perdita progressiva di architetture funzionali e l'integrità del tessuto rimane il suo limite principale. Questo metodo consente il monitoraggio replica di HIV-1 e patogenesi utilizzando diverse tecniche, tra cui test immunologici, qPCR e citometria a flusso. Di importanza, la variabilità fisiologica tra donatori di tessuti, nonché tra espianti provenienti da diverse aree del campione stesso, può incidere significativamente i risultati sperimentali. Per garantire la riproducibilità dei risultati, è fondamentale utilizzare un adeguato numero di espianti, replicati tecnici e controllo di donatore-pari condizioni per normalizzare i risultati dei trattamenti sperimentali durante la compilazione di dati provenienti da esperimenti multipli (cioè ., condotto utilizzando tessuti da donatori diversi) per l'analisi statistica.
Colture cellulari di bi-dimensionale monotipico, cui qui come convenzionale, non tengono conto la comunicazione spaziale e funzionale tra la grande varietà di tipi di cellule che compongono i tessuti e organi. Questo aspetto è di fondamentale importanza per modelli sperimentali della malattia, come interferenze con interazioni intercellulari omeostatici sono il fattore trainante di tutte le patologie. Espianti di tessuto offrono importanti vantaggi per la modellazione di salute e malattia in esseri umani perché mantengono la citoarchitettura e molti importanti aspetti funzionali degli organi come sono in vivo, anche se per un periodo limitato di tempo1. Ad esempio, all'ex vivo sfida con antigeni di richiamo, come il tossoide difterico o tossoide tetanico, tessuto tonsillar risponde con una vigorosa produzione di anticorpi specifici per l'antigene2. Come qualsiasi altro ex vivo modello, histoculture ha le proprie limitazioni: variabilità inter-donatore, polarizzazione di tessuto, sopravvivenza limitata del tessuto e la difficoltà nel monitoraggio celle oltre la profondità di microscopia confocale1. Espianti di tessuto umano rimangono comunque, un modello di scelta per lo studio dei processi immunologici omeostatici e patogeni in esseri umani, tra cui interazioni ospite-patogeno e potenziali interventi terapeutici3.
Gli eventi critici della patogenesi di HIV-1 si svolgono nei tessuti. Infezione della mucosa genitale rappresenta la maggior parte di tutti gli eventi trasmissione HIV-1 in tutto il mondo4. Tessuto linfoide è il sito principale di replicazione del virus durante l'infezione acuta e porti un significativo pool di cellule latente infettate5, e la loro persistenza rappresenta il principale ostacolo per ottenere una cura6. La sfida di cultura ed ex vivo dei tessuti mucosi e linfoidi umani forniscono alcuni vantaggi rispetto ai sistemi convenzionali basati su cellule isolate per lo studio del virus HIV-1. Per esempio, le cellule tessuto-residente possono supportare l'infezione HIV-1 in assenza di attivazione esogena, al contrario di cellule mononucleari di anima periferica1. L'utilizzo di espianti di tessuto linfoide ha permesso una migliore comprensione di alcuni meccanismi chiave alla base CD4 T cell lo svuotamentocioè, l' effetto bystander7, che è il segno dell'infezione acuta. Il mantenimento delle strutture come follicoli di cellule B del tessuto linfoide8 e l'epitelio in espianti di mucosa genitale femminile9 offre l'opportunità unica di integrare funzionalità spaziale e funzionale dell'infezione da HIV-1 in questi siti. Infine, histocultures sono stati usati con successo per modello e studio co-infezione da HIV-1 e herpesvirus10,11, così come per i test preclinici di antiretrovirali e multitarget microbicidi12, 13 , 14 , 15.
Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la cultura degli espianti di tessuto umano ottenuto da tonsille e tessuto mucoso dal tratto genitale femminile più basso (cervice), che copre la dissezione del tessuto per explant sfida con HIV-1 in un modo non polarizzato. La cultura degli espianti di tessuto all'interfaccia liquido-aria, utilizzando spugne di gelatina come supporto, massimizza l'esposizione ad aria ossigeno garantendo accesso alle sostanze nutrienti del terreno di coltura attraverso la spugna capillari, ritardando così il loro decadimento naturale. Il modo più immediato di valutazione replica di HIV-1 nel nostro sistema è quello di misurare la quantità di virus rilasciati nel terreno di coltura explant nel tempo di dosaggio immunologico o qPCR. Infezione da HIV-1 e la patogenesi (ad es., deplezione delle cellule T CD4 +) possono anche essere valutati in espianti di tessuto dalla mole estrazione di RNA/DNA e qPCR, in situ macchiatura o singola cellula-analisi sulla digestione del tessuto tramite flusso cytometry.
Il protocollo per la raccolta di tessuti umani può richiedere approvazione etica dalle autorità locali competenti. In caso di interventi chirurgici indicati come la tonsillectomia e l'isterectomia, i campioni non sono raccolti specificamente per scopi di ricerca e lo studio non è ricerca di soggetti umani (National Institutes of Health. Ricerca su soggetti umani. https://humansubjects.nih.gov/Walkthrough-Investigator#tabpanel11). Tuttavia, ottenere dati personali e medici donatori di tessuti (ad es., sesso, età, attuale uso di droga, storia di infezioni, ecc.) che possono aiutare a interpretare i risultati sperimentali, pone preoccupazioni circa il consenso informato e privacy che devono essere affrontati nel protocollo per la raccolta del tessuto.
Attenzione: L'intera procedura deve essere effettuata in una cappa di sicurezza biologica. Tutti i campioni umani, compresi quelli da individui 'sani', possono harbor agenti infettivi. L'operatore deve ricevere formazione al lavoro con agenti patogeni anima-sopportati per gestire in sicurezza i campioni di tessuto, anche se gli esperimenti non implicano l'uso di HIV. Una valutazione dei rischi della procedura di dissezione del tessuto e dell'infezione da HIV deve avvenire da personale qualificato per garantire la sicurezza dell'operatore e colleghe. L'uso di infettive HIV richiede biosicurezza dedicato tra gli ambienti di livello 2 o 3 a seconda del paese e Istituto specifici regolamenti su biologicals pericolosi e patogeni presenti nel sangue.
1. preparazione di spugne di gelatina
Nota: Sebbene non sia strettamente necessario preparare le spugne di gelatina prima dissezione del tessuto, è più comodo seguire l'ordine indicato qui, soprattutto quando si gestisce una grande quantità di tessuto e/o da molti donatori.
2. dissezione del tessuto Tonsillar umano
Nota: Le tonsille devono essere elaborate più presto dopo la chirurgia, idealmente il giorno stesso dell'intervento. In alternativa, i campioni possono essere lasciati CMT sommerso in una notte a 4 ° C.
3. infezione del tessuto Tonsillar espianti con HIV-1
Nota: Per ridurre la variabilità di risultato tra esperimenti indipendenti, la stessa preparazione di virus dovrebbe essere usata per un intero studio. Virus può essere propagato in cellule mononucleari del sangue periferico esogenicamente attivato e quindi surnatante della cultura può essere aliquotati per conservazione a-80 ° C per evitare ripetuti di congelamento e scongelamento (Tabella materiali).
4. dissezione e infezione della Mucosa cervicale uterina
Nota: Per risultati ottimali, espianti di mucosa cervicale dovrebbero essere elaborate e infettati appena possibile dopo la chirurgia, idealmente il giorno stesso dell'intervento. In alternativa, i campioni possono essere memorizzati sommerso in CMT a 4 ° C durante la notte e infetta immediatamente dopo la dissezione.
5. Histoculture
Diverse tecniche possono essere utilizzati per valutare la replica di HIV-1 in espianti di tessuto. La nostra lettura standard è di misurare la quantità di HIV-1 p24gag rilasciati in CM nel tempo con un immunoassay18.
Espianti di tessuto da diversi donatori, infettati con l'inoculo stesso dello stesso stock, HIV-1, possono produrre diverse quantità di virus (tabella 1). Ques...
L'uso di tessuti umani espianti per lo studio dell'infezione da HIV-1 fornisce vantaggi rispetto ai tradizionali sistemi sperimentali bi-dimensionale e l'unica specie, quali cellule primarie o linee cellulari, grazie alla loro capacità superiore di riprodurre interazioni intercellulari e cellulare (per esempio, la produzione di citochine) funzioni così come sono nel vivo. Tuttavia, tessuto tonsillar e cervicale differiscono per molti aspetti, tra cui il numero e le caratteristiche fenotipiche e funzio...
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Quest'opera è stata sostenuta da sovvenzioni da parte della Fondazione Blanceflor Boncompagni Ludovisi nee Bildt (http://blanceflor.se/), i medici svedesi di Fondazione contro l'AIDS (http://www.aidsfond.se/, Rif. FOa2014-0006) e Fondazione Andrea e Libi Lorini (http : / / fondazionelorini.it/) a Andrea Introini.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge | Pfizer | NDC: 0009-0315-08 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
SPONGOSTAN Standard 70 × 50 × 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge | Ferrosan Medical Devices | MS0002 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
RPMI 1640 with phenol red and glutamine | ThermoFisher Scientific | 21875034 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
Modified Eagle's medium (MEM) non-essential aminoacids (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140035 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
Sodium pyruvate, 100 mM (100x) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
Gentamicin 50 mg/mL (1000x) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
Amphotericin B 250 μg/mL (100x) | ThermoFisher Scientific | 15290018 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
Fetal bovine serum (FBS) | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). | ||
Ticarcillin disodium salt | Sigma-Aldrich | T5639-1G | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3 g) and potassium clavulanate (100 mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
Potassium clavulanate | Sigma-Aldrich | 33454-100MG | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3 g) and potassium clavulanate (100 mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red | To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage. | ||
Sterile cell culture grade water | |||
Sterile transportation container | |||
70% ethanol solution | |||
Disinfectant solution for biological waste disposal | |||
Sterile metal forceps or tweezers | |||
Sterile metal scissors | |||
Sterile flat weighing metal spatula | |||
Sterile scalpels and blades | |||
6-well cell culture plates | |||
12-well cell culture plates | |||
Sterile Petri dish, 100 mm × 20 mm | |||
Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL | NIH AIDS Reagent Program | 510 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04 | NIH AIDS Reagent Program | 2522 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
Lamivudine (3TC) | NIH AIDS Reagent Program | 8146 | Resuspend in DMSO at 10 mg/mL, aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
Biological safety cabinet | |||
Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 °C, 5% CO2, ≥ 90% humidity | |||
Water bath set at 37 °C | |||
Sterile 1.5 and 2mL screw cap tubes | |||
Dry bath shaker with heating block for 1.5 mL tubes, set at 37 °C, 300 rpm |
Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE
Richiedi AutorizzazioneThis article has been published
Video Coming Soon