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摘要

我们开发了一种新的方法来共同表达多嵌合体荧光融合蛋白在植物中克服传统方法的困难。它利用单一表达质粒, 包含多功能独立蛋白表达盒, 以实现蛋白质的共同表达。

摘要

关于蛋白质的时空亚细胞定位的信息对于了解细胞的生理功能至关重要。荧光蛋白和荧光融合蛋白的生成已被广泛地应用于直接可视化细胞内蛋白质定位和动力学的有效工具。这是特别有用的比较, 他们与知名的细胞器标记后, 共同表达与蛋白质的兴趣。然而, 植物中蛋白质共表达的经典方法通常涉及多个独立的表达质粒, 因此有缺点, 包括低的协同表达效率, 表达水平的变化, 和高的时间基因交叉和筛查的支出。在本研究中, 我们描述了一种健壮和新颖的方法, 共同表达的多嵌合体荧光蛋白在植物。它克服了传统方法的局限性, 采用了由多个半独立表达式盒组成的单表达载体。每个蛋白表达盒都含有其自身的功能蛋白表达元素, 因此可以灵活调整以满足不同的表达需求。同时, 通过优化一步反应, 无需额外的消化和结扎步骤, 在表达质粒中进行 DNA 片段的组装和操作是很容易和方便的。此外, 它完全兼容目前的荧光蛋白衍生生物成像技术和应用, 如烦恼和 BiFC。作为对该方法的验证, 我们采用了这种新的系统来共同表达荧光融合泡排序受体和分泌载体膜蛋白。结果表明, 它们的透视亚细胞定位与以往的研究一样, 都是由植物的瞬时表达和遗传转化引起的。

引言

嵌合荧光融合蛋白被认为是研究细胞内动力学和亚型定位的有用工具, 进一步了解其生理功能和工作机制1,2,3,4. 与所讨论的蛋白质共同表达知名的细胞器报告蛋白, 以更好地说明其在单元格中膜系统中的时空原理、分布和功能, 尤其有益.4,5,6,7,8。

通过瞬时表达和稳定的遗传转化, 可以在植物中表达嵌合体荧光融合蛋白, 其各自的优点和局限性分别为9、10、11。蛋白质的瞬时表达是一种方便的方法, 包括枪法轰击-, 聚乙二醇 (PEG)-, 或电穿孔介导的 DNA 瞬时表达在原生质体和农杆菌介导的叶浸润完整的植物细胞, 如图 1A所示,B12,13,14,15,16。然而, 多嵌合体荧光融合蛋白在单个植物细胞中的联合表达需要多种独立表达质粒的混合物。因此, 在植物中使用多种质粒进行蛋白质共表达的缺点是, 由于几种粒度的几率大大降低, 同时进入同一细胞, 而与单粒,每种质粒的无控制随机量导致的蛋白质表达水平的变化转移到细胞17,18。此外, 在技术上有挑战性的是引入几个独立的表达质粒成一个单一的农杆菌蛋白共表达9,10,11。因此,农杆菌介导的烟叶浸润的蛋白质瞬时表达只能一次表达一种质粒, 如图 1B所示。相反, 产生荧光融合蛋白的转基因植物通常是由带有二进制转化载体的农杆菌实现的。然而, 将基因转移和插入到植物基因组中的二进制载体只能表达单一的荧光融合蛋白 (图 1B)9、10、12。生成一种能同时表达几种嵌合荧光蛋白的转基因植物需要多轮的基因交叉和筛查, 这可能需要数月到数年, 这取决于要共同表达的基因的数量。

就业一个单一表达载体的多种蛋白质的共同表达在植物已经报告了几个以前的研究19,20,21。然而, 在蛋白质共表达或过度表达的最终质粒的生成中, 通常需要对 dna 分子和主干载体进行多轮酶消化和 dna 结扎。在这里, 我们开发了一种新的和稳健的方法来共同表达多嵌合体荧光蛋白在植物中。它是一种高效、方便的方法, 在植物中实现了多种蛋白质的共同表达, 既具有瞬态表达, 又能稳定地转化为一种时间的方式。它使用一个单一的载体, 包含多个功能独立的蛋白表达盒, 为蛋白质的共同表达, 从而克服了传统方法的弊端。此外, 它是一个高度多才多艺的系统, 其中 dna 操作和组装是通过简单的一步优化反应, 没有额外的步骤 dna 消化和结扎。工作原理如图 2所示。此外, 它完全兼容目前的细胞, 分子和生物化学的方法, 基于嵌合体荧光融合蛋白。

研究方案

1. 底漆设计策略和 DNA 放大

  1. 设计 DNA 片段分子克隆的引物。该引物包括20个 bp 基因特异结合序列和20到 25 bp 5 '-端悬架序列, 这是互补重叠序列的相邻 DNA 分子 (见表 1例)。
    注: 每个 DNA 片段的后续组装, 不同蛋白表达盒的连接, 以及与最终表达载体的整合都取决于相邻重叠序列的识别。
  2. 扩增 DNA 片段, 包括启动子、荧光记者、靶基因和终结器, 这些都是用标准 PCR 反应构建半独立蛋白表达盒的必要条件, 并与其相应的引物和高保真聚合酶。
    注: 本研究中使用的用于 DNA 扩增的模板是从以前的研究15、22、23中得出的。PCR 反应的退火温度和延长时间为引物和基因依赖性。

2. DNA 片段组装与蛋白表达盒的构建

  1. 通过 DNA 电泳和分光光度法对第一轮 PCR 产品的质量进行检验。检查1% 琼脂糖凝胶电泳是否发生 DNA 降解和污染。PCR 产品的 OD260/OD280 应介于1.6 和1.8 之间。
  2. 将不同的 DNA 片段 (每个片段的 0.05-0.1 pmol) 混合成一个新的 PCR 管, 最终体积为5µL。
    注: 混合 DNA 分子设计为同一蛋白表达盒一起在一个 PCR 管。避免将来自不同表达式卡带的 dna 混合在一起, 因为它将降低 dna 组装的效率, 因为 dna 分子的数量越来越多, 需要链接。
    注意: 协议可以在这里暂停。
  3. 准备 5x ISO 库存缓冲器: 500 毫米三盐酸, pH 值 7.5;50毫米氯化镁2;1毫米核苷酸 (dNTP);50毫米 dithiothreitol;25% 聚乙二醇 (PEG) 8000;5毫米烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD)。
  4. 使1毫升2x 主混合物从400µL 5x ISO 库存缓冲器, 7.5 单位的 T5 exonuclease, 62.5 单位的高保真 DNA 聚合酶, 5000 单位 Taq 聚合酶 (见材料表), 并灭菌双蒸馏 H2O。
    注: 这是从以前的研究24,25,26适应;应优化这些卷。
  5. 整除100µL 的2x 主混合物每管和存储在-20 摄氏度。
    注意: 经常冷冻和解冻2x 主混合物会导致低 DNA 组装效率。
  6. 添加15µL 2x 主混合物的5µL DNA 混合物和孵化50°c 60 分钟。

3. 植物多嵌合体荧光融合蛋白共表达载体的构建

  1. 利用 0.5-1.0 µL 的第一轮等温反应作为模板和最外层的底漆 (例如, 1-FP35S 和 1-RNOS, 以第二轮 PCR 的方式放大整个半独立蛋白表达盒卡带 1)。
    1. 使用1单位的高保真聚合酶在50µL 反应体积后30个周期 (94 °c 为三十年代, 55 °c 三十年代和68°c 为2分钟), 其次是最后的延长在68°c 为5分钟。
  2. 进行线性化最后的蛋白表达主干载体 pUC18 和 pCAMBIA1300, 分别设计为蛋白质瞬时表达和遗传转化, 通过增加4个单位Sma I 到最后10µL 反应量和孵化 1-2小时25摄氏度。在65摄氏度处孵化20分钟, 禁用限制酶。
  3. 将蛋白表达盒和线性化最终载体的摩尔 DNA 分子混合成5µL 的最终反应量。然后, 进行第二轮 DNA 重组, 混合15µL 2x 主缓冲和孵化在50摄氏度60分钟。
  4. 使用第二轮等温重组反应的最终产物, 根据标准程序27转换合格的大肠杆菌细胞 (如DH5α)。通过菌落 PCR 和 DNA 测序对阳性菌落进行双重检查。用微型质粒提取试剂盒从大肠杆菌中提取阳性粒, 并贮存在-80 摄氏度。
    注意: 对于长期贮存, 在 TE 缓冲器或双蒸馏 H2O 中溶解的质粒比保持大肠杆菌菌株更稳定。

4. 枪法-轰击介导的多嵌合体荧光融合蛋白在植物中的瞬态联合表达

  1. 准备烟草 BY-2 悬浮细胞和拟南芥幼植物进行轰炸。
    1. 培养 BY-2 细胞在 Murashige 和 Skoog (MS) 培养基由传代每星期两次在25°c 在 130 rpm 设置的振动筛。过滤器收集30毫升 3 d 培养 BY-2 细胞到一块70毫米蒸压过滤纸通过真空泵通过设置真空压力到40毫巴。
    2. 为了防止细胞在以下步骤中干燥, 在放置过滤纸之前, 在培养皿中加入几滴 BY-2 细胞液体培养基 (下一步)。
    3. 将过滤纸与 BY-2 细胞转移到一个新的培养皿 (85 毫米 x 15 毫米)。
    4. 表面消毒拟南芥(Col-0) 种子的涡流混合物与 70% (v/v) 乙醇含有0.05% 吐温20为10分钟。
    5. 用台式离心机以最大速度旋转2秒的种子, 取出上清液, 并在三十年代一次性用100% 乙醇清洗种子. 将种子移出新的无菌滤光纸中。然后, 风干的种子, 并传播到½ MS 琼脂板块。
    6. 将板材在4摄氏度前贮存48小时, 然后将其转移到植物生长室, 其设置如下:16 h 光/8 h 暗与 120-150 µm m-2 s-1强度, 22 °c.
    7. 将7天的老样本植物转移到一个直径为30毫米的新½ MS 中板中心, 以提高轰击效率。
      注意事项: 在转移和放置到新的½ MS 板上时避免重叠植物。
    8. 在植物或组织的表面添加几滴½ MS 液体培养基, 以保持水分, 并防止在以下步骤中干燥植物。
  2. 用质粒 DNA 涂层金颗粒。
    1. 涡金载体溶液彻底, 3 分钟, 准备一个新的1.5 毫升管。
    2. 按顺序将以下溶液加入管和涡:25 µL (1.5 毫克) 金粒子, 涡旋十年代;10µL 25.46 毫克/升胺, 漩涡十年代;5µL 1µg/µL 质粒 DNA, 涡旋3分钟;25µL 277.5 毫克/升 CaCl2溶液, 涡旋1分钟。
      注意: 在此步骤中保持涡流。
    3. 在5秒的最大速度下, 用一台台式离心机将金载体, 仔细地取出上清液, 而不干扰颗粒。用200µL 的绝对乙醇洗净, 并在 5-十年代的漩涡中重新悬浮颗粒. 以最大速度旋转5秒, 然后取出乙醇。
    4. 在18µL 的绝对乙醇和整除6µL 颗粒悬浮在三 macrocarriers 中间, 重新悬浮金粒子。让他们风干。
  3. 通过粒子轰击将 DNA 转移到植物中。
    1. 将粒子输送系统设置为: 1100 psi、28毫米汞真空、1厘米间隙距离和9厘米粒子飞行距离。
    2. 在三不同位置上轰击琼脂培养基板上的细胞/植物三次, 然后在轰炸后立即将细胞/植物置于黑暗中。
      注意事项: 在操作颗粒输送系统时佩戴安全眼镜, 因为高压气体和高速粒子与系统的关联。
  4. 在观察荧光信号之前, 在植物生长室中保持6到72小时在黑暗中被轰击的细胞/植物。将植物生长室设置为 24 h 暗和22°c。
    注意: 表达效率和荧光信号强度均为启动子、基因和植物/组织依赖性。

5. 通过农杆菌介导的转化, 生成稳定的转基因拟南芥共同表达多嵌合荧光蛋白。

  1. 在冰上解冻农杆菌主管细胞 (PMP90), 等待30分钟, 然后将2µL 二进制向量 (100-200 ng) 添加到主管细胞中。把混合物放在冰上坐10分钟。
  2. 将混合物转化为预冷的0.1 厘米电穿孔试管。将试管插入电穿孔系统并进行电穿孔, 其设置如下: 1.6 伏, 600 欧姆, 25 µF。
  3. 在电穿孔后立即在试管中加入1毫升的 SOC 液体培养基, 将细胞注入新的1.5 毫升管, 并在28摄氏度的水平轨道振动筛中孵育200转120分钟。
  4. 离心细胞在 2348 x g 室温5分钟, 丢弃大部分上清, 轻轻地重新悬浮颗粒细胞与吸管尖端, 传播他们在一个含有50毫克/升潮霉素 B 的 LB 板, 并孵化28摄氏度 2-3 天。
  5. 将拟南芥Col-0 植物与农杆菌相结合, 其中含有与多蛋白表达盒集成的二进制向量 pCAMBIA1300, 由花浸28法, 如前所述生成稳定的转基因植物。
  6. 将转基因拟南芥种子的表面与含有0.05% 吐温20的 70% (v/v) 乙醇混合, 杀菌。旋涡为10分钟. 用台式最高离心机在2秒的最大速度下旋下种子, 取出上清, 并在三十年代用100% 乙醇清洗种子。
  7. 将种子移到无菌的滤光片中。此后, 空气干燥并将其传播到含有潮霉素 B 的½ MS 琼脂板上, 以筛选阳性后代。
  8. 在4摄氏度孵化出2天的盘子。然后, 将它们转移到植物生长室和培养7天。
  9. 通过在荧光显微镜下检查荧光信号, 选择7天的老存活幼株, 然后将植物转化为土壤, 进一步筛选纯合植物。

6. 药物治疗

  1. 对于药物治疗, 在细胞或植物孵化前, 将液体 MS 培养基中的每种药物稀释到适当的工作浓度。
    1. Wortmannin 处理: 通过将 Wortmannin 粉溶于亚砜, 并贮存在-20 摄氏度的库存, 制备出1毫米的 Wortmannin 溶液。将植物细胞或幼株转移到含有16.5 µM wortmammin 的液体 MS 培养基中, 在成像前孵化 30-45 分钟。
    2. Brefeldin (博鳌): 通过在亚砜中溶出博鳌粉末, 并储存在-20 摄氏度的股票, 准备1毫米的亚洲论坛的库存解决方案。在成像前, 将植物细胞或幼植物转移到含有10µg/mL 论坛的液体 MS 培养基中, 30-45 分钟。

7. 共焦显微镜成像和蛋白质亚细胞共定位分析

  1. 将幼株或悬浮细胞转移到传统的玻璃滑梯上, 用标准共焦激光扫描显微镜轻轻地将盖子滑动在顶部进行成像。使用以下设置: 63X 水目标 (1.4), 0 背景, 700 增益, 0.168 毫米像素尺寸, 光电倍增管探测器。激发 GFP 标记的蛋白质在485毫微米和检测荧光在 525 nm。对于 RFP 标记的蛋白质, 激发在514毫微米和检测在 575 nm。
  2. 用图像 J 软件 (https://imagej.nih.gov/ij/) 与皮尔逊-长矛相关 (PSC) 的联合本地化插件计算荧光信号的共定位比, 如前所述8。皮尔逊相关系数或长矛的秩相关系数显示在结果中 (图 4)。所生成的 r 值将从-1 到1。0显示两个信号没有可检测的相关性, 而 +1 和-1 分别显示两个信号的完全正和负相关。

结果

建立了一种健壮高效的多嵌合体荧光融合蛋白在植物中的联合表达方法。它突破了传统方法的障碍使用多种分离质粒进行蛋白质共表达, 如图 1AB所示,通过瞬时表达或稳定的遗传转化。在这一新的方法中, 我们生成一个单一的表达载体, 由多个蛋白表达盒组成, 以实现蛋白质共表达一次 (图 1C, D)。?...

讨论

在此, 我们展示了一种新的方法, 以有力地共同表达嵌合体荧光融合蛋白的植物。它既可用于瞬态表达和遗传转化, 又能与当前基于荧光蛋白的生物成像、分子、生物化学应用和技术相兼容9、10、13.此外, 它克服了传统方法的困难, 使用几个单独的表达质粒的蛋白质共同表达。相比之下, 它使用一个单一的表达载体, 其中包含多个?...

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

我们感谢王实验室的成员提供了有益的讨论和意见。这项工作得到了中国国家自然科学基金 (自然科学基金, 31570001 号赠款) 和广东省和广州市自然科学基金 (2016A030313401 和 201707010024) 的支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
KOD-FX PolymeraseTOYOBOKFX-101
Sma INEBR0141L/S/V
Tris-HClBBIA600194-0500
MgCl2BBIA601336-0500
dNTPNEB#N0447V
DTTBBIC4H10O2S2
PEG 8000BBIA100159-0500
NADBBIA600641-0001
T5 exonucleaseEpicentreT5E4111K
Phusion High-Fidelity DNA polymeraseNEBM0530S
Taq DNA polymeraseNEBB9022S
Murashige and Skoog Basal Salt Mixture(MS)SigmaM5524
EthanolBBIA500737-0500
Tween 20BBIA600560-0500
AgarBBIA505255-0250
SpermidineBBIA614270-0001
Gold microcarrier particlesBio-Rad165-22631.0 µm
CaCl2BBICD0050-500
MacrocarriersBio-Rad165-2335
Rupture diskBio-Rad165-2329
Stopping screenBio-Rad165-2336
TryptoneOXOIDLP0042
Yeast ExtractOXOIDLP0021
NaClBBIA610476-0001
KClBBIA610440-0500
GlucoseBBIA600219-0001
Hygromycin BGenviewAH169-1G
WortmanninSigmaF9128
Brefeldin ASigmaSML0975-5MG
Dimethylsulphoxide (DMSO)BBIA600163-0500
T100 Thermal CyclerBio-Rad1861096
Growth chamberPanasonicMLR-352H-PC
PSD-1000/He particle delivery systemBio-Rad165-2257
Gene PulserBio-Rad1652660
CuvetteBio-Rad1652083
Benchtop centrifugeEppendorf5427000097
Confocal microscopeZeissLSM 7 DUO (780&7Live)
NanoDrop 2000/2000c SpectrophotometersThermo Fisher ScientificND-2000
EPS-300 Power SupplyTanonEPS 300
Fluorescent microscopeMshotMF30
AgroseBBIA600234
AmpicillinBBIA100339
Ethylene Diamine Tetraacetie AcidBBIB300599

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