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  • 摘要
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  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

该通讯描述了从人类和小鼠模型中分离和培养肺泡巨噬细胞的方法, 以供实验之用。

摘要

肺泡巨噬细胞是末期分化的, 肺部驻留的巨噬细胞。肺泡巨噬细胞在其漫长的生命中是独一无二的, 它们在肺发育和功能方面的重要作用, 以及它们对感染和炎症的肺部局部反应。迄今为止, 没有统一的方法来识别, 隔离和处理的肺泡巨噬细胞从人和小鼠存在。这种方法是必要的研究这些重要的先天免疫细胞在各种实验设置。这里描述的方法可以很容易地被任何实验室采用, 是一种从支气管肺泡灌洗液或肺组织中获取肺泡巨噬细胞和维持它们的体外的简化方法。由于肺泡巨噬细胞主要发生在肺泡中的黏附体细胞, 所以这种方法的重点是在收获和鉴定之前逐出。肺是一种高度血管化的器官, 各种细胞类型的髓和淋巴源栖息, 相互作用, 并受肺部微环境的影响。通过使用这里描述的一组表面标记, 研究人员可以很容易和明确地区分肺泡巨噬细胞与其他白细胞, 并净化它们的下游应用。本发明的培养方法支持人和小鼠肺泡巨噬细胞用于体外生长, 并与细胞和分子研究相适应。

引言

肺微环境是一个独特的复杂的生态系统, 具有精心设计的空气导管和血管。吸入的空气通过气管和通过许多分支支气管和性细支气管在到达肺泡之前, 那里血液空气气体交换发生。由于与大气层的直接相互作用, 呼吸表面需要保护, 免受空气微粒和污染物的潜在有害影响。一些物理、化学和免疫屏障保护肺部。值得注意的是, 在呼吸表面部署吞噬是一项重要的一线防御系统。肺泡巨噬细胞 (AMs) 是肺吞噬的一种类型, 它们构成了肺巨噬细胞的绝大部分。顾名思义, AMs 主要定位于肺泡腔, 并作为无梗细胞持续取样周围环境, 并与肺泡上皮1进行通信。在稳态肺中, 95% 以上的吞噬在肺泡空间是 AMs2, 其组成可能会改变, 由于炎症, 感染, 或长期接触污染物。

AMs 参与范围广泛的功能, 可能是局部的肺部和/或系统的重要性。例如, AMs 对肺部的发育和最佳功能至关重要;免疫监测;和清除细胞碎片、入侵病原体和吸入微粒3,4,5,6,7。有针对性地耗尽 AMs, 损害呼吸病毒和细菌的清除,4,8。除了作为吞噬和一线防御者的肺稳态, AMs 是已知的功能作为抗原呈现细胞诱导 T 细胞免疫9, potentiating 鼻腔疫苗的功效10和肺移植后肺限制自身免疫的影响11,12。AM 功能不足已与肺肺泡支持下肺泡 (PAP) 相关联, 这是由基因突变、恶性肿瘤或感染损害肺表面活性剂清除率13, 14 的条件造成的.目前正在探索 AMs 移植治疗 PAP 1516的治疗方法。

AMs 是已知的起源于胚胎发生过程中, 并坚持在整个生命中的肺部, 而不被循环白细胞取代2,17。虽然, 在稳态肺中, am 的营业额是无法检测到的, 但在某些临床情况下, 有不同程度的 am 更替, 包括感染流感病毒4、清髓性照射18、接触内毒素19和老年20。AMs 被认为通过低级别的增生17,21进行自我更新, 但最近的一些研究声称单核细胞可以引起血管内肺巨噬细胞的数量22,23下实验条件, 但这些新转换的肺巨噬细胞的功能尚未定义在肺部疾病。此外, 在 AM 活化的背景下, 了解刺激的阈值是一个潜在的有趣的领域, 因为肺试图保持炎症信号和免疫调节机制之间的平衡。

导致免疫调节丧失的生理或病理改变对于评估各种临床环境 (例如,呼吸道感染、炎症性肺病和纤维化肺病) 是很重要的。然而, AMs 越来越被认为是肺健康的指标, 甚至是决定因素,11,24。目前, 尚无统一的协议可用于收割、鉴定和/或维持来自人类和前小鼠模型的 AMs。对 am 前体和表型缺乏共识, 缺少详细的方法是破译 AM 在肺部健康和疾病中作用的主要障碍。下面的协议提供了一个明确的标识、隔离和体外文化策略, 它将极大地促进对 am 行为的理解, 并促进有针对性的诊断和治疗研究。

研究方案

这里所描述的所有方法都已被 IACUC 医院和医疗中心的机构动物护理和使用委员会 (IRB) 和机构审查委员会批准。

1. 从小鼠支气管肺泡灌洗 (球) 液中分离 AMs

  1. 麻醉一个八周大的 C57BL/6 老鼠与氯胺酮 (87.5 毫克/千克体重) 和甲苯噻嗪 (12.5 毫克/千克体重) 鸡尾酒通过腹腔注射。当老鼠获得手术麻醉, 失去反射和肌肉松弛。
  2. 将鼠标放在解剖表面, 侧面朝上。应用眼科兽医软膏, 防止脱水, 用70% 异丙醇饱和无菌的酒精准备垫擦拭小鼠的整个腹面, 以进行消毒。
  3. 装上所有四条腿克制的老鼠。
  4. 用微解剖工具轻轻地打开腹腔。必须注意尽量打开尽可能多的区域, 而不损害内脏器官或制造悬垂组织。
  5. 通过纵隔缓慢切开胸腔, 轻轻地打开胸廓。理想情况下, 肋骨笼可以从一侧到一侧切除。在打开胸腔时, 必须格外小心, 不要伤害肺部的胸膜。
  6. 定位下腔静脉, 并进行切口出血鼠标。使用吸收棉垫吸收血液。
  7. 将10毫升冰寒磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 注入右心室 (使用10毫升注射器和25G 针) 冲洗循环血细胞。用吸收棉垫吸收血液流动。一旦完全灌注, 肺部将出现脱皮, 然后准备冲洗。
  8. 轻轻切开颈部的皮肤和肌肉以暴露气道。小心地切除相邻的肌肉、软骨和脂肪组织, 而不损害气管。
  9. 在喉后部的气管上做一个小切口 (< 2 毫米)。这个切口应该只是足够插入导管进入, 而气管仍然连接到喉。插入一个1英寸的22G 导管, 没有针进入气管向肺部。用丝编织缝线 (4-0; 不可吸收) 用方形结固定导管。
    注: 导管需要根据鼠标大小进行修整。在灌洗过程中, 极短或长的导管往往会泄漏和/或撕裂气道。导管长度应如此, 当充分插入尖端保持良好的气管内, 而不是到达主支气管。
  10. 将1毫升注射器装满冰冷的球缓冲器 (Ca2 +和 Mg2 +免费 PBS + 1 毫米乙二胺四乙酸, EDTA) 到导管中, 慢慢将缓冲液注入肺部。这会使肺部膨胀。将注射器固定在导管上五秒钟, 然后轻轻拉动活塞, 然后吸入灌洗液。这会使肺部降温。在冰上放置15毫升锥形管中的液体。
  11. 重复步骤1.10 九次, 并池灌洗液。不要超过1毫升的缓冲每冲洗, 因为这可能超过肺容量, 并导致其破裂。
  12. 通过 IACUC 批准的协议, 将鼠标与 CO2过量弄死。
  13. 离心机10毫升的液体在 250 x g 4 °c 10 分钟。细胞颗粒含有球细胞。
    警告:颗粒可能很小, 所以在吸上清液时要小心。
  14. 并用重悬在 100 ul 的流动/排序缓冲 (PBS + 2% 的热灭活胎牛血清 (血清) + 1 毫米 EDTA + 25 毫米 N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic 酸 (HEPES) 中的球细胞。
  15. 通过添加小鼠 fc 块 (克隆 2.4G2, 10 微克/毫升), 并在冰上孵化20分钟, 阻止非特异性抗体绑定到 Fc 受体。
  16. 执行抗体染色与荧光减一 (FMO) 和单污点控制11,25。用细胞分析仪 (参见材料表) 评估球细胞, 然后用适当的分析软件进行单细胞流式细胞分析 (见材料表)。
  17. 当 ams 用于体外区域性或体内细胞传输时, 将 ams 由荧光活化细胞分拣器 (参见材料表) 直接导入1毫升的鼠标 AM 培养基中。或者, 将 AMs 分类为1毫升裂解缓冲器 (参见材料表), 辅以 10 ul/毫升β-巯基乙醇进行 RNA 提取。

2. 从小鼠肺、单细胞悬浮液中分离 AMs

  1. 麻醉一个八周大的 C57BL/6 老鼠与氯胺酮 (87.5 毫克/千克体重) 和甲苯噻嗪 (12.5 毫克/千克体重) 鸡尾酒通过腹腔注射。当老鼠获得手术麻醉, 失去反射和肌肉松弛。
  2. 将鼠标放在解剖表面, 侧面朝上。应用眼科兽医软膏, 防止脱水, 用70% 异丙醇饱和的无菌酒精垫擦拭小鼠的整个腹面, 以进行消毒。
  3. 装上所有四条腿克制的老鼠。
  4. 用微解剖工具轻轻地打开腹腔。必须注意尽量打开尽可能多的区域, 而不损害内脏器官或制造悬垂组织。
  5. 通过纵隔缓慢切开胸腔, 轻轻地打开胸廓。理想情况下, 肋骨笼可以从一侧到一侧切除。在打开胸腔时, 必须格外小心, 不要伤害肺部的胸膜。
  6. 定位下腔静脉, 并进行切口出血鼠标。使用吸收棉垫吸收血液。
  7. 将10毫升冰冷 PBS 注入右心室 (使用10毫升注射器和25G 针) 冲洗循环血细胞。一旦完全灌注, 肺部将出现脱皮, 并准备收割。
  8. 通过将气管、血管和韧带切开到15毫升圆锥管中, 用5毫升的冷 Dulbecco 修饰鹰的培养基 (DMEM) 来解剖肺部。保持它在冰上, 直到下一步。
  9. 通过 IACUC 批准的协议, 将鼠标与 CO2过量弄死。
  10. 将灌注后的肺部转移到无菌和无热原体的60毫米培养皿中, 3 毫升 DMEM。借助解剖钳逗出呼吸道和其他硬非肺组织材料, 如果存在。用手术刀将肺组织切碎, < 1 毫米大小。
  11. 添加300µg/毫升 Liberase TL 和 5 U/毫升 DNase I, 混合吹打和孵化在 37° C 在孵化器25分钟。10分钟后, 用吹打轻轻混合一次。
  12. 通过100µm 细胞过滤器安装在50毫升圆锥管, 通过分离的肺部。使用从1毫升注射器的柱塞后, 把细胞团簇在过滤器上。清洗过滤器与20毫升洗涤缓冲 (PBS + 2% 热灭活血清 + 2 毫米 EDTA)。
  13. 离心机在 500 x g 在4°c 5 分钟。丢弃上清液, 并用重悬20毫升洗涤缓冲器中的细胞颗粒。
  14. 重复步骤2.12 和2.13 两次, 每次更换过滤器和管。在洗涤缓冲器中预浸泡过滤器超过五分钟, 增加了 AM 产量。通过将 100 ul 流/分选缓冲器加入细胞颗粒, 制备单细胞悬浮液。
  15. 通过添加小鼠 fc 块 (克隆 2.4G2, 10 微克/毫升) 和孵化20分钟冰, 阻止非特异性抗体结合到 Fc 受体。
  16. 使用 FMO 和单污点控件执行抗体染色11,25。用细胞分析仪 (参见材料表) 评估肺细胞, 然后用分析软件进行单细胞流式细胞仪分析。
  17. 当 ams 用于体外区域性或体内细胞传输时, 将 ams 按单元格排序器 (参见材料表) 直接转换为1毫升的鼠标 AM 培养基。或者, 将 AMs 分类为1毫升裂解缓冲器, 辅以 10 ul/毫升β-巯基乙醇 RNA 萃取。

3. 从人的体液中分离 AMs

  1. 安排将人的体液从诊所转移到实验室4摄氏度。
  2. 离心的球液 (10-50 毫升) 在 250 x g 在4°c 10 分钟。细胞颗粒含有球细胞11。
  3. 用20毫升洗涤缓冲剂 (PBS + 2% 热灭活的血清 + 2 毫米 EDTA) 和离心机在 250 x g 处用4摄氏度清洗颗粒10分钟。
  4. 并用重悬细胞在 100 ul 的流/排序缓冲 (PBS + 2% 热灭活血清 + 1 毫米 EDTA + 25 毫米 HEPES)。
  5. 通过添加人 fc 块 (克隆 Fc1.3070, 25 微克/毫升), 并在冰上孵化20分钟, 阻止非特异性抗体结合到 Fc 受体。
  6. 使用 FMO 和单污点控件执行抗体染色11,24。用细胞分析仪 (参见材料表) 对球细胞进行评估, 然后用分析软件进行单细胞流式细胞仪分析。
  7. 将 AMs 按单元格排序器 (参见材料表) 直接添加到1毫升人类培养基或1毫升裂解缓冲器中, 辅以 10 ul/毫升β-巯基乙醇。

4. AMs 的体外培养

  1. 在细胞分类之后, 通过离心在 250 x g 的4摄氏度处获得10分钟的细胞。
  2. 并用重悬人类 AMs 在 1毫升人类AM 培养基 [罗斯威尔公园纪念研究所培养基 (RPMI) 1640 补充10% 血清, 20% L-929 培养上清 (作为巨噬细胞集落刺激因子 (M CSF), 100 U/毫升最终浓度的来源),1毫米丙酮酸钠, 10 毫米 N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic 酸 (HEPES), 1x 青霉素/链霉素 (可选)]。同样, 并用重悬小鼠 AMs 在 1毫升鼠标AM 培养基 [DMEM 补充10% 的血清, 20% L-929 培养上清 (作为脑脊液, 100 U/毫升最终浓度), 1 毫米丙酮酸钠, 10 毫米 HEPES 和1x 青霉素/链霉素 (可选)].
  3. 用单元格计数器枚举台盼蓝-排除活细胞, 并在 1 x 106/mL 上调整活细胞浓度。
    注意: 理想情况下, 多达 5 x 105 AMs 可以与从 8-10 周老 C57BL/6 雄性老鼠收集的球液隔离。小鼠肺消化液的产率是可变的, 可能略小于小鼠的体液。从人的体液中获得的产量取决于球液的体积、灌洗中使用的生理盐水总量以及病人的临床状况。
  4. 根据产量和实验需要, 种子细胞在室内滑动, 培养皿或培养瓶。理想情况下, 种子的 AMs 在 1 x 105/毫升与10毫升培养基在一个 T25 组织培养瓶。
  5. 用 5% CO2大气在37°c 湿润孵化箱中孵化细胞。
    注意: AMs 将成长为黏附细胞和非常缓慢增长 (加倍的时间 > 7 天)。
  6. 在播种后的24小时内, AMs 应该是黏附的, 不会被一个温和的改变文化培养基分离。从一端吸取吸入培养基, 并补充新鲜培养基预热至37摄氏度。
    注: 细胞现在可以用来评估 AM 生理或刺激的影响。在腔内生长的 AMs 可以方便地沾上适当的抗体, 是显微可视化的理想选择。对于流细胞评价, AMs 是通过非酶细胞游离溶液的孵化而收获的。
  7. 吸入培养基并添加游离溶液, 足以覆盖培养面 (每 T25 瓶大约2毫升), 在37摄氏度孵化 5-10 分钟。不需要刮擦, 不建议用机械的刮伤细胞。轻轻地拍打两侧, 加入 1-2 毫升的流/排序缓冲和轻轻的吸管向上和向下分离大多数黏附细胞。
  8. 在 RNA 研究中, 通过添加裂解缓冲剂, 将细胞直接溶解在培养皿上。

结果

图 1显示了用于识别鼠标 AMs 的流细胞方法。这包括分析在区分 AMs 与其他肺居民或肺浸润吞噬必要的最低限度的表面标记。需要进行差异分析, 以积极识别细胞间质巨噬细胞、树突状体细胞、中性粒细胞、单核细胞以及在肺部发生的核型肺巨噬细胞。下面的曲面标记方案可用于在AMs为 CD45+的各个单元格之间方便地区分这?...

讨论

AMs 是长寿的肺常驻巨噬细胞, 在出生时填充肺部, 并持续超过整个生命周期26。他们的作用在肺生理学7和病理学12和他们的潜力预测肺自身免疫24已经被认可。由于 AMs 长期存在于肺部11、27中, 并且由于它们参与了免疫应答的激活和进展11,24

披露声明

作者没有要申报的利益冲突。

致谢

我们感谢克莱尔协助编辑手稿。DKN 由克里斯弗林基金会的研究补助金 (#2095) 支持, TM 得到国家卫生研究院 (R01HL056643 和 R01HL092514) 赠款的支持。DKN 开发了方法, 设计了研究并撰写了手稿;协助动物研究和临床样品采购;协助进行流细胞分析和细胞分选;TM 监督研究和审阅手稿。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Non-enzymatic cell dissociating solutionMillipore-SigmaC5789
Puralube Vet OintmentDechra620300
22G Catheter Terumo Medical ProductsSR-OX2225CA
4-0 Non-absorbable silk braided suture Kent ScientificSUT-15-2
Dulbecco’s phosphate buffered saline Corning21-031-CM
Mouse Fc block BD Biosciences553142
Lysis buffer (PureLink RNA Kit)Thermo Fisher Scientific 12183018A
b-Mercaptoethanol Millipore-SigmaM6250 
FACSAria II cell sorter BD Biosciences644832
Ketamine  (Ketathesia)Henry Schein56344
Xylazine  (AnaSed)Akorn139-236
RPMI 1640Corning10-040-CM
DMEMCorning10-017-CM
Liberase TL Millipore-Sigma5401020001
DNase IMillipore-SigmaAMPD1-1KT
100μm cell strainer Corning352360
Human Fc blockBD Biosciences564220
EDTACorning46-034-CI
Countess II Automated Cell CounterThermo Fisher Scientific AMQAX1000
Trypan Blue SolutionThermo Fisher Scientific 15250061
HEPESCorning25-060-CI
Fetal Bovine SerumAtlanta BiologicalsS11150H
L-929 cell lineAmerican Type Culture CollectionATCC, CCL-1
Penicillin/Streptomycin Corning30-002-CI
Sodium PyruvateCorning25-000-CI
T25 Tissue culture flaskThermo Fisher Scientific 156367
60 mm culture dish Millipore-SigmaCLS3261
15 mL Conical tube Corning352097
50 mL Conical tube Corning352098
LSRFortessa cell analyzerBD Biosciences657669
FlowJoFlowJov10.4Analysis Software
Anti-CD45 (Mouse)Biolegend147709Clone I3/2.3, FITC conjugated
Anti-CD11b (Mouse)Biolegend101228Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugated
Anti-CD11c (Mouse)BD Biosciences565452Clone N418, BV 421 conjugated
Anti-I-Ab (Mouse)Biolegend116420Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugated
Anti-Siglec-F (Mouse)BD Biosciences562757Clone E50-2440, PE-CF594 conjugated
Anti-Siglec-H (Mouse)Biolegend129605Clone 551, PE conjugated
Anti-F4/80 (Mouse)Biolegend123118Clone BM8, APC/Cy7 conjugated
Anti-Ly-6C (Mouse)Biolegend128035Clone HK1.4, BV605 conjugated
Anti-CD64 (Mouse)Biolegend139311Clone X54-5/7.1, BV711 conjugated
Anti-CD24 (Mouse)BD Biosciences563115Clone M1/69, BV510 conjugated
Anti-CD103 (Mouse)BD Biosciences745305Clone OX-62, BV650 conjugated
Anti-CD317 (Mouse)Biolegend127015Clone 927, APC conjugated
Anti-CXCR1 (Mouse)Biolegend149029Clone SA011F11, BV785 conjugated
Anti-CD45 (Human)Biolegend304017Clone HI30, AF488 conjugated
Anti-CD11b (Human)Biolegend101216Clone M1/70, PE/Cy7 conjugated
Anti-HLA-DR (Human)Biolegend307618Clone L243, APC/Cy7 conjugated
Anti-CD169 (Human)Biolegend346008Clone 7-239, APC conjugated
Anti-CD206 (Human)Biolegend321106Clone 15-2, PE conjugated
Anti-CD163 (Human)Biolegend333612Clone GHI/61, BV421 conjugated

参考文献

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