Ex Vivoひと免疫不全ウイルス 1 における抗癌剤感受性との人間のリンパ組織と女性の性器粘膜の感染症

要約

人間組織前のヴィヴォひと免疫不全ウイルス (HIV) の感染は、ウイルスの病因の貴重な 3 D モデルを提供します。ここでは、処理や扁桃腺 HIV - 1 女性生殖器の粘膜からの組織標本に感染し、液体空気インターフェイスで文化でそれらを維持するためのプロトコルについて述べる。

要約

Histocultures 許可ひと臓器内の細胞間の相互作用を研究し、彼らは管理された実験室の条件の下でモデル宿主-病原体相互作用を用いることができます。他のウイルスとの間でひと免疫不全ウイルス (HIV) 人間組織の前のヴィヴォの感染症は、有効性と抗ウイルス薬の毒性をテストするためのプラットフォームと同様に、初期の病気の発症を調査する正常に使用されています。この議定書では、処理し HIV 1 組織植扁桃腺と子宮の粘膜から感染し、約 2 週間、液体空気インターフェイスでゼラチン スポンジの上に文化でそれらを維持する方法を説明します。この非偏光のカルチャ設定は、組織の完全性および機能のアーキテクチャの進歩的な損失のまま、主に制限が培養液中の酸素、栄養素へのアクセスを最大化します。このメソッドは、HIV-1 のレプリケーションおよび病因イムノアッセイ、qPCR、フローサイトメトリーなどいくつかの手法を使用して監視できます。重要性、組織ドナー間および、同一体のさまざまな分野から植の生理学的変動実験結果大幅影響可能性があります。結果の再現性を確保する植、技術的複製およびドナーをマッチさせた対照条件の十分な数を使用して、複数の実験からのデータをコンパイルするときに実験的治療の結果を正規化するが重要です (つまり、. 異なるドナーからの組織を使用して行われた、) 統計分析のため。

概要

従来、ここと呼ばれる、単型 bi 三次元細胞培養は、多種多様な組織を構成する細胞の種類や臓器間の機能的な空間通信には考慮されません。この側面は、恒常性細胞間相互作用との干渉はすべて病理の運転の要因の病気の実験モデルにとって非常に重要です。組織移植片は、健康と人間の病気をモデリングするため、彼らは¹時間の限られた量の生体内で、細胞構築と臓器の多くの重要な機能的側面保持の主要な利点を提供しています。たとえば、ジフテリアや破傷風トキソイドなどのリコール抗原チャレンジ前のヴィヴォに扁桃組織は抗原特異的抗体²の積極的な生産で応答します。他前のヴィヴォのモデルのようなにおける抗癌剤感受性が独自の制限: 間ドナーの可変性、組織偏波、限られた組織生存し、共焦点顕微鏡¹の深さ以外のセルの監視の難しさ。それにもかかわらず、人間の組織移植片宿主-病原体相互作用および潜在的な治療上の介在の³を含む人間の恒常性と病原性の免疫学的プロセスを研究する選択のモデルのまま。

HIV 1 病因の重要なイベントは、組織の場所を取る。性器の粘膜の感染症は、すべて HIV 1 伝送イベント世界⁴の大半を占めています。リンパ組織は急性感染症の中にウイルスの複製の主要なサイトだと潜伏感染細胞⁵の重要なプールを港湾、その粘り強さは治療⁶を達成するために主要な障害を表します。人間のリンパ球、粘膜組織の文化と前のヴィヴォの挑戦は、HIV-1 の調査のための隔離されたセルに基づく従来のシステム上のいくつかの利点を提供します。例えば、住民組織細胞は、末梢血単核細胞の¹ではなく、外因性の活性化の不在で hiv-1 感染をサポートできます。リンパ組織外植片の使用は急性感染症の認刻極印である cd4 陽性 T 細胞の枯渇、すなわち、傍観者効果⁷、基になるいくつかの主なメカニズムの理解できました。B 細胞濾胞リンパ組織⁸と女性性器粘膜外植体⁹の上皮のような構造の保全では、これらのサイトでの HIV-1 感染の空間と機能の機能を統合するユニークな機会を提供しています。最後に、histocultures 正常に使用されたモデルと HIV とヘルペス ウイルス感染^10、11検討、抗レトロ ウイルス薬と多標的殺菌^12,の前臨床試験^13,14,15。

ここで、非偏光の方法で HIV - 1 のチャレンジを外植体に組織郭清をカバーして扁桃腺と下の女性性器 (子宮頸部) から粘膜組織から得られた人体組織外植片の培養のための詳しいプロトコルを説明します。液体空気インターフェイス、サポートは、ゼラチン スポンジを用いた組織分化の文化は、それ故に自然な腐食、毛細血管を通してスポンジ培地栄養へのアクセスを提供しながら酸素を空気への露出を最大化します。体制における hiv-1 増殖の評価の最も直接的な方法は、免疫または qPCR によって時間をかけて植培にリリースされたウイルスの量を測定することです。HIV-1 感染症と病態 (e.g。、cd4 陽性 T 細胞の枯渇) フローサイトメトリーによる一括 RNA/DNA の抽出によって組織を外植体と qPCR、その場で汚すか、またはティッシュの消化時に単一細胞分析でも評価できます。

プロトコル

人間のティッシュのコレクションのためのプロトコルは、地元当局による倫理的な承認を必要があります。扁桃摘出術、子宮摘出術など、指定された手術の場合、標本は研究目的のため収集されていません、調査不可能であるヒトにおける研究 (健康の国民の協会。人間の題材の研究。https://humansubjects.nih.gov/walkthrough-investigator#tabpanel11)。ただし、組織ドナーの個人情報や医療データを取得 (e.g、セックス、年齢、現在の薬物使用、感染症等の歴史) インフォームド コンセントとする必要がありますプライバシー懸念をポーズの実験結果の解釈に役立つ可能性がありますする。組織のコレクションのためのプロトコルで対応します。

注意: 全体の手順が生物学的安全キャビネットで実施している必要があります。'健康' の個人からのそれらを含むすべての人体標本は、感染性病原体を抱く可能性があります。オペレーターは、実験が HIV の使用を伴わない場合でも組織検体を安全に処理する血液媒介病原体で動作する訓練を受ける必要があります。組織切離および HIV 感染のプロシージャのリスク アセスメントは、オペレーターと協力者の安全性を確保するための訓練を受けたスタッフによって実施必要があります。感染 HIV の使用には、国と危険な生物学的製剤、血液媒介病原体研究所固有の規制によって専用のバイオ セーフティ レベル 2 または 3 の環境が必要です。

1. ゼラチン スポンジの準備

注: 厳密に組織切離前にゼラチン スポンジを準備する必要はないが、多くのドナーからおよび/または組織の大規模な量を処理する場合など、ここで概説する順序に従うより便利です。

1. 培 (CM) を準備し、CMT (資材表) をするために使用する前に抗生物質溶液 (Tircacillin クラブラン酸ミックス) でそれを補います。任意の残りの抗生物質溶液を破棄します。
   注: チカルシリン、CMT のクラブラン酸が不十分な安定です。必要な場合、抗生物質溶液で CMT を補う準備から約 24 時間後再。それは文化の中に媒体ごとの 24 h を外植体に抗生物質のソリューションを追加する必要はありません。
2. CMT の約 20-30 mL で、100 mm × 20 mm のペトリ皿を埋めます。
   注: この設定は、2 つ 6 ウェル プレートまたは 1 つ 12 ウェル プレートの時に十分なゼラチン スポンジを準備するが最適です。多くのプレートが必要な場合は、準備をスピードアップする広いペトリ皿と CMT の大きいボリュームを使用します。
3. 滅菌の鉗子を用いたペトリ皿にゼラチン sponge(s) を転送します。両側にスポンジのウェット、1 分は滅菌のへらを使用して約 2 分のペトリ皿の底にスポンジを押すために媒体を吸収するスポンジができます。
   注: スポンジの気泡の存在が、培養液中の栄養素に達する組織の毛細血管をブロックするため、この手順は非常に重要です。ゼラチン スポンジは水分を取り除かれるとき非常に壊れやすいです。優しく押し、スポンジ、特に初めに、スパチュラでスポンジを壊さないようにします。
4. 使用滅菌はさみ約 1 cm²の同じサイズの部分に水分を補給されたゼラチン スポンジをカットします。培養プレートの各ウェルに鉗子を使用して 1 のスポンジ部分を転送します。12 ウェル プレート (頸部) に 6 ウェル プレート (扁桃)、ウェルあたり 1 mL を各ウェルに CMT の 3-4 mL を追加します。インキュベーター、組織分化はスポンジにロードする準備ができているまでに 37 ° C、5% CO₂、≥ 90% の湿度設定にプレートを配置します。
   注意: プレートに追加する CMT のボリュームは、液体空気インターフェイスで植を保つためにスポンジの厚さに調整する必要があります。

2. 人間の扁桃組織の郭清

注: 扁桃腺処理するか手術後できるだけ早く理想的な手術の当日。また、供試体のままでかまいません一晩で浸水した CMT 4 ° C

1. CM を許可する十分な時間に部屋の温度 (RT) を到達するか水のお風呂に入れては 37 ° C に加温使用する前に、抗生物質溶液 (CMT) で CM を補足します。残った抗生物質ソリューションを破棄します。鉗子、メス、術の中に必要なときに吸収する清潔な容器に 70% エタノール溶液を注ぐ。道具の清掃し、異なるドナーからの標本の解剖の間メスの刃を変更します。
2. 滅菌鉗子による CMT の 10-20 mL を含んでいる 100 mm ペトリ皿に輸送用コンテナーから扁桃腺を転送します。
   注: 焼灼、血まみれの広範な地域の標本または壊死組織を破棄しなければなりません。
3. 組織を解剖するのに切断面として、シャーレの蓋を使用します。鉗子で組織を優しく押し、生殖不能のメスとブレードを使用していくつかの大きな部分に各扁桃をカットします。
   注意: 人間の標本を解剖するハンドリング シャープ ツールの負傷や汚染のリスクが高まります。演算子は、さらに保護金属、メッシュ、カット耐性の手袋を着用を検討してください。
4. 焼灼、流血、削除と子宮筋腫の組織、および任意のパーツ tonsilloliths (石灰素材) を含んでいるおよび/または鉗子やメスを使用してグリーンがかった色。
   注: 組織の 1 つの作品に取り組んでいるそれは組織の乾燥を避けるために中に沈んで組織の残りの部分を保つことが重要。
5. 厚さ約 2 mm のスライスに各組織の部分をカットします。前の手順と同様に任意の不要な部分を削除します。組織スライスを 2 mm 厚の短冊状にカットします。2 mm 厚のブロックに組織のストリップをカットします。これは約 8 mm³の組織移植片になります。
6. 郭清を進める中組織の乾燥を避けるために CMT の 10-20 mL を含む新しい 100 mm のペトリ皿に植を転送します。郭清の終わり、植分布をランダムにプレートを旋回します。場所 9 組織はそれらの間のスペースを許可する鉗子を用いた 6 ウェル プレート各ゼラチン スポンジの上に外植片します。プレートをインキュベーターに戻ります。
   注: 通常、外植片を培養している一晩と HIV - 1 文化の接種が次の日に実行されます。これは文化で成長する細菌や真菌の汚染がないことを確認することです。さらに、細胞は、郭清後扁桃組織移植片の出口へ傾向があります。このプロセスは文化¹の最初の 24 時間以内に完了主。
7. 危険な生物学的製剤と特定のリスク評価の処理の研究所の規制によるとしっくり来る容器にすべての生物学的廃棄物の処分します。

3. 扁桃組織の感染は、HIV - 1 外植片します。

注: 間の独立した実験結果のばらつきを減らすためには、ウイルスと同じ準備は全体の研究のため使用する必要があります。外因活性化末梢血単核細胞でウイルスを伝播できるでき、培養上清中-80 ° C で保存用検体繰り返し凍結と融解 (資材表) を避けるために。

1. 37 ° C に加温水槽に CM を入れてください。使用する前に、抗生物質溶液 (CMT) で CM を補足します。任意の残りの抗生物質溶液を破棄します。
2. ピペットで 6 ウェル プレートで培地を吸引し、消毒液の容器に捨てます。プレートを傾けるし、ゼラチン スポンジを下部に、収集し、吸引、それを破棄する媒体を許可する井戸の上部を軽く押してください。各ウェルに CMT の 3-4 mL を追加します。
3. 37 ° C の水浴の HIV-1 ウイルス準備を解凍します。必要に応じて、ウイルス ストック CM (表 1) に希釈します。
   注: 選択した接種が 5-8 μ L (表 1) のボリュームに含まれているようにウイルス ストックを希釈する必要があります。効率的な感染症、HIV 1 準備を融解し、感染組織移植片の間に必要な最小時間を使用する重要です。
4. ゼラチン スポンジに 9 外植片のそれぞれの上に直接ウイルスの接種材料をピペットします。感染が完了次第、プレートをインキュベーターに戻ります。任意の残留ウイルスの準備を破棄します。セクション 5 に進みます。
   注: オペレーター ウイルスの接種材料を正確に提供するには、リバース ピペット法を使用して、すべての井戸のためのヒントを変更することを検討する必要があります。この際に、ウイルスの接種材料を描画するパージ位置 (2 段目) の下にピペットのピストンを押すと小さな繰り返しサンプリングに関連付けられている最小のバブル形成とエラーことができます菌を提供する最初のピット ストップを押すボリューム、すなわち5-8 μ L。

4. 解剖、子宮頸部の粘膜の感染症

注: 最適な結果を得るには、子宮頸部の粘膜の処理、理想的には手術の当日、手術後できるだけ早く感染します。また、4 ° c 夜間、CMT の水中に、感染は郭清後すぐに標本の保存ができます。

1. CM を許可する RT に到達または水のお風呂にそれを置くのに十分な時間で 37 ° C に加温使用する前に、抗生物質溶液 (CMT) で CM を補足します。任意の残りの抗生物質溶液を破棄します。鉗子、メス、術の中に必要なときに吸収する清潔な容器に 70% エタノール溶液を注ぐ。道具の清掃、複数のドナーからの標本の解剖の間メスの刃を変更します。
2. 滅菌鉗子を使用すると、100 mm ペトリ皿 CMT の 10-20 mL を含む輸送用コンテナーからサンプルを転送します。
3. 切断面としての組織を分析するのに、シャーレの蓋を使用します。間質の下からコルポ子宮頸膣部の粘膜を分離、鉗子で組織を優しく保持し、粘膜のストリップをメス刃を取得すると筋組織 (粘膜)。
   注: 組織の 1 つの作品に取り組んでいるそれは組織の乾燥を避けるために中に沈んで組織の残りの部分を保つことが重要。
4. 2 mm 幅の短冊状に粘膜をカットを削除し、組織の 2 mm 厚層のみを残し、できるだけ多く粘膜を破棄します。2 mm 厚のブロックにストリップをカットします。これは約 8 mm³の組織移植片になります。
   注意: 人間の標本を解剖するハンドリング シャープ ツールの負傷や汚染のリスクが高まります。演算子は、さらに保護金属、メッシュ、カット耐性の手袋を着用を検討してください。
5. 郭清を進める中組織の乾燥を避けるために CMT の 10-20 mL を含む新しい 100 mm のペトリ皿に転送組織植。郭清の終わり、植分布をランダムにプレートを旋回します。
6. 滅菌ピンセットで滅菌 1.5 mL コニカル尿管 (チューブあたり最大 16 植) に植を転送します。ピペットを使用して管の任意のメディアを削除します。
7. 37 ° C の水浴の HIV-1 準備を解凍します。必要に応じて、外植片を含む尿管に cm 転送ウイルス ウイルス株を希釈します。任意の残留ウイルスの準備を破棄します。
   注: 選択した接種が最小 0.5 mL (表 1) のボリュームに含まれているように、ウイルス ストックを希釈する必要があります。間の独立した実験結果のばらつきを減らすためには、全体の研究 (材料表) のウイルスと同じ準備を使用ください。
8. サーモ シェーカーにチューブを転送し、300 rpm でロッキング 37 ° C で 2 時間インキュベートします。優しく数回 30-60 分毎、チューブを反転します。
   注: 効率的な感染、重要である HIV 1 準備を融解とチューブを 37 ° c. に転送する間に必要な最小時間を使用するには
9. 3-4 ml の滅菌リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) ウェルあたり 6 ウェル プレートを埋めます。Hiv-1 潜伏のピペットを使用して消毒液の容器に、尿管にすべてのウイルスの準備を破棄します。鉗子を使用して PBS を含む 6 ウェル プレートに植を転送します。
10. PBS で常温では、1 分の残りの部分に外植体を許可して、洗って軽くピペッティングによる上下 PBS 同様に 2-3 回。ピペットを使用して消毒液を容器に PBS を破棄します。各ウェルに新しい PBS の 3-4 mL を追加します。3 つの洗浄の合計にさらに 2 回を繰り返します。ただ組織の乾燥を避けるためにスポンジに植を転送する前に、PBS を破棄します。
    注: 植特定コルポ、子宮頸部の粘膜の伝染の間に粘液の偉大な量をリリースします。洗って、外植体とウイルスの培養上清中に後続のリリースの不明確な保存管理機能は、ウイルスの複製を隠すことができるので、できるだけ多くの粘液を削除するが重要です。
11. 鉗子を使用すると、5-8 植 12 ウェル プレート各ゼラチン スポンジの上に転送します。プレートをインキュベーターに戻ります。
12. 危険な生物学的製剤と特定のリスク評価の処理の研究所の規制によるとしっくり来る容器にすべての生物学的廃棄物の処分します。

5. における抗癌剤感受性

1. 感染後 12-15 日までの感染症の時間から始まって 3 日おきを CM に変更します。CM や植は、文化の時間中その他のパラメーターの間での HIV-1 レプリケーションを評価するために定期的にサンプリングできます。
2. 37 ° C に加温水槽に CM を入れてください。
   注: この段階で抗生物質溶液で CM を補足する必要はありません。
3. ピペットと CM のサンプルを収集し、-80 ° C で保存用滅菌 1.5 または 2 mL スクリュー キャップ尿管に転送
   注: レプリケート井戸から CM にコレクションでプールされます。
4. 滅菌鉗子で組織分化を収穫、(省略可能)、一枚の紙にそれら置くことによって外植片の余分な媒体を取り外し、植滅菌 1.5 または 2 mL スクリュー キャップ尿管に。プロセスまたは実験によって必要に応じて組織サンプルを格納します。
   注: フローサイトメトリー用 (詳細は、詳細を参照してください 1、9、16、および 17) 単一細胞懸濁液を取得する酵素カクテルではすぐに植が消化します。RNA の抽出、植 4 ° C で RNA 安定化ソリューションに保持は-80 ° C で保存する前に一晩植のスナップ-凍結液体窒素やドライアイス ・ エタノール液、-80 ° C で保存されている DNA の抽出やその場で染色 (子宮頸部) は、また、その場で汚損のため PBS、4% のパラホルムアルデヒドのソリューションで水没によって扁桃植を固定できます。
5. 吸引ピペットによく残留 CM と消毒液の容器に捨てます。プレートを傾けるとゼラチン スポンジを下部に、収集するために媒体を許可する井戸の上部を軽く押して、吸引および破棄します。
6. CM の 3-4 mL を各ウェルに追加します。滅菌鉗子を使用すると、任意の組織はゼラチン スポンジの中にドロップを外植体を返します。プレートをインキュベーターに戻ります。
7. 文化の終わりには、有害な生物学的製剤と特定のリスク評価の処理の研究所の規制によるとしっくり来る容器にすべての生物学的廃棄物の処分します。

結果

いくつかのテクニックは、組織移植片の hiv-1 増殖を評価するために使用できます。私たちの標準読み出しは、HIV 1 p24_ギャグイムノアッセイ¹⁸CM で順次リリースの量を測定することです。

同じ HIV 1 在庫の同じ菌に感染している別のドナーからの組織移植片は、異なる量のウイルス (表 1

ディスカッション

人間の組織の使用の HIV-1 感染症の研究を提供する初代培養細胞や細胞、細胞間相互作用を再現する優れた性能によりなどの双方向次元と単型従来の実験システム上の利点を外植体と携帯電話は、彼らは体内の、(例えばサイトカイン産生) 機能します。それにもかかわらず、扁桃と頸の組織番号、HIV ターゲット セル^1,16の表現型および?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge	Pfizer	NDC:  0009-0315-08	Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue.
SPONGOSTAN Standard 70 × 50 × 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge	Ferrosan Medical Devices	MS0002	Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue.
RPMI 1640 with phenol red and glutamine	ThermoFisher Scientific	21875034	To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Modified Eagle's medium (MEM) non-essential aminoacids (100x)	ThermoFisher Scientific	11140035	To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Sodium pyruvate, 100 mM (100x)	ThermoFisher Scientific	11360070	To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Gentamicin 50 mg/mL (1000x)	ThermoFisher Scientific	15750037	To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Amphotericin B 250 μg/mL (100x)	ThermoFisher Scientific	15290018	To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Fetal bovine serum (FBS)			To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Ticarcillin disodium salt	Sigma-Aldrich	T5639-1G	Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3 g) and potassium clavulanate (100 mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT.
Potassium clavulanate	Sigma-Aldrich	33454-100MG	Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3 g) and potassium clavulanate (100 mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT.
Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red			To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage.
Sterile cell culture grade water
Sterile transportation container
70% ethanol solution
Disinfectant solution for biological waste disposal
Sterile metal forceps or tweezers
Sterile metal scissors
Sterile flat weighing metal spatula
Sterile scalpels and blades
6-well cell culture plates
12-well cell culture plates
Sterile Petri dish, 100 mm × 20 mm
Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL	NIH AIDS Reagent Program	510	The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing.
Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04	NIH AIDS Reagent Program	2522	The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing.
Lamivudine (3TC)	NIH AIDS Reagent Program	8146	Resuspend in DMSO at 10 mg/mL, aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing.
Biological safety cabinet
Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 °C, 5% CO2, ≥ 90% humidity
Water bath set at 37 °C
Sterile 1.5 and 2mL screw cap tubes
Dry bath shaker with heating block for 1.5 mL tubes, set at 37 °C, 300 rpm