Isolamento e coltura In Vitro dei macrofagi alveolari murini ed umani

Riepilogo

La presente comunicazione descrive le metodologie di isolamento e coltura dei macrofagi alveolari da esseri umani e modelli murini per scopi sperimentali.

Abstract

I macrofagi alveolari sono macrofagi terminalmente differenziati, polmone-residente di origine prenatale. I macrofagi alveolari sono unici nella loro lunga vita e il loro importante ruolo nello sviluppo polmonare e funzione, come pure le loro risposte del polmone localizzato all'infezione ed infiammazione. Ad oggi, non esiste alcun metodo unificato per la gestione dei macrofagi alveolari da esseri umani e topi, isolamento e identificazione. Tale metodo è necessario per gli studi su questi importanti cellule immuni innate nei diversi contesti sperimentali. Il metodo descritto qui, che può facilmente essere adottato da qualsiasi laboratorio, è un approccio semplificato alla raccolta macrofagi alveolari dal fluido di lavaggio broncoalveolare o dal tessuto polmonare e il loro mantenimento in vitro. Poiché i macrofagi alveolari si verificano principalmente come cellule aderenti negli alveoli, il focus di questo metodo è il loro sloggiare prima del raccolto e l'identificazione. Il polmone è un organo altamente vascolarizzato, e vari tipi di cellule di origine mieloide e linfoide abitano, interagiscono e sono influenzati da microambiente polmonare. Utilizzando il set di marcatori di superficie descritto qui, ricercatori possono senza ambiguità e facilmente distinguere macrofagi alveolari da altri leucociti e li purifica per applicazioni a valle. Il metodo di coltura sviluppato nel presente documento supporta sia umane e macrofagi alveolari per la crescita in vitro il mouse ed è compatibile con studi molecolari e cellulari.

Introduzione

Il microambiente polmonare è un ecosistema complesso in modo univoco con un condotto dell'aria elaborata e sistema vascolare. L'aria inalata viaggia attraverso la trachea e numerosi rami di bronchi e bronchioli prima di raggiungere gli alveoli, dove avviene lo scambio di gas del sangue-aria. A causa del contatto diretto con l'atmosfera, la superficie respiratoria richiede protezione dagli effetti potenzialmente nocivi delle particelle e sostanze inquinanti. Un numero di barriere fisiche, chimiche e immunologiche protegge i polmoni. In particolare, la distribuzione dei fagociti in superficie respiratoria serve un sistema di difesa di prima linea importante. I macrofagi alveolari (ma) sono un tipo di polmone-residente fagociti, e che costituiscono la stragrande maggioranza della piscina del macrofago polmonare. Come suggerisce il nome, AMs sono principalmente localizzati al lume del alveolare e si presentano come cellule sessile che costantemente assaggiare l'atmosfera ambiente e comunicano con l' epitelio alveolare¹. In stato stazionario polmoni, oltre il 95% dei fagociti nello spazio alveolare sono AMs², cui composizione può alterare a causa di infiammazione, infezione o l'esposizione cronica alle sostanze inquinanti.

AMs è partecipare a una vasta gamma di funzioni che possono essere locali ai polmoni e/o di importanza sistemica. Ad esempio, AMs sono essenziali per lo sviluppo e il funzionamento ottimale dei polmoni; sorveglianza immune; e liquidazione dei detriti cellulari, invadendo gli agenti patogeni e particelle inalate^3,4,5,6,7. Lo svuotamento mirato di AMs è conosciuto per alterare la clearance del virus respiratori e batteri^4,8. Oltre il loro ruolo di fagociti e un difensori di prima linea dell'omeostasi polmonare, AMs sono noti per funzionare come cellule presentanti l'antigene in suscitamento T delle cellule dell'immunità⁹, rafforza l'efficacia del vaccino intranasale¹⁰ e influenzare autoimmunità polmone-limitati dopo trapianto del polmone^11,12. Carenza nella funzione di AM è stata collegata a proteinosi alveolare polmonare (PAP), una circostanza derivando da una mutazione genetica, la malignità o l'infezione che altera la clearance di surfattanti polmonari^13,14. Trapianto di AMs è ora in fase di studio come un approccio terapeutico per il trattamento di PAP ^15,16.

AMs sono noti per provenire durante l'embriogenesi e persistono nei polmoni per tutta la vita senza essere sostituiti facendo circolare i leucociti^2,17. Sebbene, fatturato AM è rilevabile nei polmoni omeostatici, diversi livelli di fatturato AM sono stati segnalati in determinate condizioni cliniche compresa l'infezione da influenza virus⁴, myeloablative irradiazione¹⁸, esposizione all'endotossina ¹⁹e²⁰di vecchiaia. AMs sono creduti per auto-rinnovarsi tramite un basso grado di proliferazione^17,21, ma alcuni studi recenti sostengono che i monociti possono dar luogo ad una popolazione di intravascolare polmonare macrofagi^22,23 sotto condizioni sperimentali, ma la funzionalità di questi macrofagi polmonari appena convertiti devono ancora essere definiti nelle malattie polmonari. Inoltre, comprendere la soglia di stimolo nel contesto di attivazione è una zona potenzialmente interessante, come il polmone tenta di mantenere un equilibrio tra segnali infiammatori ed il macchinario immunoregulatory.

Le alterazioni fisiologiche o patologiche che portano alla perdita della regolazione immune sono importanti per valutare in varie regolazioni cliniche (ad es., infezioni respiratorie, malattie infiammatorie polmonari e malattia polmonare fibrotica). Tuttavia, AMs sono sempre più riconosciuti come indicatori o anche determinanti di salute polmonare^11,24. Attualmente, non esistono Nessun protocollo unificato disponibile per la raccolta, la caratterizzazione, e/o mantenimento AMs da esseri umani e preclinici modelli murini. Mancanza di un consenso sui precursori AM e fenotipi e l'assenza di una metodologia dettagliata era stato l'ostacolo importante nel decifrare uno o più ruoli di AM in malattia e salute polmonare. Il seguente protocollo offre una definitiva identificazione, isolamento e in vitro cultura strategia che permette di avanzare la comprensione del comportamento di AM e facilitare AM-mirati studi diagnostici e terapeutici.

Protocollo

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dalla cura istituzionale degli animali ed uso Committee (IACUC) e Institutional Review Board (IRB) a San Giuseppe Hospital and Medical Center.

1. isolamento di AMs dal fluido murino lavaggio broncoalveolare (BAL)

1. Anestetizzare un mouse C57BL/6 otto-settimana-vecchio con ketamina (87,5 mg/kg di peso corporeo) e xilazina (12,5 mg/kg di peso corporeo) cocktail tramite un'iniezione intraperitoneale. Procedere quando mouse raggiunge l'anestesia chirurgica con perdita dei riflessi e rilassamento dei muscoli.
2. Posizionare il mouse su una superficie di dissezione con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Applicare unguento oftalmico veterinario sugli occhi per prevenire la disidratazione e pulire l'intera superficie ventrale del mouse con prep tamponi imbevuti di alcool sterili saturate con 70% di isopropanolo per disinfettare.
3. Montare il mouse con tutti e quattro i piedini trattenuti.
4. Aprire delicatamente la cavità addominale con strumenti di micro dissezione. Deve prestare attenzione a tanto spazio all'aperto come possibile senza danneggiare alcun organi viscerali o creazione di tessuto sovrastante.
5. Aprire delicatamente la cavità toracica di pungere lentamente la gabbia toracica attraverso il mediastino. Idealmente, la gabbia toracica può essere asportata da lato a lato. Cura estrema deve essere presa non per ferire la pleura dei polmoni durante l'apertura della cavità toracica.
6. Individuare la vena cava inferiore e fare un'incisione a sanguinare il mouse. Utilizzare tamponi di cotone assorbente per assorbire il sangue.
7. Iniettare 10 mL ghiacciata tamponato fosfato salino (PBS) nel ventricolo di destra (usando la siringa da 10 mL e ago 25G) per svuotare le cellule circolanti del sangue. Assorbire il flusso di sangue con tamponi di cotone assorbente. Una volta completamente irrorati, polmoni compaiono sbollentati e quindi sono pronti per il lavaggio.
8. Delicatamente tagliare aperto la pelle e muscolo del collo per esporre le vie respiratorie. Asportare con cura i muscoli adiacenti, cartilagini e tessuti grassi senza danneggiare la trachea.
9. Praticare una piccola incisione (< 2 mm) sulla trachea posteriore alla laringe. Questa incisione deve essere appena sufficiente per inserire un catetere nella mentre la trachea è ancora attaccata alla laringe. Inserire un catetere 22g 1-inch senza ago nella trachea verso i polmoni. Fissare il catetere con una sutura seta intrecciata (4-0; non assorbibili) con un nodo quadrato.
   Nota: Il catetere deve essere tagliata sulla base delle dimensioni del mouse. Cateteri estremamente brevi o lunghi tendono a fuoriuscire e/o strappare le vie respiratorie durante il lavaggio. Lunghezza catetere deve essere tale che, quando inserito completamente i resti di punta ben all'interno della trachea e non raggiungere i bronchi primari.
10. Attaccare una siringa 1 mL riempita con gelida buffer di BAL (Ca^{2 +} e Mg^{2 +} gratis PBS + 1 mM acido etilendiamminotetracetico, EDTA) per il catetere e infondere lentamente il buffer nei polmoni. Questo si gonfia i polmoni. Tenere la siringa collegata al catetere per cinque secondi e quindi aspirare il fluido di lavaggio tirando delicatamente il pistone. Questo si sgonfierà i polmoni. Raccogliere il liquido in una provetta conica da 15 mL posizionato su ghiaccio.
11. Ripetere i passaggio 1.10 per nove volte di più e il fluido di lavaggio della piscina. Non superare 1 mL di tampone per ogni svuotamento, che può superare la capacità polmonare e portare alla sua rottura.
12. Eutanasia il mouse con la dose eccessiva di CO₂ dal protocollo di IACUC approvato.
13. Centrifugare il liquido 10ml BAL a 250 x g a 4 ° C per 10 minuti. Il pellet cellulare contiene cellule di BAL.
    Attenzione: Il pellet può essere molto piccolo, quindi prestare attenzione quando aspirare il supernatante.
14. Risospendere le cellule di BAL in 100 μL di flusso/ordinamento buffer (PBS + 2% calore inattivato siero bovino fetale (FBS) + 1 mM EDTA + 25 mM acido N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic (HEPES)).
15. Bloccare il grippaggio non specifico dell'anticorpo al ricevitore di Fc aggiungendo del mouse Fc blocco (clone di 2.4G2, 10 μg/mL) e incubare per 20 minuti sul ghiaccio.
16. Eseguire anticorpo che macchia insieme a fluorescenza meno uno (FMO) e single-macchia controlli^11,25. Valutare il BAL cellule da un analizzatore delle cellule (Vedi Tabella materiali) seguirono dall'analisi di citometria a flusso di cella singola da software di analisi appropriato (Vedi Tabella materiali).
17. AMs di isolare da una fluorescenza-attivato delle cellule sorter (Vedi Tabella materiali) direttamente nel mouse 1 mL sono terreno di coltura quando AMs sono destinati per la cultura in vitro o in vivo delle cellule di trasferimento. In alternativa, sorta di AMs in 1 mL di tampone di lisi (Vedi Tabella materiali) completati con 10 μL/mL di β-mercaptoetanolo per estrazione del RNA.

2. isolamento di AMs dal polmone del topo, cella singola sospensione

1. Anestetizzare un mouse C57BL/6 otto-settimana-vecchio con ketamina (87,5 mg/kg di peso corporeo) e xilazina (12,5 mg/kg di peso corporeo) cocktail tramite un'iniezione intraperitoneale. Procedere quando mouse raggiunge l'anestesia chirurgica con perdita dei riflessi e rilassamento dei muscoli.
2. Posizionare il mouse su una superficie di dissezione con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Applicare unguento oftalmico veterinario sugli occhi per prevenire la disidratazione e pulire l'intera superficie ventrale del mouse con tamponi imbevuti di alcool sterili saturate con 70% di isopropanolo per disinfettare.
3. Montare il mouse con tutti e quattro i piedini trattenuti.
4. Aprire delicatamente la cavità addominale con strumenti di micro dissezione. Deve prestare attenzione a tanto spazio all'aperto come possibile senza danneggiare alcun organi viscerali o creazione di tessuto sovrastante.
5. Aprire delicatamente la cavità toracica di pungere lentamente la gabbia toracica attraverso il mediastino. Idealmente, la gabbia toracica può essere asportata da lato a lato. Cura estrema deve essere presa non per ferire la pleura dei polmoni durante l'apertura della cavità toracica.
6. Individuare la vena cava inferiore e fare un'incisione a sanguinare il mouse. Utilizzare tamponi di cotone assorbente per assorbire il sangue.
7. Iniettare 10 mL di PBS ghiacciata nel ventricolo di destra (usando la siringa da 10 mL e ago 25G) per svuotare le cellule circolanti del sangue. Una volta completamente irrorati, polmoni compaiono sbollentati e sono pronti per il raccolto.
8. Sezionare i polmoni da recidere la trachea, vasi sanguigni e legamenti in una provetta conica da 15 mL con 5 mL di freddo esente per volta Eagle di Dulbecco (DMEM). Mantenere il ghiaccio fino al passaggio successivo.
9. Eutanasia il mouse con la dose eccessiva di CO₂ dal protocollo di IACUC approvato.
10. Trasferire i polmoni irrorati in una piastra di coltura sterile e apirogeno 60 mm con 3 mL DMEM. Con l'aiuto del forcipe di dissezione tirarne fuori le vie respiratorie e altro materiale di tessuto polmonare non duro, se presente. Tritare il tessuto polmonare con un bisturi per < dimensione di 1 mm.
11. Aggiungere 300 µ g/mL Liberase TL e 5 U/mL dnasi I, Miscelare pipettando e incubare a 37° C in un incubatore per 25 minuti. Mescolare delicatamente una volta pipettando dopo 10 minuti.
12. Passare i polmoni dissociati attraverso un colino di cella µm 100 installato in una provetta conica da 50 mL. Utilizzare il retro di uno stantuffo dalla siringa da 1 mL per mash up del cellulare ciuffi sul filtro. Lavare il filtro con 20 mL di tampone di lavaggio (PBS + 2% calore inattivato FBS + 2 mM EDTA).
13. Centrifugare a 500 x g a 4 ° C per 5 minuti. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 20 mL di tampone di lavaggio.
14. Ripetere i passaggi 2.12 e 2.13 due volte, cambiando il filtro e il tubo ogni volta. Pre-ammollo il filtro nel tampone di lavaggio per più di cinque minuti aumenta il rendimento di AM. Preparare la sospensione unicellulare aggiungendo 100 μL flusso/ordinamento buffer per il pellet cellulare.
15. Bloccare l'associazione di anticorpi non specifici per il recettore Fc aggiungendo del mouse Fc blocco (clone di 2.4G2, 10 μg/mL) e incubare per 20 minuti sul ghiaccio.
16. Eseguire anticorpo che macchia insieme a FMO e singolo-macchia controlli^11,25. Valutare il polmone cellule da un analizzatore delle cellule (Vedi Tabella materiali) seguirono da citometria a flusso di cella singola analisi di analisi software.
17. AMs di ordinamento di un sorter delle cellule (Vedi Tabella materiali) direttamente nel mouse 1 mL sono terreno di coltura quando AMs sono destinati per la cultura in vitro o in vivo delle cellule di trasferimento. In alternativa, è possibile ordinare AMs in 1 mL di tampone di lisi completati con 10 μL/mL di β-mercaptoetanolo per estrazione del RNA.

3. isolamento di AMs da umano liquido di BAL

1. Organizzare il trasferimento del fluido BAL umano dalla clinica al laboratorio a 4 ° C.
2. Centrifugare il liquido di BAL (10-50 mL) a 250 x g a 4 ° C per 10 minuti. Il pellet cellulare contiene cellule di BAL¹¹.
3. Lavare la pallina con 20 mL di tampone di lavaggio (PBS + 2% calore inattivato FBS + 2 mM EDTA) e centrifugare a 250 x g a 4 ° C per 10 minuti.
4. Risospendere le cellule di BAL sono in 100 μL di flusso/ordinamento buffer (PBS + 2% calore inattivato FBS + 1 mM EDTA + 25mm HEPES).
5. Bloccare l'associazione di anticorpi non specifici per il recettore Fc aggiungendo umana Fc blocco (clone di Fc1.3070, 25 μg/mL) e incubare per 20 minuti sul ghiaccio.
6. Eseguire anticorpo che macchia insieme FMO e singolo-macchia controlli^11,24. Valutare il BAL cellule da un analizzatore delle cellule (Vedi Tabella materiali) seguirono da citometria a flusso di cella singola analisi di analisi software.
7. AMs di ordinamento di un sorter delle cellule (Vedi Tabella materiali) direttamente nel terreno di coltura umana AM da 1 mL o 1 mL di tampone di lisi completati con 10 μL/mL di β-mercaptoetanolo.

4. in vitro cultura di AMs

1. In seguito l'ordinamento delle cellule, raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 250 x g a 4 ° C per 10 min.
2. Risospendere umano AMs in 1ml terreno di coltura umana AM [Roswell Park Memorial Institute medie (RPMI) 1640 supplementato con 10% FBS, 20% L-929 cultura surnatante (come fonte di fattore (M-CSF), una concentrazione finale di 100 U/mL di stimolazione della Colonia del macrofago), piruvato di sodio di 1 mM, 10 mM acido N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic (HEPES) e 1 x penicillina/streptomicina (facoltativa)]. Allo stesso modo, risospendere mouse AMs in 1ml mouse AM terreno di coltura [DMEM completati con 10% FBS, 20% L-929 cultura surnatante (come fonte di M-CSF, una concentrazione finale di 100 U/mL), 1 mM sodio piruvato, 10 mM HEPES e 1x penicillina/streptomicina (opzionale )].
3. Enumerare il trypan blu-escludendo cellule vitali di un contatore di cellule e regolare la concentrazione di cellule vitali a 1 x 106/ml.
   Nota: Idealmente, fino a 5 x 10⁵ AMs può essere isolato dal liquido di BAL raccolto da un topo maschio di 8-10 settimane vecchio C57BL/6. La resa di AM dal digest di polmone del mouse è variabile e può essere leggermente inferiore a quella del fluido del mouse BAL. Rendimento AM da umano liquido di BAL dipende dal volume di liquido di BAL, il volume totale di soluzione salina utilizzata per il lavaggio e condizioni cliniche del paziente.
4. Basato sul rendimento e sulla necessità sperimentali, seme le cellule in camera diapositive, piastre di coltura o matracci di cultura. Idealmente, seme l'AMs a 1 x 105/ml con 10 mL di terreno in un matraccio di cultura del tessuto T25.
5. Incubare le cellule in un incubatore a 37 ° C con 5% CO₂ ambiente.
   Nota: AMs crescerà come cellule aderenti e sono estremamente a crescita lenta (tempo di raddoppiamento > 7 giorni).
6. 24 ore post-semina, AMs deve essere aderente e non verranno disconnessi da un delicato cambiamento del terreno di coltura. Rimuovere il supporto dall'aspirazione da un'estremità e saziatevi con medium fresco pre-riscaldato a 37 ° C.
   Nota: Le cellule possono ora utilizzabile per valutare la fisiologia AM o gli effetti di stimoli. AMs cresciuto nelle diapositive di camera può essere convenientemente macchiato con gli anticorpi adatti e sono ideali per la visualizzazione al microscopio. Per la valutazione cytometric di flusso, AMs vengono raccolte tramite incubazione con non-enzimatica delle cellule dissociazione della soluzione.
7. Aspirare il terreno di coltura e aggiungere dissociazione soluzione abbastanza per coprire la superficie di cultura (circa 2 mL per fiaschetta T25) e incubare a 37 ° C per 5-10 minuti. Non raschiare sarà necessario, e non è consigliabile per raschiare le cellule meccanicamente. Picchiettare delicatamente i lati, aggiungere 1-2 mL di buffer di flusso/ordinamento e pipettare delicatamente su e giù per staccare la maggior parte delle cellule aderenti.
8. Per gli studi di RNA, lisare le cellule direttamente sulla piastra di coltura con l'aggiunta di tampone di lisi.

Risultati

L'approccio di cytometric di flusso ad identificare mouse AMs è illustrato nella Figura 1. Questo include l'analisi di un insieme minimo di indicatori della superficie necessari nella distinzione AMs da altri fagociti residenti del polmone o del polmone-infiltrazione. Analisi differenziale è necessaria per identificare positivamente AMs da interstiziali macrofagi, cellule dendritiche, neutrofili, monociti e macrofagi polmonari monocito-derivato che si verif...

Discussione

AMs sono longevi polmone residenti macrofagi che popolano i polmoni inizia alla nascita e sopportando sopra l' intero ciclo di vita²⁶. Loro ruolo nella fisiologia polmonare⁷ e patologia¹² e il loro potenziale di prevedere di autoimmunità polmonare²⁴ è stati riconosciuti. Perché AMs hanno una presenza a lungo termine in polmoni^11,27 e perché sono coinvolti nell'atti...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Non-enzymatic cell dissociating solution	Millipore-Sigma	C5789
Puralube Vet Ointment	Dechra	620300
22G Catheter	Terumo Medical Products	SR-OX2225CA
4-0 Non-absorbable silk braided suture	Kent Scientific	SUT-15-2
Dulbecco’s phosphate buffered saline	Corning	21-031-CM
Mouse Fc block	BD Biosciences	553142
Lysis buffer (PureLink RNA Kit)	Thermo Fisher Scientific	12183018A
b-Mercaptoethanol	Millipore-Sigma	M6250
FACSAria II cell sorter	BD Biosciences	644832
Ketamine  (Ketathesia)	Henry Schein	56344
Xylazine  (AnaSed)	Akorn	139-236
RPMI 1640	Corning	10-040-CM
DMEM	Corning	10-017-CM
Liberase TL	Millipore-Sigma	5401020001
DNase I	Millipore-Sigma	AMPD1-1KT
100μm cell strainer	Corning	352360
Human Fc block	BD Biosciences	564220
EDTA	Corning	46-034-CI
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000
Trypan Blue Solution	Thermo Fisher Scientific	15250061
HEPES	Corning	25-060-CI
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11150H
L-929 cell line	American Type Culture Collection	ATCC, CCL-1
Penicillin/Streptomycin	Corning	30-002-CI
Sodium Pyruvate	Corning	25-000-CI
T25 Tissue culture flask	Thermo Fisher Scientific	156367
60 mm culture dish	Millipore-Sigma	CLS3261
15 mL Conical tube	Corning	352097
50 mL Conical tube	Corning	352098
LSRFortessa cell analyzer	BD Biosciences	657669
FlowJo	FlowJo	v10.4	Analysis Software
Anti-CD45 (Mouse)	Biolegend	147709	Clone I3/2.3, FITC conjugated
Anti-CD11b (Mouse)	Biolegend	101228	Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugated
Anti-CD11c (Mouse)	BD Biosciences	565452	Clone N418, BV 421 conjugated
Anti-I-Ab (Mouse)	Biolegend	116420	Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugated
Anti-Siglec-F (Mouse)	BD Biosciences	562757	Clone E50-2440, PE-CF594 conjugated
Anti-Siglec-H (Mouse)	Biolegend	129605	Clone 551, PE conjugated
Anti-F4/80 (Mouse)	Biolegend	123118	Clone BM8, APC/Cy7 conjugated
Anti-Ly-6C (Mouse)	Biolegend	128035	Clone HK1.4, BV605 conjugated
Anti-CD64 (Mouse)	Biolegend	139311	Clone X54-5/7.1, BV711 conjugated
Anti-CD24 (Mouse)	BD Biosciences	563115	Clone M1/69, BV510 conjugated
Anti-CD103 (Mouse)	BD Biosciences	745305	Clone OX-62, BV650 conjugated
Anti-CD317 (Mouse)	Biolegend	127015	Clone 927, APC conjugated
Anti-CXCR1 (Mouse)	Biolegend	149029	Clone SA011F11, BV785 conjugated
Anti-CD45 (Human)	Biolegend	304017	Clone HI30, AF488 conjugated
Anti-CD11b (Human)	Biolegend	101216	Clone M1/70, PE/Cy7 conjugated
Anti-HLA-DR (Human)	Biolegend	307618	Clone L243, APC/Cy7 conjugated
Anti-CD169 (Human)	Biolegend	346008	Clone 7-239, APC conjugated
Anti-CD206 (Human)	Biolegend	321106	Clone 15-2, PE conjugated
Anti-CD163 (Human)	Biolegend	333612	Clone GHI/61, BV421 conjugated