Isolamento e cultura In Vitro de macrófagos alveolares murino e humanos

Resumo

Esta comunicação descreve metodologias para isolamento e cultura de macrófagos alveolares dos humanos e modelos murino para fins experimentais.

Resumo

Os macrófagos alveolares são macrófagos terminalmente diferenciados, pulmão-residente de origem pré-natal. Os macrófagos alveolares são únicos em sua longa vida e o seu importante papel no desenvolvimento pulmonar e função, bem como suas respostas pulmão-localizada a infecção e inflamação. Até à data, nenhum método unificado para identificação, isolamento e manipulação dos macrófagos alveolares com os humanos e ratos existe. Esse método é necessário para estudos sobre essas células imunes inatas importantes em várias configurações experimentais. O método descrito aqui, que pode ser facilmente adoptado por qualquer laboratório, é uma abordagem simplificada para colheita de macrófagos alveolares de líquido de lavagem broncoalveolar ou de tecido pulmonar e mantê-los em vitro. Porque os macrófagos alveolares ocorrem principalmente como células aderentes no alvéolo, o foco desse método é desalojá-los antes da colheita e identificação. O pulmão é um órgão altamente vascularizado, e vários tipos de células de origem mieloide e linfoide habitam, interagem e são influenciados pelo microambiente do pulmão. Usando o conjunto de marcadores de superfície descrita aqui, pesquisadores podem facilmente e de forma inequívoca distinguir outros leucócitos macrófagos alveolares e purificá-los para aplicações a jusante. O método de cultura desenvolvido neste documento suporta ambos humanos e macrófagos alveolares para multiplicação in vitro de rato e é compatível com estudos celulares e moleculares.

Introdução

O microambiente pulmonar é um ecossistema complexo exclusivamente com uma conduta de ar elaborada e vasculatura. O ar inalado viaja através da traqueia e inúmeras ramificações dos brônquios e bronquíolos antes de atingir os alvéolos, onde ocorre a troca de gás de ar-sangue. Devido à interação direta com a atmosfera, a superfície respiratória requer proteção contra os efeitos potencialmente prejudiciais de partículas suspensas no ar e poluentes. Uma série de barreiras físicas, químicas e imunológicas protege os pulmões. Nomeadamente, a implantação dos fagócitos na superfície respiratória serve um sistema importante primeira linha de defesa. Macrófagos alveolares (AMs) são um tipo de fagócitos residente no pulmão, e eles compõem a grande maioria do grupo de macrófagos pulmonares. Como seu nome sugere, AMs são principalmente localizadas para o lúmen alveolar e ocorrem como células sésseis que constantemente a atmosfera ambiente da amostra e comunicar-se com o epitélio alveolar¹. No estado estacionário, pulmões, mais de 95% dos fagócitos no espaço alveolar são AMs², cuja composição pode alterar devido a inflamação, infecção ou exposição crônica aos poluentes.

AMs participarem em uma ampla gama de funções que podem ser locais para os pulmões e/ou de importância sistêmica. Por exemplo, AMs são essenciais para o desenvolvimento e o bom funcionamento dos pulmões; vigilância imunológica; e liberação de restos celulares, invadindo a patógenos e partículas inaladas^3,4,5,6,7. Alvo de depleção de AMs é conhecida por prejudicar a liberação de vírus respiratórios e bactérias^4,8. Além de seu papel como fagócitos e um defensores da primeira linha da homeostase pulmonar, AMs são conhecidos por funcionar como células apresentadoras de antígeno em suscitar T célula imunidade⁹, potencializando a eficácia da vacina intranasal¹⁰ e influenciando a auto-imunidade restrição pulmonar após transplante de pulmão^11,12. Deficiência na função AM tem sido associada a lipoidoproteinose alveolar pulmonar (PAP), uma condição resultante de uma mutação genética, malignidade ou infecção que prejudica o apuramento de surfactantes pulmonares^13,14. Transplante de AMs agora está sendo explorada como uma abordagem terapêutica para o tratamento de PAP ^15,16.

MGA é conhecidas que se originam durante a embriogênese e a persistir nos pulmões durante toda a vida sem ser substituído por leucócitos^2,17de circulação. Embora, volume de negócios AM é indetectável nos pulmões homeostáticos, diferentes níveis de volume de negócios AM têm sido relatados em determinadas condições clínicas, incluindo a infecção pela gripe vírus⁴, mieloablativo irradiação¹⁸, exposição a endotoxina ¹⁹e²⁰anos. MGA é acreditadas para auto renovar através de um baixo grau de proliferação de^17,21, mas alguns estudos recentes afirmam que os monócitos podem dar origem a uma população de pulmão intravascular macrófagos^22,23 , sob condições experimentais, mas a funcionalidade destes recém-convertidos macrófagos pulmonares ainda têm de ser definidos em doenças pulmonares. Além disso, compreender o limiar de estímulo no contexto de ativação AM é uma área potencialmente interessante, como o pulmão tenta preservar um equilíbrio entre os sinais inflamatórios e a maquinaria imunorreguladores.

As alterações fisiológicas ou patológicas que levam à perda do Regulamento imune são importantes para avaliar em vários ambientes clínicos (por exemplo, infecções respiratórias, doença inflamatória pulmonar e doenças pulmonares fibróticas). Não obstante, AMs são cada vez mais reconhecidos como indicadores ou mesmo determinantes da saúde pulmonar^11,24. Atualmente, existem protocolos não unificados disponível para colheita, caracterizando, e/ou manutenção AMs com os humanos e modelos pré-clínicos de murino. Falta de um consenso sobre AM precursores e fenótipos e ausência de uma metodologia detalhada tinham sido grande bloqueio em decifrar função (ões) de AM na doença e na saúde pulmonar. O seguinte protocolo oferece uma identificação definitiva, isolamento e em vitro cultura estratégia extremamente avançar a compreensão do comportamento de AM e facilitar estudos de diagnósticos e terapêuticos AM-alvo.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) o cuidados de Animal institucional e o institucional Review Board (IRB), no Hospital e centro médico de St. Joseph.

1. isolamento de AMs do líquido de lavagem broncoalveolar murino (BAL)

1. Anestesiar um rato C57BL/6 de oito semanas de idade com cetamina (87,5 mg/kg de peso) e xilazina (12,5 mg/kg de peso corporal) coquetel através de uma injeção intraperitoneal. Proceda quando rato atinja a anestesia cirúrgica com perda de reflexos e relaxamento dos músculos.
2. Coloque o mouse sobre uma superfície de dissecação com o lado ventral virada para cima. Aplica a pomada oftálmica veterinário nos olhos para evitar a desidratação e limpe toda a superfície ventral do mouse com almofadas de preparação de álcool estéril saturadas com isopropanol 70% para desinfetar.
3. Monte o mouse com as quatro patas contidas.
4. Abra cuidadosamente a cavidade abdominal com ferramentas micro dissecação. Deve ter cuidado para abrir a área tanto quanto possível sem danificar qualquer órgãos viscerais ou criando tecido pendendo sobre.
5. Abra cuidadosamente a cavidade torácica por incisão lentamente a cavidade torácica através do mediastino. Idealmente, a caixa torácica pode ser extirpada do lado a lado. Extremo cuidado deve ser tomado para não machucar a pleura, dos pulmões durante a abertura da cavidade torácica.
6. Localizar a veia cava inferior e fazer uma incisão para sangrar o mouse. Use almofadas de algodão absorvente para absorver o sangue.
7. Injete soro fisiológico 10ml gelada tamponado de fosfato (PBS) no ventrículo direito (usando a seringa de 10 mL e agulha 25g) para liberar as células do sangue circulantes. Absorva o fluxo de sangue com almofadas de algodão absorvente. Uma vez completamente perfundidos, os pulmões aparecerão branqueados e então estão prontos para lavagem.
8. Delicadamente abri a pele e muscular no pescoço para expor as vias aéreas. Excisar cuidadosamente os músculos adjacentes, cartilagens e tecidos de gordura sem danificar a traqueia.
9. Faça uma pequena incisão (< 2 mm) na traqueia posterior na laringe. Esta incisão deve ser apenas o suficiente para inserir um cateter em enquanto a traqueia continua preso na laringe. Inserir um cateter de 22G 1 polegada sem uma agulha na traqueia em direção aos pulmões. Fixar o cateter com uma sutura trançada seda (4-0; não absorvível) com um nó quadrado.
   Nota: O cateter precisa ser aparado com base no tamanho do mouse. Cateteres de extremamente curtos ou longos tendem a vazar e/ou rasgar a via aérea durante a lavagem. Comprimento do cateter deve ser tal que, quando totalmente inseridos os restos de ponta bem dentro da traqueia e não atingir os brônquios primários.
10. Anexar uma seringa de 1 mL, cheia de buffer de BAL gelado (Ca^{2 +} e Mg^{2 +} grátis PBS + 1 mM de ácido etilenodiaminotetracético, EDTA) para o cateter e incutir lentamente o buffer para os pulmões. Isto irá inflar os pulmões. Manter a seringa anexada ao cateter por cinco segundos e então aspirar o fluido de lavagem puxando suavemente o êmbolo. Isso esvaziará os pulmões. Recolha o líquido em um tubo cônico de 15 mL colocado no gelo.
11. Repita a etapa 1.10 para nove vezes mais e o fluido de lavagem da piscina. Não exceda 1 mL de tampão por descarga, que podem exceder a capacidade pulmonar e levar a sua ruptura.
12. Eutanásia o mouse com overdose de CO₂ por protocolo IACUC aprovado.
13. Centrifugue o líquido 10ml BAL a 250 x g a 4 ° C durante 10 minutos. O centrifugado contém células do BAL.
    Atenção: O sedimento pode ser muito pequeno, então tenha cuidado ao aspirar o sobrenadante.
14. Ressuspender as células do BAL em 100 μL de tampão (PBS + 2% calor inativada soro fetal bovino (FBS) + 1 mM EDTA e ácido N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic (HEPES) de 25 mM) de fluxo/classificação.
15. Bloquear a ligação de anticorpos inespecíficos ao receptor Fc adicionando bloco de Fc de rato (clone 2.4G2, 10 μg/mL) e incubar durante 20 minutos no gelo.
16. Executar o anticorpo que mancha com fluorescência menos um (FMO) e single-mancha controles^11,25. Avaliar o BAL células por um analisador de célula de análise de citometria de fluxo de célula única (ver Tabela de materiais) seguiram pelo software de análise adequada (consulte a Tabela de materiais).
17. Isolar a AMs por uma célula de fluorescência-ativado classificador (ver Tabela de materiais) diretamente em rato 1 mL estou meio de cultura quando AMs destinam-se a cultura in vitro ou no vivo transferência de célula. Como alternativa, tipo AMs em 1 mL de tampão de lise (ver Tabela de materiais) suplementado com 10 µ l/mL de β-Mercaptoetanol para extração de RNA.

2. isolamento de AMs do pulmão do rato, suspensão de célula única

1. Anestesiar um rato C57BL/6 de oito semanas de idade com cetamina (87,5 mg/kg de peso) e xilazina (12,5 mg/kg de peso corporal) coquetel através de uma injeção intraperitoneal. Proceda quando rato atinja a anestesia cirúrgica com perda de reflexos e relaxamento dos músculos.
2. Coloque o mouse sobre uma superfície de dissecação com o lado ventral virada para cima. Aplica a pomada oftálmica veterinário nos olhos para evitar a desidratação e limpe toda a superfície ventral do mouse com álcool estéril almofadas saturadas com isopropanol 70% para desinfetar.
3. Monte o mouse com as quatro patas contidas.
4. Abra cuidadosamente a cavidade abdominal com ferramentas micro dissecação. Deve ter cuidado para abrir a área tanto quanto possível sem danificar qualquer órgãos viscerais ou criando tecido pendendo sobre.
5. Abra cuidadosamente a cavidade torácica por incisão lentamente a cavidade torácica através do mediastino. Idealmente, a caixa torácica pode ser extirpada do lado a lado. Extremo cuidado deve ser tomado para não machucar a pleura, dos pulmões durante a abertura da cavidade torácica.
6. Localizar a veia cava inferior e fazer uma incisão para sangrar o mouse. Use almofadas de algodão absorvente para absorver o sangue.
7. Injete 10 mL PBS gelado no ventrículo direito (usando a seringa de 10 mL e agulha 25g) para liberar as células do sangue circulantes. Uma vez completamente perfundidos, os pulmões aparecerão branqueados e estão prontos para a colheita.
8. Dissecar os pulmões pelo rompimento da traqueia, vasos sanguíneos e ligamentos em um tubo cônico de 15 mL, com 5 mL de frio médio modificado águia de Dulbecco (DMEM). Mantê-lo no gelo até o próximo passo.
9. Eutanásia o mouse com overdose de CO₂ por protocolo IACUC aprovado.
10. Transferi os pulmões perfundidos para um prato de cultura estéril e apirógena 60 mm com 3 mL DMEM. Com a ajuda de pinças de dissecação destrinchar as vias aéreas e outro material duro tecido não-pulmonar, se presente. Picar o tecido pulmonar com um bisturi para < tamanho de 1 mm.
11. Adicionar 300 µ g/mL Liberase TL e 5 U/mL DNase, misturar pipetando e incubar a 37° C numa incubadora por 25 minutos. Misture suavemente uma vez pipetando após 10 minutos.
12. Passe os pulmões dissociados através de um filtro de célula 100 µm instalado em um tubo cónico de 50 mL. Use a volta de um êmbolo de seringa de 1 mL para amassar até grupos de célula no filtro. Lavar o filtro com 20 mL de tampão de lavagem (PBS + 2% de calor inactivada FBS + 2 mM EDTA).
13. Centrifugar a 500 x g a 4 ° C durante 5 minutos. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em 20 mL de tampão de lavagem.
14. Repita as etapas 2.12 e 2.13 duas vezes, mudando o filtro e tubo de cada vez. Pré-imersão o filtro em tampão de lavagem por mais de cinco minutos aumenta o rendimento de AM. Preparar a suspensão de célula única adicionando 100 μL de tampão para o centrifugado de fluxo/classificação.
15. Bloquear a ligação de anticorpos inespecíficos ao receptor Fc adicionando bloco de Fc de rato (clone 2.4G2, 10 μg/mL) e incubar durante 20 minutos no gelo.
16. Execute o anticorpo que mancha junto com FMO e controles de single-mancha^11,25. Avaliar o pulmão células por um analisador de célula (ver Tabela de materiais) seguiram por citometria de fluxo de célula única análise pelo software.
17. AMs tipo por um classificador de pilha (ver Tabela de materiais) diretamente em rato 1 mL estou meio de cultura quando AMs destinam-se a cultura in vitro ou no vivo transferência de célula. Alternativamente, classificar AMs em 1 mL de tampão de Lise suplementado com 10 µ l/mL de β-Mercaptoetanol para extração de RNA.

3. isolamento de AMs de fluido humano BAL

1. Transferir o líquido de BAL humano da clínica para o laboratório a 4 ° C.
2. Centrifugue o fluido BAL (10-50 mL) em 250 x g a 4 ° C durante 10 minutos. O centrifugado contém BAL células¹¹.
3. Lave o pellet com 20 mL de tampão de lavagem (PBS + 2% de calor inactivada FBS + 2 mM EDTA) e centrifugar 250 x g a 4 ° C por 10 minutos.
4. Ressuspender as células do BAL estão em 100 μL de tampão de fluxo/classificação (PBS + 2% de calor inactivada FBS + 1 mM EDTA + 25mm HEPES).
5. Bloquear a ligação de anticorpos inespecíficos ao receptor Fc adicionando humana Fc bloco (clone Fc1.3070, 25 μg/mL) e incubar durante 20 minutos no gelo.
6. Execute o anticorpo que mancha junto com FMO e controles de single-mancha^11,24. Avaliar o BAL células por um analisador de célula (ver Tabela de materiais) seguiram por citometria de fluxo de célula única análise pelo software.
7. AMs tipo por um classificador de célula (ver Tabela de materiais) diretamente em meio de cultura de 1ml AM humana ou 1 mL de tampão de Lise suplementado com 10 µ l/mL de β-Mercaptoetanol.

4. in vitro cultura da AMs

1. Seguindo a classificação de célula, recolher as células por centrifugação a 250 x g a 4 ° C por 10 min.
2. Resuspenda AMs humanas em 1 mL meio de cultura humano AM [Roswell Park Memorial Institute médio (RPMI) suplementado com 10% de 1640 FBS, 20% L-929 cultura sobrenadante (como uma fonte de colônia de macrófagos (M-CSF), fator de concentração final de 100 U/mL), piruvato de sódio 1 mM, 10 mM de ácido N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic (HEPES) e 1 x penicilina/estreptomicina (opcional)]. Da mesma forma, resuspenda mouse AMs em 1ml rato meio de cultura AM [DMEM suplementado com 10% FBS, 20% L-929 cultura sobrenadante (como uma fonte de M-CSF, concentração final de 100 U/mL), 1 mM piruvato de sódio, 10 mM HEPES e 1x penicilina/estreptomicina (opcional )].
3. Enumerar as trypan azul-excluindo células viáveis por um contador de célula e ajustar a concentração de células viáveis em 1 x 10⁶/mL.
   Nota: Idealmente, acima de 5 x 10⁵ AMs pode ser isolado de BAL fluido coletado de um rato masculino C57BL/6 de 8-10 semanas. O rendimento do AM do digest de pulmão do rato é variável e pode ser um pouco menos do que o fluido do mouse BAL. Rendimento de AM de fluido humano BAL depende do volume do fluido BAL, o volume total de soro usado na lavagem e a condição clínica do paciente.
4. Baseado no rendimento e necessidade experimental, as sementes das células em câmara slides, pratos de cultura ou frascos de cultura. Idealmente, as sementes do AMs em 1 x 10⁵/mL, com média de 10 mL em um frasco de cultura de tecidos de T25.
5. Incube as células numa incubadora umidificado de 37 ° C com 5% CO₂ atmosfera.
   Nota: AMs vai crescer como células aderentes e são de crescimento extremamente lento (tempo de duplicação > 7 dias).
6. Em 24 horas após a semeadura, AMs devem ser aderente e não irá ser desanexada por uma mudança suave de meio de cultura. Remover o meio por aspiração de uma extremidade e reabasteça com meio fresco, pre-aquecido a 37 ° C.
   Nota: As células agora podem ser usadas para avaliar a fisiologia de AM ou os efeitos de estímulos. AMs cultivadas em slides câmara podem convenientemente ser manchadas com anticorpos apropriados e são ideais para visualização microscópica. Para avaliação de fluxo cytometric, AMs são colhidos pela incubação com célula não enzimáticos, dissociando a solução.
7. Aspire o meio de cultura e adicionar dissociando solução suficiente para cobrir a superfície de cultura (aproximadamente 2 mL por frasco T25) e incubar a 37 ° C por 5-10 minutos. Não há raspagem será necessário, e não é aconselhável raspar as células mecanicamente. Bata levemente os lados, adicionar 1 a 2 mL de tampão de fluxo/classificação e suavemente Pipetar para cima e para baixo para desanexar a maioria das células aderentes.
8. Para estudos de RNA, lyse as pilhas diretamente sobre o prato de cultura pela adição de Lise.

Resultados

A abordagem de fluxo cytometric identificar rato AMs é mostrada na Figura 1. Isso inclui a análise de um conjunto mínimo de marcadores de superfície necessárias na distinção entre AMs de outros fagócitos residentes pulmonar ou pulmão infiltrando. É necessária análise diferencial de identificar positivamente AMs de intersticiais macrófagos, células dendríticas, neutrófilos, monócitos e macrófagos derivados de monócitos pulmonares que ocorrem...

Discussão

MGA é macrófagos de pulmão-residente de vida longa que povoam os pulmões começando no nascimento e duradouro sobre a extensão de vida inteira²⁶. Seus papéis na fisiologia pulmonar⁷ e patologia¹² e seu potencial para prever de auto-imunidade pulmonar²⁴ foram reconhecidos. Porque AMs tem uma presença de longo prazo em pulmões^11,27 e porque eles estão envolvidos...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Non-enzymatic cell dissociating solution	Millipore-Sigma	C5789
Puralube Vet Ointment	Dechra	620300
22G Catheter	Terumo Medical Products	SR-OX2225CA
4-0 Non-absorbable silk braided suture	Kent Scientific	SUT-15-2
Dulbecco’s phosphate buffered saline	Corning	21-031-CM
Mouse Fc block	BD Biosciences	553142
Lysis buffer (PureLink RNA Kit)	Thermo Fisher Scientific	12183018A
b-Mercaptoethanol	Millipore-Sigma	M6250
FACSAria II cell sorter	BD Biosciences	644832
Ketamine  (Ketathesia)	Henry Schein	56344
Xylazine  (AnaSed)	Akorn	139-236
RPMI 1640	Corning	10-040-CM
DMEM	Corning	10-017-CM
Liberase TL	Millipore-Sigma	5401020001
DNase I	Millipore-Sigma	AMPD1-1KT
100μm cell strainer	Corning	352360
Human Fc block	BD Biosciences	564220
EDTA	Corning	46-034-CI
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000
Trypan Blue Solution	Thermo Fisher Scientific	15250061
HEPES	Corning	25-060-CI
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11150H
L-929 cell line	American Type Culture Collection	ATCC, CCL-1
Penicillin/Streptomycin	Corning	30-002-CI
Sodium Pyruvate	Corning	25-000-CI
T25 Tissue culture flask	Thermo Fisher Scientific	156367
60 mm culture dish	Millipore-Sigma	CLS3261
15 mL Conical tube	Corning	352097
50 mL Conical tube	Corning	352098
LSRFortessa cell analyzer	BD Biosciences	657669
FlowJo	FlowJo	v10.4	Analysis Software
Anti-CD45 (Mouse)	Biolegend	147709	Clone I3/2.3, FITC conjugated
Anti-CD11b (Mouse)	Biolegend	101228	Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugated
Anti-CD11c (Mouse)	BD Biosciences	565452	Clone N418, BV 421 conjugated
Anti-I-Ab (Mouse)	Biolegend	116420	Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugated
Anti-Siglec-F (Mouse)	BD Biosciences	562757	Clone E50-2440, PE-CF594 conjugated
Anti-Siglec-H (Mouse)	Biolegend	129605	Clone 551, PE conjugated
Anti-F4/80 (Mouse)	Biolegend	123118	Clone BM8, APC/Cy7 conjugated
Anti-Ly-6C (Mouse)	Biolegend	128035	Clone HK1.4, BV605 conjugated
Anti-CD64 (Mouse)	Biolegend	139311	Clone X54-5/7.1, BV711 conjugated
Anti-CD24 (Mouse)	BD Biosciences	563115	Clone M1/69, BV510 conjugated
Anti-CD103 (Mouse)	BD Biosciences	745305	Clone OX-62, BV650 conjugated
Anti-CD317 (Mouse)	Biolegend	127015	Clone 927, APC conjugated
Anti-CXCR1 (Mouse)	Biolegend	149029	Clone SA011F11, BV785 conjugated
Anti-CD45 (Human)	Biolegend	304017	Clone HI30, AF488 conjugated
Anti-CD11b (Human)	Biolegend	101216	Clone M1/70, PE/Cy7 conjugated
Anti-HLA-DR (Human)	Biolegend	307618	Clone L243, APC/Cy7 conjugated
Anti-CD169 (Human)	Biolegend	346008	Clone 7-239, APC conjugated
Anti-CD206 (Human)	Biolegend	321106	Clone 15-2, PE conjugated
Anti-CD163 (Human)	Biolegend	333612	Clone GHI/61, BV421 conjugated