Aislamiento y cultivo In Vitro de los macrófagos alveolares murinos y humanos

Resumen

Esta comunicación describe modelos murinos para los propósitos experimentales y metodologías para el aislamiento y cultivo de macrófagos alveolares de los seres humanos.

Resumen

Los macrófagos alveolares son macrófagos terminalmente diferenciados, residente de pulmón de origen prenatal. Los macrófagos alveolares son únicos en su larga vida y su importante papel en el desarrollo pulmonar y función, así como sus respuestas localizadas del pulmón a la infección y la inflamación. Hasta la fecha, ningún método unificado para la identificación, aislamiento y manejo de los macrófagos alveolares de los seres humanos y ratones existe. Este método es necesario para estudios sobre estas importantes células inmunitarias innatas en varias configuraciones experimentales. El método descrito aquí, que puede ser adoptado fácilmente por cualquier laboratorio, es un enfoque simplificado para cosechar los macrófagos alveolares de lavado broncoalveolar o de tejido pulmonar y mantenimiento in vitro. Porque los macrófagos alveolares se presentan principalmente como células adherentes en los alvéolos, el enfoque de este método es el desalojo antes de la cosecha y la identificación. El pulmón es un órgano altamente vascularizado, y varios tipos de células de origen mieloide y linfoide habitan, interactúan y son influenciados por el microambiente del pulmón. Utilizando el conjunto de marcadores de superficie que se describe aquí, los investigadores pueden fácilmente y sin ambigüedades distinguir los macrófagos alveolares de otros leucocitos y purificarlos para aplicaciones posteriores. El método de cultivo desarrollado en este documento apoya a ambos humanos y ratón macrófagos alveolares para el crecimiento in vitro y es compatible con los estudios celulares y moleculares.

Introducción

El microambiente del pulmón es un ecosistema único complejo con un conducto de aire elaborado y vasculatura. El aire inhalado viaja a través de la tráquea y numerosas ramificaciones de bronquios y bronquiolos antes de llegar a los alvéolos, donde ocurre el intercambio de gases sangre aire. Debido a la interacción directa con la atmósfera, la superficie respiratoria requiere protección contra los efectos potencialmente perjudiciales de partículas en suspensión y contaminantes. Un número de barreras físicas, químicas e inmunológicas protege a los pulmones. En particular, el despliegue de los fagocitos en la superficie respiratoria sirve un sistema importante de primera línea de defensa. Los macrófagos alveolares (AMs) son un tipo de fagocitos reside en el pulmón, y constituyen la inmensa mayoría de la piscina de macrófagos del pulmón. Como su nombre lo indica, AMs se localizan sobre todo a la luz alveolar y se presentan como células sésiles que constantemente muestra la atmósfera ambiente y comunican con el epitelio alveolar¹. En estado estacionario los pulmones, más del 95% de los fagocitos en el espacio alveolar son AMs², cuya composición puede alterar debido a inflamación, infección o exposición crónica a contaminantes.

AMs participan en una amplia gama de funciones que pueden ser locales a los pulmones o de importancia sistémica. Por ejemplo, AMs son esencial en el desarrollo y el óptimo funcionamiento de los pulmones; vigilancia inmune; y la separación de los desechos celulares, invasión de patógenos y partículas inhalado^3,4,5,6,7. Agotamiento objetivo del AMs es conocido por afectar la separación de virus respiratorios y bacterias^4,8. Además de su papel como los fagocitos y los defensores de una primera línea de la homeostasis pulmonar, AMs se conocen para funcionar como células presentadoras de antígeno en obtención de T de la célula de inmunidad⁹, potenciando la eficacia de la vacuna intranasal¹⁰ y influir en la restricción pulmonar autoinmunidad después de trasplante de pulmón^11,12. Deficiencia en la función de AM se ha relacionado con la proteinosis alveolar pulmonar (PAP), una condición que resulta de una mutación genética, malignidad o infección que impide la separación de surfactantes pulmonares^13,14. Trasplante de AMs ahora se está estudiando como un enfoque terapéutico para el tratamiento del PAP ^15,16.

AMs se sabe que se originan durante la embriogénesis y a persistir en los pulmones durante toda la vida sin sustituidos por circular leucocitos^2,17. Aunque, AM es indetectable en los pulmones homeostáticos, diferentes niveles de volumen de AM se han divulgado en ciertas condiciones clínicas, incluyendo infección por el influenza virus⁴, myeloablative irradiación¹⁸, exposición a endotoxinas ¹⁹y²⁰de la tercera edad. AMs se cree que uno mismo-renovar vía una baja proliferación^17,21, pero algunos estudios recientes afirman que los monocitos pueden dar lugar a una población de^22,de macrófagos intravasculares pulmonares²³ bajo condiciones experimentales, pero la funcionalidad de estos macrófagos pulmonares recién convertidos todavía tienen que definirse en enfermedades pulmonares. Por otra parte, entender el umbral de estímulo en el contexto de activación de AM es un área potencialmente interesante, como el pulmón trata de conservar un equilibrio entre las señales inflamatorias y los mecanismos inmunoreguladores.

Las alteraciones fisiológicas o patológicas que conducen a la pérdida de regulación inmune están importantes para evaluar en diversos contextos clínicos (p. ej., infecciones respiratorias, enfermedad inflamatoria pulmonar y enfermedad pulmonar fibrótica). Sin embargo, AMs son cada vez más reconocido como indicadores o incluso determinantes de la salud pulmonar^11,24. Actualmente, no están disponibles para la recolección, caracterización y mantenimiento AMs de seres humanos y modelos preclínicos murinos protocolos unificados. Falta de un consenso sobre precursores de AM y fenotipos y la ausencia de una metodología detallada han sido la gran barricada en descifrar funciones de AM en la enfermedad y la salud pulmonar. El siguiente protocolo ofrece una identificación definitiva, aislamiento y en vitro cultura estrategia que mucho avanzar en la comprensión del comportamiento de AM y facilitar estudios diagnóstico y terapéuticos orientada a AM.

Protocolo

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado institucional de Animal y el Comité uso (IACUC) y la Junta de revisión institucional (IRB) en el Hospital y centro médico de San José.

1. aislamiento de AMs del líquido murino el lavado broncoalveolar (BAL)

1. Anestesiar un ratón C57BL/6 de ocho semanas de edad con ketamina (87,5 mg/kg de peso corporal) y xilacina (12,5 mg/kg de peso corporal) cóctel por medio de una inyección intraperitoneal. Vaya al ratón logra anestesia quirúrgica con pérdida de los reflejos y la relajación de los músculos.
2. Coloque el ratón sobre una superficie de disección con la cara ventral hacia arriba. Aplique ungüento veterinario oftálmica en los ojos para prevenir la deshidratación y limpie toda la superficie ventral del ratón con preparación almohadillas con alcohol estéril saturadas con isopropanol al 70% para desinfectar.
3. Montar el ratón con las cuatro patas refrenadas.
4. Cuidadosamente abra la cavidad abdominal con las herramientas de micro disección. Debe tener cuidado de abrir tanta área como sea posible sin dañar cualquier órgano visceral o la creación de tejido colgante.
5. Cuidadosamente abra la cavidad torácica mediante la incisión lentamente la caja torácica a través del mediastino. Idealmente, la caja torácica puede ser suprimida del lado al lado. Extremo cuidado debe tenerse no lesionar la pleura de los pulmones al abrir la cavidad torácica.
6. Localizar la vena cava inferior y hacer una incisión para sangrar el ratón. Use almohadillas de algodón absorbente para absorber sangre.
7. Inyectar 10 mL helado tamponada fosfato salino (PBS) en el ventrículo derecho (con jeringa de 10 mL y aguja de 25G) para eliminar las células circulantes de la sangre. Absorber el flujo de sangre con almohadillas de algodón absorbente. Una vez completamente inundada, los pulmones aparecen blanqueados y entonces están listos para el lavado.
8. Suavemente abrir la piel y del músculo en el cuello para exponer la vía aérea. Suprimir cuidadosamente los músculos adyacentes, cartílagos y tejido graso sin dañar la tráquea.
9. Hacer una pequeña incisión (< 2 mm) en la tráquea a la laringe posterior. Esta incisión debe ser lo suficiente como para insertar un catéter en mientras que la tráquea está todavía unida a la laringe. Insertar un catéter de 22G de 1 pulgada sin aguja dentro de la tráquea hacia los pulmones. Asegurar el catéter con una sutura de seda trenzada (4-0; no absorbible) con un nudo cuadrado.
   Nota: El catéter debe recortarse según el tamaño del ratón. Catéteres muy cortos o largos tienden a tener fugas o romper la vía aérea durante el lavado. Longitud del catéter debe ser tal que cuando introduce completamente los restos de punta bien dentro de la tráquea y no llegar a los bronquios primarios.
10. Conecte una jeringa de 1 mL con tampón BAL helada (Ca^{2 +} y Mg^{2 +} libre PBS + 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético, EDTA) con el catéter e infundir lentamente el búfer en los pulmones. Esto inflará los pulmones. Mantenga la jeringa atada catéter durante cinco segundos y luego aspirar el líquido del lavado tirando suavemente el pistón. Esto desinfla los pulmones. Recoger el líquido en un tubo cónico de 15 mL a hielo.
11. Repita paso 1.10 para nueve veces más y el líquido del lavado de la piscina. No exceda 1 mL de tampón por descarga, exceda la capacidad del pulmón y provocar su ruptura.
12. Eutanasia el ratón con sobredosis de CO₂ por protocolo de IACUC aprobado.
13. Centrifugar el líquido 10 mL BAL a 250 x g a 4 ° C durante 10 minutos. El precipitado de células contiene células del BAL.
    PRECAUCIÓN: El pellet puede ser muy pequeño, así que tenga cuidado al aspirar el sobrenadante.
14. Resuspender las células en 100 μL de buffer (PBS + 2% suero bovino fetal inactivado por calor (FBS) + 1 mM EDTA 25 mM de ácido N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic (HEPES)) de flujo/clasificación del BAL.
15. Bloquear la Unión inespecífica del anticuerpo al receptor Fc añadiendo bloques de ratón Fc (clon 2.4G2, 10 μg/mL) y se incuba durante 20 minutos en hielo.
16. Realizar tinción con fluorescencia menos uno (FMO) del anticuerpo y solo mancha controla^11,25. Evaluar el BAL células por un analizador de la célula (véase Tabla de materiales) seguido por análisis de citometría de Flujo unicelular software de análisis apropiado (véase Tabla de materiales).
17. Aislar AMs por un celular activado por fluorescencia clasificador (véase Tabla de materiales) directamente en ratón 1 mL soy medio de cultivo cuando AMs están destinado a cultivo in vitro o en vivo transferencia de la célula. Como alternativa, tipo AMs en 1 mL de tampón de lisis (véase Tabla de materiales) suplementado con 10 μL/mL β-mercaptoetanol para extracción de RNA.

2. aislamiento de AMs de pulmón de ratón, suspensión unicelular

1. Anestesiar un ratón C57BL/6 de ocho semanas de edad con ketamina (87,5 mg/kg de peso corporal) y xilacina (12,5 mg/kg de peso corporal) cóctel por medio de una inyección intraperitoneal. Vaya al ratón logra anestesia quirúrgica con pérdida de los reflejos y la relajación de los músculos.
2. Coloque el ratón sobre una superficie de disección con la cara ventral hacia arriba. Aplique ungüento veterinario oftálmica en los ojos para prevenir la deshidratación y limpie toda la superficie ventral del ratón con almohadillas con alcohol estéril saturadas con isopropanol al 70% para desinfectar.
3. Montar el ratón con las cuatro patas refrenadas.
4. Cuidadosamente abra la cavidad abdominal con las herramientas de micro disección. Debe tener cuidado de abrir tanta área como sea posible sin dañar cualquier órgano visceral o la creación de tejido colgante.
5. Cuidadosamente abra la cavidad torácica mediante la incisión lentamente la caja torácica a través del mediastino. Idealmente, la caja torácica puede ser suprimida del lado al lado. Extremo cuidado debe tenerse no lesionar la pleura de los pulmones al abrir la cavidad torácica.
6. Localizar la vena cava inferior y hacer una incisión para sangrar el ratón. Use almohadillas de algodón absorbente para absorber sangre.
7. Inyectar 10 mL PBS helado en el ventrículo derecho (con jeringa de 10 mL y aguja de 25G) para eliminar las células circulantes de la sangre. Una vez completamente inundada, los pulmones aparecen blanqueados y están listos para la cosecha.
8. Diseccionar a los pulmones por cortar la tráquea, vasos sanguíneos y ligamentos en un tubo cónico de 15 mL con 5 mL de frío medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM). Mantener en hielo hasta el siguiente paso.
9. Eutanasia el ratón con sobredosis de CO₂ por protocolo de IACUC aprobado.
10. Transferir los pulmones perfundidos en una placa de cultivo estéril y libre de pirógenos de 60 mm con 3 mL DMEM. Con ayuda de fórceps de disección embromar hacia fuera de las vías respiratorias y otros materiales de tejido pulmonar no duro, si está presente. Pique el tejido pulmonar con un bisturí para < tamaño 1 mm.
11. Añadir 300 μg/mL TL somatométrica y 5 U/mL DNasa I, mezclar mediante pipeteo e incubar a 37° C en una incubadora durante 25 minutos. Mezclar suavemente una vez transfiriendo después de 10 minutos.
12. Pasar los pulmones disociados a través de un tamiz de célula μm 100 instalado en un tubo cónico de 50 mL. Use la parte posterior de un émbolo de la jeringa de 1 mL para hacer puré de grumos de células en el filtro. Lavar el filtro con 20 mL de tampón de lavado (PBS + 2% de calor inactiva FBS + 2 mM EDTA).
13. Centrifugar a 500 x g a 4 ° C durante 5 minutos. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 20 mL de tampón de lavado.
14. Repita los pasos 2.12 y 2.13 dos veces, cambiando el filtro y el tubo cada vez. Previo remojo el filtro en tampón de lavado durante más de cinco minutos aumenta la producción de AM. Preparar suspensión unicelular mediante la adición de 100 μL de buffer para el precipitado de células de flujo/clasificación.
15. Bloquear la Unión inespecífica del anticuerpo al receptor de Fc al agregar bloque de ratón Fc (clon 2.4G2, 10 μg/mL) y se incuba durante 20 minutos en hielo.
16. Realizar coloración junto con FMO y controles solo mancha^11,25del anticuerpo. Evaluar el pulmón células por un analizador de la célula (véase Tabla de materiales) seguido por unicelular flujo cytometry análisis por software.
17. AMs de tipo por un clasificador de célula (véase Tabla de materiales) directamente en ratón 1 mL soy medio de cultivo cuando AMs están destinado a cultivo in vitro o en vivo transferencia de la célula. Por otra parte, clasificar AMs en 1 mL de tampón de lisis con β-mercaptoetanol de 10 μL/mL para la extracción de RNA.

3. aislamiento de AMs de humano líquido del BAL

1. Organizar la transferencia del líquido del BAL humano de la clínica al laboratorio a 4 ° C.
2. Centrifugar el líquido del BAL (10-50 mL) a 250 x g a 4 ° C durante 10 minutos. El precipitado de células contiene células de BAL¹¹.
3. Lavar el precipitado con 20 mL de tampón de lavado (PBS + 2% de calor inactiva FBS + 2 mM EDTA) y centrifugar a 250 x g a 4 ° C durante 10 minutos.
4. Resuspender las células del BAL son en 100 μL de buffer de flujo/clasificación (PBS + 2% de calor inactiva FBS + 1 mM EDTA 25 mM HEPES).
5. Bloquear la Unión inespecífica del anticuerpo al receptor Fc agregando bloque Fc humano (clon Fc1.3070, 25 μg/mL) y de incubación en hielo durante 20 minutos.
6. Realizar anticuerpos coloración junto con FMO y controles solo mancha^11,24. Evaluar el BAL células por un analizador de la célula (véase Tabla de materiales) seguido por unicelular flujo cytometry análisis por software.
7. AMs de tipo por un clasificador de células (véase Tabla de materiales) directamente en el medio de cultivo 1 mL humano AM o 1 mL de tampón de lisis suplementado con 10 μL/mL de β-mercaptoetanol.

4. in vitro cultura de AMs

1. Siguiendo la clasificación de la célula, recoger las células por centrifugación a 250 x g a 4 ° C durante 10 minutos.
2. AMs humanos de resuspender en 1 mL medio de cultivo de humanos AM [Roswell Park Memorial Institute medio (RPMI) 1640 suplementado con 10% FBS, 20% L-929 cultivo sobrenadante (como fuente de factor (M-CSF), concentración final de 100 U/mL estimulante de colonias de macrófagos), piruvato de sodio 1 mM, 10 mM de ácido N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic (HEPES) y 1 x penicilina/estreptomicina (opcional)]. Del mismo modo, resuspender ratón AMs en 1 mL ratón AM medio de cultivo [DMEM suplementado con 10% FBS, 20% L-929 cultura sobrenadante (como una fuente de M-CSF, concentración final de 100 U/mL), 1 mM de piruvato de sodio, 10 mM HEPES y 1 x penicilina/estreptomicina (opcional )].
3. Enumerar el trypan azul excepto células viables por un contador celular y ajustar la concentración de células viables en 1 x 106/ml.
   Nota: Idealmente, por a 5 x 10⁵ AMs puede ser aislado de líquido del BAL de un ratón macho de 8-10 semanas viejo C57BL/6. La producción de AM de la recopilación de pulmón de ratón es variable y puede ser ligeramente menor que el líquido del BAL del ratón. Rendimiento de AM de líquido del BAL humano depende del volumen del líquido del BAL, el volumen total de solución salina que se utiliza en el lavado y condición clínica del paciente.
4. Basado en el rendimiento y la necesidad experimental, las células en portaobjetos de la cámara, platos de cultura o frascos de cultivo de la semilla. Idealmente, la semilla las AMs a 1 x 105/ml con medio de 10 mL en un matraz de cultivo de tejidos T25.
5. Incubar las células en una incubadora humidificada de 37 ° C con 5% CO₂ ambiente.
   Nota: AMs crecerá como células adherentes y son de crecimiento extremadamente lento (tiempo de duplicación > 7 días).
6. A las 24 horas post siembra, AMs debe ser adherente y no ser separado por un suave cambio de medio de cultivo. Quitarlo del medio por la aspiración de un extremo y llenar con medio fresco, previamente calentado a 37 ° C.
   Nota: Las células pueden utilizarse ahora para evaluar AM fisiología o los efectos de los estímulos. AMs en diapositivas de la cámara pueden ser convenientemente teñidas con anticuerpos apropiados y son ideales para la visualización microscópica. Para la evaluación de la citometría de flujo, AMs son cosechado por la incubación con no enzimática celular disociación solución.
7. Aspire el medio de cultivo y añadir solución de disociación lo suficiente para cubrir la superficie de cultivo (aproximadamente 2 mL por frasco T25) e incube a 37 ° C durante 5-10 minutos. No raspar será necesario, y no se recomienda para raspar las células mecánicamente. Golpee ligeramente los lados, añadir 1-2 mL buffer de flujo/clasificación y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para retirar la mayoría de las células adherentes.
8. Estudios de RNA, lyse las células directamente en la placa de cultivo mediante la adición de tampón de lisis.

Resultados

El enfoque de citometría de flujo para identificar ratón AMs se muestra en la figura 1. Esto incluye el análisis de un conjunto mínimo de marcadores de superficie necesarios distinguir AMs de otros fagocitos reside en el pulmón o infiltración pulmonar. Análisis diferencial es necesaria para identificar positivamente a AMs de intersticiales macrófagos, células dendríticas, neutrófilos, monocitos y macrófagos derivados de monocitos pulmonares que se...

Discusión

AMs son macrófagos de pulmón-residente de larga vida que pueblan los pulmones comienza al nacer y perdurable sobre la vida entera²⁶. Sus funciones en la fisiología pulmonar Patología de⁷ y¹² y su potencial para predecir de autoinmunidad pulmonar²⁴ han sido reconocidos. Porque AMs tiene una presencia a largo plazo en los pulmones^11,27 y participan en la activación ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Non-enzymatic cell dissociating solution	Millipore-Sigma	C5789
Puralube Vet Ointment	Dechra	620300
22G Catheter	Terumo Medical Products	SR-OX2225CA
4-0 Non-absorbable silk braided suture	Kent Scientific	SUT-15-2
Dulbecco’s phosphate buffered saline	Corning	21-031-CM
Mouse Fc block	BD Biosciences	553142
Lysis buffer (PureLink RNA Kit)	Thermo Fisher Scientific	12183018A
b-Mercaptoethanol	Millipore-Sigma	M6250
FACSAria II cell sorter	BD Biosciences	644832
Ketamine  (Ketathesia)	Henry Schein	56344
Xylazine  (AnaSed)	Akorn	139-236
RPMI 1640	Corning	10-040-CM
DMEM	Corning	10-017-CM
Liberase TL	Millipore-Sigma	5401020001
DNase I	Millipore-Sigma	AMPD1-1KT
100μm cell strainer	Corning	352360
Human Fc block	BD Biosciences	564220
EDTA	Corning	46-034-CI
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000
Trypan Blue Solution	Thermo Fisher Scientific	15250061
HEPES	Corning	25-060-CI
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11150H
L-929 cell line	American Type Culture Collection	ATCC, CCL-1
Penicillin/Streptomycin	Corning	30-002-CI
Sodium Pyruvate	Corning	25-000-CI
T25 Tissue culture flask	Thermo Fisher Scientific	156367
60 mm culture dish	Millipore-Sigma	CLS3261
15 mL Conical tube	Corning	352097
50 mL Conical tube	Corning	352098
LSRFortessa cell analyzer	BD Biosciences	657669
FlowJo	FlowJo	v10.4	Analysis Software
Anti-CD45 (Mouse)	Biolegend	147709	Clone I3/2.3, FITC conjugated
Anti-CD11b (Mouse)	Biolegend	101228	Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugated
Anti-CD11c (Mouse)	BD Biosciences	565452	Clone N418, BV 421 conjugated
Anti-I-Ab (Mouse)	Biolegend	116420	Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugated
Anti-Siglec-F (Mouse)	BD Biosciences	562757	Clone E50-2440, PE-CF594 conjugated
Anti-Siglec-H (Mouse)	Biolegend	129605	Clone 551, PE conjugated
Anti-F4/80 (Mouse)	Biolegend	123118	Clone BM8, APC/Cy7 conjugated
Anti-Ly-6C (Mouse)	Biolegend	128035	Clone HK1.4, BV605 conjugated
Anti-CD64 (Mouse)	Biolegend	139311	Clone X54-5/7.1, BV711 conjugated
Anti-CD24 (Mouse)	BD Biosciences	563115	Clone M1/69, BV510 conjugated
Anti-CD103 (Mouse)	BD Biosciences	745305	Clone OX-62, BV650 conjugated
Anti-CD317 (Mouse)	Biolegend	127015	Clone 927, APC conjugated
Anti-CXCR1 (Mouse)	Biolegend	149029	Clone SA011F11, BV785 conjugated
Anti-CD45 (Human)	Biolegend	304017	Clone HI30, AF488 conjugated
Anti-CD11b (Human)	Biolegend	101216	Clone M1/70, PE/Cy7 conjugated
Anti-HLA-DR (Human)	Biolegend	307618	Clone L243, APC/Cy7 conjugated
Anti-CD169 (Human)	Biolegend	346008	Clone 7-239, APC conjugated
Anti-CD206 (Human)	Biolegend	321106	Clone 15-2, PE conjugated
Anti-CD163 (Human)	Biolegend	333612	Clone GHI/61, BV421 conjugated