АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы разработали новый метод для совместного выражения несколько химерных флуоресцентные синтез белков в растения преодолевать трудности обычных методов. Он принимает преимущество использования плазмида одного выражения, содержащего несколько функционально независимой белка, выражая кассет для достижения совместного выражения протеина.

Аннотация

Информация о пространственно-временных внутриклеточных localization(s) белок имеет решающее значение для понимания ее физиологических функций в клетках. Флуоресцентные белки и поколения флуоресцентные синтез белков дико использовались как эффективный инструмент непосредственно визуализировать локализация белка и динамика в клетках. Это особенно полезно сравнить их с известным органеллы маркеры после совместного с белками проявление интереса. Тем не менее обычно включают несколько независимых выражений плазмид классические подходы для совместного выражения протеина в растениях и поэтому имеют свои недостатки, которые включают низких совместно выражение эффективности, уровня выражения вариации и высокое время расходы в генетических пересечения и скрининг. В этом исследовании мы описываем надежные и Роман метод для совместного выражение несколько химерных флуоресцентных белков в растениях. Он преодолевает ограничения обычных методов, используя одно выражение вектор, состоящий из нескольких полунезависимых выражая кассеты. Каждая кассета выражение протеина содержит элементы выражения своих собственных функциональных белков, и поэтому она может быть гибко скорректирована для удовлетворения спроса на разнообразные выражения. Кроме того это просто и удобно для выполнения сборки и манипуляции с ДНК фрагментов в выражение плазмида с помощью оптимизированного одношаговый реакции без дополнительных пищеварение и перевязка шаги. Кроме того он полностью совместим с текущей флуоресцентный белок Производные био изображений технологий и приложений, таких как ладу и БМФЦ. Как проверка метода мы использовали эту новую систему совместного Экспресс дневно сплавили вакуолярной сортировки рецепторов и несущей мембранных белков. Результаты показывают, что их перспективы субцеллюлярные локализации такие же, как предыдущие исследования переходных выражение и генетической трансформации в растениях.

Введение

Химерных флуоресцентные синтез белков было рассматривать как полезные инструменты для изучения внутриклеточных динамика и внутриклеточных локализации и более глубокого понимания их физиологических функций и рабочих механизмов1,2, 3 , 4. Это особенно выгодно для совместного Экспресс известных органеллы репортер белки с белком, о котором идет речь, чтобы лучше проиллюстрировать его пространственно-временных обоснование, распределение и функции в системе endomembrane в клетки4 , 5 , 6 , 7 , 8.

Химерных флуоресцентные синтез белка может быть выражено в растения через переходные выражение и стабильные генетические трансформации, которые имеют свои соответствующие преимущества и ограничения9,10,11. Переходных выражение протеина является удобный подход, который включает в себя баллистической бомбардировки-, полиэтиленгликоль (PEG)-, или электропорация опосредованной ДНК переходных выражение в протопласта и Agrobacterium-опосредованного проникновения лист в клетки растений нетронутыми, как показано на рисунке 1A, B12,13,14,,1516. Однако, Сопредседатель выражение несколько химерных флуоресцентные синтез белков в одном растительной клетки требует смесь нескольких независимых выражений плазмид. Таким образом, недостатки использования нескольких плазмиды для совместного выражения протеина в растениях, низких совместно выражение из-за резко снижение шансов несколько плазмид одновременно ввести те же клетки, когда по сравнению с одной плазмида и вариации уровнях выражения протеина, вызванные неудержимо случайное количество каждого типа плазмида, передаваемых в ячейке17,18. Кроме того это технически сложно внедрить несколько независимых выражений плазмид в единый Agrobacterium белка совместного выражения9,10,11. Таким образом, Agrobacterium-опосредованной белка, переходных выражение проникновения табака выходит только способен выражения одного плазмида в то время, как показано на рисунке 1B. В отличие от поколения трансгенных растений, выражая флуоресцентные синтез белков обычно достигается Agrobacterium , который несет Двоичные преобразования вектора. Однако бинарный вектор, которая опосредует перенос генов и вставки в геномах растений способен только выражения одного флуоресцентные фьюжн белка (рис. 1B)9,10,12. Создание трансгенных растений, которая выражает несколько химерных флуоресцентных белков одновременно требует нескольких раундов генетических пересечения и отбора, которая может занять от месяцев до года в зависимости от числа генов быть совместно выразили.

Занятости, что одно выражение вектор для совместного выражение несколько белков в заводе было сообщено несколько предыдущих исследований19,,2021. Однако для генерации окончательный плазмида совместного выражения протеина или гиперэкспрессия обычно требуется несколько раундов ферментативного пищеварения и перевязка ДНК молекул ДНК и магистральной векторов. Здесь мы разработали новый и надежный метод для совместного выражения несколько химерных флуоресцентных белков в растениях. Это очень эффективный и удобный способ, который достигает несколько совместного выражения протеина в растениях и переходных выражения и стабильной преобразования в освященной веками моды. Он использует единый вектор, содержащий несколько функционально независимой белка выражение кассеты для совместного выражения протеина и тем самым преодолевает недостатки обычных методов. Кроме того это очень гибкая система, в которой ДНК манипуляции и Ассамблеи достигается простой одношаговый оптимизированный реакции без дополнительных шагов ДНК пищеварение и перевязки. Принцип работы показана на рисунке 2. Кроме того он полностью совместим с текущей сотовой, молекулярной и биохимической подходы, основанные на химерных флуоресцентные синтеза белков.

протокол

1. грунтовка разработки стратегии и амплификации ДНК

  1. Дизайн праймеров для молекулярное клонирование фрагментов ДНК. Праймеры состоят из 20 bp последовательностей гена конкретной привязки и 20-25 bp 5'-конце навеса последовательностей, которые являются взаимодополняющими перекрывающихся последовательность соседних молекул ДНК (см. таблицу 1 для примера).
    Примечание: Последующие сборки каждого ДНК фрагментов, увязка различных белков выражение кассет, и интеграции с вектором окончательное выражение все зависит от признания соседних перекрывающихся последовательностей.
  2. Усилить фрагментов ДНК, включая промоутер, флуоресцентный репортер, целевых генов и Терминатор, которые являются необходимыми для строительства полуавтономных белка выражение кассеты по стандартным ПЦР-реакции с их соответствующими праймерами и высокая верность полимеразы.
    Примечание: Шаблоны, используемые в данном исследовании для амплификации ДНК являются производными от предыдущих исследований15,,22-23. Отжига температура и расширение время ПЦР-реакции являются грунт и зависимых генов.

2. ДНК фрагмента Ассамблеи и строительство кассеты выражения протеина

  1. Изучить качество продуктов ПЦР первом туре методом электрофореза ДНК и количественно спектрофотометра. Проверьте, произошли ли ДНК деградации и загрязнения, электрофорезом геля агарозы 1%. OD260/OD280 продуктов PCR должна быть между 1.6 и 1.8.
  2. Смешивать различные фрагменты ДНК (0.05 - 0.1 пмоль каждого фрагмента) в новом ПЦР-пробирку в окончательный объем 5 мкл.
    Примечание: Молекулы ДНК смесь предназначена для же кассету выражение протеина вместе в одном ПЦР-пробирку. Избегайте смешивания ННУ из различных выражений кассеты вместе, так как это снизит эффективность Ассамблеи ДНК за счет увеличения числа молекул ДНК, которые должны быть связаны.
    Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь.
  3. Подготовить 5 x ISO запасов буфера: 500 мм трис-HCl, рН 7,5; 50 мм MgCl2; 1 мм deoxynucleotide (dNTP); Дитиотреитол 50 мм; 25% полиэтиленгликоля (PEG) 8000; и 5 мм Никотинамидадениндинуклеотид (NAD).
  4. Сделать 1 мл 2 x мастер смесь из 400 мкл 5 x ISO запасов буфера, 7,5 единиц при exonuclease T5, 62,5 единиц высокой верности ДНК-полимеразы, 5000 единиц полимеразы Taq (см. Таблицу материалы), и стерилизовать двойной дистиллированной H2O.
    Примечание: Это адаптирован из предыдущих исследований24,,2526; Эти тома должны быть оптимизированы.
  5. Аликвота 100 мкл 2 x мастер смесь в трубки и хранить при температуре от-20 ° C.
    Предупреждение: Частые замораживания и оттаивания 2 x мастер смеси может привести к низкой эффективности Ассамблеи ДНК.
  6. 15 мкл 2 x мастер смесь 5 мкл ДНК смесь и Инкубируйте на 50 ° C 60 мин.

3. Строительство вектора для совместного выражение несколько химерных флуоресцентные синтез белков в растений

  1. Усилить выражение кассету целиком полунезависимую белка второй раунд ПЦР с помощью продукта (0,5 - 1,0 мкл) от первого раунда изотермический Ассамблея реакции как шаблон и внешней грунтовки (например, 1-FP35S и 1-RNOS для выражения Кассета 1).
    1. Использование 1 единица высокой верности полимеразы в объеме 50 мкл реакции следуют 30 циклов (94 ° C за 30 сек, 55 ° C за 30 s и 68 ° C на 2 мин), а затем окончательное расширение на 68 ° C за 5 мин.
  2. Линеаризации окончательный белка выражение позвоночника векторов pUC18 и pCAMBIA1300, которые предназначены для переходных выражения протеина и генетической трансформации, соответственно, путем добавления 4 единицы Sma я в окончательный объем реакции 10 мкл и инкубирования 1 - 2 ч при 25 ° C. Инактивирует энзима ограничения по инкубации при 65 ° C для 20 мин.
  3. Смешайте эквимолярных ДНК молекул белка выражение кассеты и линеаризованное окончательного вектора в том окончательный реакции 5 мкл. Затем выполните второй раунд рекомбинации ДНК путем смешивания с 15 мкл 2 x мастер буфера и инкубации при 50 ° C 60 мин.
  4. Используйте окончательные продукты реакции второго раунда изотермический рекомбинации чтобы преобразовать сведущее Escherichia coli клетки (например, DH5α), в соответствии со стандартными процедурами27. Перепроверить положительных колоний на ПЦР секвенирования колонии. Извлеките положительных плазмид от кишечной палочки с помощью мини-плазмида добыча комплект и хранить при температуре-80 ° C.
    Предупреждение: Для длительного хранения, плазмиды растворенными в буфере TE или двойной дистиллированной H2O более устойчивы, чем держать их в штаммов E. coli .

4. баллистической бомбардировка опосредованной переходных Сопредседатель выражение несколько химерных флуоресцентные синтез белков в растений

  1. Подготовка табака BY-2 подвеска клетки и несовершеннолетних растения арабидопсис для бомбардировки.
    1. Культура по-2 клетки в среде фотосинтетическую и Скуг (МС), subculturing два раза в неделю при 25 ° C в шейкере на 130 об/мин. D сбор 30 мл 3 фильтр культивированный BY-2 клетки на кусок 70-мм газобетона фильтровальной бумаги через в вакуумный насос, установив вакуумного давления 40 мбар.
    2. Для того, чтобы предотвратить клетки от пересыхания во время следующих шагов, добавьте несколько капель BY-2 клетки жидкой культурной среды в чашке Петри перед размещением фильтровальная бумага (следующий шаг).
    3. Передать фильтр бумага с BY-2 клетки на нем новый Петри (85 мм x 15 мм).
    4. Поверхность стерилизовать Arabidopsis thaliana (Col-0) семена, vortexing смесь с 70% (v/v) этанола, содержащие 0,05% Tween-20 за 10 мин.
    5. Спин вниз семена с помощью центрифуги Топ скамейке на Макс скорость для 2 s, удалить супернатант и мыть семена с 100% этанола один раз за 30 с. пипетку из семян на новых стерильных фильтровальную бумагу в стерильных Худ. Затем просушите семена и распространения их на ½ MS плиты агара.
    6. Хранить пластины на 4 ° C за 48 часов до их передачи в камере роста растений со следующими параметрами: 16 h свет 8 h темные с 120-150 мкм м-2 s-1 интенсивностью, 22 ° C.
    7. Передача 7 - день старого образца растений в круг диаметром 30 мм в центре новой ½ MS средних пластины для повышения эффективности бомбардировки.
      Внимание: Избегайте дублирования растений при передаче и размещение их на новую пластину ½ MS.
    8. Добавьте несколько капель ½ MS жидкой среды на поверхности растений или ткани для сохранения влаги и предотвращения высыхания растений, на следующих этапах.
  2. Герб золотые частицы с плазмидной ДНК.
    1. Вихревой золото microcarrier раствор тщательно, на 3 мин готовят новый 1,5 мл трубки.
    2. Последовательно добавить следующие решения в трубку и вихревой: 25 мкл (1,5 мг) золотые частицы, вихревой 10 s; 10 мкл 25,46 мг/Л спермидина, вихревой 10 s; 5 мкл 1µg/мкл плазмидной ДНК, вихревой 3 мин; 25 мкл 277.5 мг/л раствора2 CaCl, вихревые 1 мин.
      Внимание: Держите vortexing во время этого шага.
    3. Спин вниз золото microcarriers, с помощью скамейке Топ центрифуги на Макс скорость 5 s и тщательно пипетку вне супернатант не нарушая гранулы. Вымойте с 200 мкл абсолютного этанола и вновь приостановить Пелле, вихревые за 5-10 с. спин вниз на Макс скорость 5 s и удалить этанола.
    4. Вновь приостановите золотые частицы в 18 мкл абсолютного этанола и аликвота 6 мкл частицы подвеска на середине трех macrocarriers. Дайте им высохнуть на воздухе.
  3. Передача ДНК в растения через бомбардировка частиц.
    1. Установите систему доставки частиц следующим: 1100 psi, 28-мм Hg вакуума, разрыв 1 см расстояние и дальность полета-9см частиц.
    2. Бомбардируют клетки, растения на средних плита агара три раза в три различные позиции, а затем сохранить клетки, растения в темноте сразу же после бомбардировки.
      Предупреждение: Носить защитные очки при работе с системой доставки частиц из-за ассоциации высокого давления газа и высокоскоростных частиц с системой.
  4. Держите обстреляли клетки, растения в темноте в камере роста растений для 6 до 72 часов до наблюдения флуоресцентные сигналов. Установите камеры роста растений 24 h темно и 22 ° C.
    Предупреждение: Выражение эффективность и интенсивность флуоресцентного сигнала являются промоутер - ген- и завод/ткани зависимых.

5. создание стабильной трансгенных Arabidopsis, совместно выражая несколько химерных флуоресцентных белков, Agrobacterium-опосредованной трансформации.

  1. Оттепель Agrobacterium сведущие клетки (PMP90) на льду и подождите 30 минут, затем добавить 2 мкл бинарный вектор (100-200 ng) (подготовлен выше) в компетентных клетки. Смесь сидите на льду за 10 мин.
  2. Передача смеси в кювет электропорации предварительно охлажденные 0,1 см. Вставить кювета в системе электропорации и выполнить электропорации с следующими параметрами: 1,6 кв, 600 Ом, 25 МКФ.
  3. Добавьте 1 mL SOC жидкой среды в кювет сразу же после электропорация, Пипетка клетки в новой 1,5 мл трубку и Инкубируйте на 28 ° C в горизонтальной орбитальный шейкер на 200 об/мин для 120 мин.
  4. Центрифуга клетки на 2348 x g при комнатной температуре в течение 5 мин, отменить большинство супернатанта, нежно вновь приостановить гранулированных клетки с кончиком пипетки, выкладывают их на плиту LB содержит 50 мг/Л Hygromycin B и Инкубируйте на 28 ° C на 2-3 дней.
  5. Преобразования Arabidopsis thaliana Col-0 растения с Agrobacterium, который содержит бинарный вектор pCAMBIA1300, интегрирована с несколькими кассеты выражение протеина, методом28 цветочные купанием как описано в генерировать стабильные трансгенных растений.
  6. Стерилизовать поверхности трансгенных семян Arabidopsis, смешивая их с 70% (v/v) этанола, содержащие 0,05% 20 анимации. Вортекс для 10 min. спин вниз семена с помощью центрифуги Топ скамейке на Макс скорость для 2 s, удалить супернатант и мыть семена с 100% этанола один раз за 30 s.
  7. Пипетка, семена на стерильного фильтра бумагу в стерильных Худ. После этого воздух сухой и распространения их на ½ MS плиты агара, содержащие Hygromycin B для скрининга позитивные потомков.
  8. Инкубируйте пластины на 4 ° C на 2 дня. Затем перенесите их в камере роста растений и культуру для 7 дней.
  9. Выберите 7 - дневных выживания несовершеннолетних растений, установив для флуоресцентных сигналов под флуоресцентный Микроскоп, а затем передавать растений в почву для дальнейшего скрининга гомозиготных растений.

6. фармацевтического лечения

  1. Для фармацевтического лечения развести каждого лекарства в жидкой среде MS в ее соответствующих рабочих концентрациях до инкубации клеток или растений.
    1. Вортманнин лечение: подготовить 1 мм акций решения Вортманнин путем растворения порошка Вортманнин в ДМСО и хранить запасы при-20 ° C. Передача несовершеннолетних растений или растительных клеток в жидкой среде MS, содержащие 16,5 микрон wortmammin и Инкубируйте 30-45 мин до изображений.
    2. Лечение Brefeldin (БФА): подготовка 1 мм запасов решений БФА путем растворения порошка БФА в ДМСО и хранить запасы при-20 ° C. Передача несовершеннолетних растений или растительных клеток в жидкой среде MS, содержащие 10 мкг/мл БФА за 30-45 мин до изображений.

7. Конфокальный микроскоп изображений и белка субцеллюлярные Сопредседатель локализации анализ

  1. Передача несовершеннолетних растений или подвеска клетки на слайд обычного стекла и аккуратно положить слайд крышка на верхней части для изображений, стандартных Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия. Используйте следующие параметры: 63 X воды цель (N.A 1.4), 0 фон, 700 выгоды, размер пикселя 0,168 мм и фотоэлектронный умножитель Трубка детектора. Возбуждают GFP-тегами белков в 485 Нм и обнаруживать флуоресценции в 525 Нм. Для ЗП тегами белков, возбуждают в 514 Нм и обнаружить на 575 Нм.
  2. Вычислить коэффициент совместного локализации флуоресцентные сигналов с использованием изображений J программного обеспечения (https://imagej.nih.gov/ij/) с Пирсона и Спирмена корреляции (PSC) совместно локализации плагин как описано8. Коэффициенты корреляции Пирсона или ранга коэффициенты корреляции Спирмена отображаются в результатах (рис. 4). Значения производимых r будет от -1 до 1. 0 демонстрирует отсутствие обнаружению корреляции двух сигналов, тогда как + 1 и -1 показывают полный положительной и отрицательной корреляции, соответственно, двух сигналов.

Результаты

Мы разработали надежные и очень эффективный метод для совместного выражения несколько химерных флуоресцентные синтез белков в растениях. Оно ломает через барьеры обычных подходов использовать несколько разделенных плазмиды для совместного выражения протеина, как ?...

Обсуждение

Здесь мы продемонстрировали новый метод выразить энергично совместно химерных флуоресцентные синтез белков в растениях. Он может использоваться для переходных выражения и генетической трансформации и совместим с текущей флуоресцентного белка на основе био изображений, молекулярно?...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы благодарим членов Ван лаборатории полезные обсуждения и комментариев. Эта работа поддерживается Национальный фонд Китая естественных наук (NSFC, Грант № 31570001) и фонд естественных наук провинции Гуандун и город Гуанчжоу (Грант № 2016A030313401 и 201707010024) для H.W.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
KOD-FX PolymeraseTOYOBOKFX-101
Sma INEBR0141L/S/V
Tris-HClBBIA600194-0500
MgCl2BBIA601336-0500
dNTPNEB#N0447V
DTTBBIC4H10O2S2
PEG 8000BBIA100159-0500
NADBBIA600641-0001
T5 exonucleaseEpicentreT5E4111K
Phusion High-Fidelity DNA polymeraseNEBM0530S
Taq DNA polymeraseNEBB9022S
Murashige and Skoog Basal Salt Mixture(MS)SigmaM5524
EthanolBBIA500737-0500
Tween 20BBIA600560-0500
AgarBBIA505255-0250
SpermidineBBIA614270-0001
Gold microcarrier particlesBio-Rad165-22631.0 µm
CaCl2BBICD0050-500
MacrocarriersBio-Rad165-2335
Rupture diskBio-Rad165-2329
Stopping screenBio-Rad165-2336
TryptoneOXOIDLP0042
Yeast ExtractOXOIDLP0021
NaClBBIA610476-0001
KClBBIA610440-0500
GlucoseBBIA600219-0001
Hygromycin BGenviewAH169-1G
WortmanninSigmaF9128
Brefeldin ASigmaSML0975-5MG
Dimethylsulphoxide (DMSO)BBIA600163-0500
T100 Thermal CyclerBio-Rad1861096
Growth chamberPanasonicMLR-352H-PC
PSD-1000/He particle delivery systemBio-Rad165-2257
Gene PulserBio-Rad1652660
CuvetteBio-Rad1652083
Benchtop centrifugeEppendorf5427000097
Confocal microscopeZeissLSM 7 DUO (780&7Live)
NanoDrop 2000/2000c SpectrophotometersThermo Fisher ScientificND-2000
EPS-300 Power SupplyTanonEPS 300
Fluorescent microscopeMshotMF30
AgroseBBIA600234
AmpicillinBBIA100339
Ethylene Diamine Tetraacetie AcidBBIB300599

Ссылки

  1. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
  2. Tsien, R. Y., Miyawaki, A. Seeing the machinery of live cells. Science. 280 (5371), 1954-1955 (1998).
  3. Wang, H. Visualizing Plant Cells in a Brand New Way. Mol Plant. 9 (5), 633-635 (2016).
  4. Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).
  5. Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. Studying protein dynamics in living cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).
  6. Tse, Y. C., et al. Identification of multivesicular bodies as prevacuolar compartments in Nicotiana tabacum BY-2 cells. Plant Cell. 16 (3), 672-693 (2004).
  7. Wang, H., Zhuang, X., Cai, Y., Cheung, A. Y., Jiang, L. Apical F-actin-regulated exocytic targeting of NtPPME1 is essential for construction and rigidity of the pollen tube cell wall. Plant J. 76 (3), 367-379 (2013).
  8. Wang, H., et al. A Distinct Pathway for Polar Exocytosis in Plant Cell Wall Formation. Plant Physiol. 172 (2), 1003-1018 (2016).
  9. Canto, T. Transient Expression Systems in Plants: Potentialities and Constraints. Adv Exp Med Biol. 896, 287-301 (2016).
  10. Ishida, Y., Hiei, Y., Komari, T. Agrobacterium-mediated transformation of maize. Nat Protoc. 2 (7), 1614-1621 (2007).
  11. Li, S., et al. Optimization of agrobacterium-mediated transformation in soybean. Front Plant Sci. 8, 246 (2017).
  12. Manavella, P. A., Chan, R. L. Transient transformation of sunflower leaf discs via an Agrobacterium-mediated method: applications for gene expression and silencing studies. Nat Protoc. 4 (11), 1699-1707 (2009).
  13. Martin, K., et al. Transient expression in Nicotiana benthamiana fluorescent marker lines provides enhanced definition of protein localization, movement and interactions in planta. Plant J. 59 (1), 150-162 (2009).
  14. Miao, Y., Jiang, L. Transient expression of fluorescent fusion proteins in protoplasts of suspension cultured cells. Nat Protoc. 2 (10), 2348-2353 (2007).
  15. Wang, H., Jiang, L. Transient expression and analysis of fluorescent reporter proteins in plant pollen tubes. Nat Protoc. 6 (4), 419-426 (2011).
  16. Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
  17. Candat, A., et al. Experimental determination of organelle targeting-peptide cleavage sites using transient expression of green fluorescent protein translational fusions. Anal Biochem. 434 (1), 44-51 (2013).
  18. Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
  19. Binder, A., et al. A modular plasmid assembly kit for multigene expression, gene silencing and silencing rescue in plants. PLoS One. 9 (2), e88218 (2014).
  20. Engler, C., et al. A golden gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synth Biol. 3 (11), 839-843 (2014).
  21. Forner, J., Binder, S. The red fluorescent protein eqFP611: Application in subcellular localization studies in higher plants. BMC Plant Biol. 7, 28 (2007).
  22. Wang, H., et al. Vacuolar sorting receptors (VSRs) and secretory carrier membrane proteins (SCAMPs) are essential for pollen tube growth. Plant J. 61 (5), 826-838 (2010).
  23. Wang, H., Zhuang, X. H., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. W. Vacuolar sorting receptor (VSR) proteins reach the plasma membrane in germinating pollen tubes. Mol Plant. 4 (5), 845-853 (2011).
  24. Chen, W. X., et al. Rapid in vitro splicing of coding sequences from genomic DNA by isothermal recombination reaction-based PCR. Biotechnology & Biotechnological Equipment. 30 (5), 864-868 (2016).
  25. Zhu, Q. L., Yang, Z. F., Zhang, Q. Y., Chen, L. T., Liu, Y. G. Robust multi-type plasmid modifications based on isothermal in vitro recombination. Gene. 548 (1), 39-42 (2014).
  26. Torella, J. P., et al. Rapid construction of insulated genetic circuits via synthetic sequence-guided isothermal assembly. Nucleic Acids Res. 42 (1), 681-689 (2014).
  27. Siguret, V., Ribba, A. S., Cherel, G., Meyer, D., Pietu, G. Effect of plasmid size on transformation efficiency by electroporation of Escherichia coli DH5 alpha. Biotechniques. 16 (3), 422-426 (1994).
  28. Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nat Protoc. 1 (2), 641-646 (2006).
  29. Lam, S. K., Cai, Y., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. SCAMPs highlight the developing cell plate during cytokinesis in tobacco BY-2 cells. Plant Physiol. 147 (4), 1637-1645 (2008).
  30. Lam, S. K., et al. Rice SCAMP1 defines clathrin-coated, trans-golgi-located tubular-vesicular structures as an early endosome in tobacco BY-2 cells. Plant Cell. 19 (1), 296-319 (2007).
  31. Jiang, L., Rogers, J. C. Integral membrane protein sorting to vacuoles in plant cells: evidence for two pathways. J Cell Biol. 143 (5), 1183-1199 (1998).
  32. Fernandez-Abalos, J. M., Fox, H., Pitt, C., Wells, B., Doonan, J. H. Plant-adapted green fluorescent protein is a versatile vital reporter for gene expression, protein localization and mitosis in the filamentous fungus, Aspergillus nidulans. Mol Microbiol. 27 (1), 121-130 (1998).
  33. Bruening, G. Plant gene silencing regularized. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (23), 13349-13351 (1998).
  34. Wassenegger, M., Pelissier, T. A model for RNA-mediated gene silencing in higher plants. Plant Mol Biol. 37 (2), 349-362 (1998).
  35. Dehio, C., Schell, J. Identification of plant genetic loci involved in a posttranscriptional mechanism for meiotically reversible transgene silencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (12), 5538-5542 (1994).
  36. Zhong, G., Zhu, Q., Li, Y., Liu, Y., Wang, H. Once for all: A novel robust system for co-expression of multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants. Front Plant Sci. 8, 1071 (2017).
  37. Li, X. T., Xie, Y. Y., Zhu, Q. L., Liu, Y. G. Targeted genome editing in genes and cis-regulatory regions improves qualitative and quantitative traits in crops. Molecular Plant. 10 (11), 1368-1370 (2017).
  38. Zhu, Q. L., et al. Development of "purple endosperm rice'' by engineering anthocyanin biosynthesis in the endosperm with a high-efficiency transgene stacking system. Molecular Plant. 10 (7), 918-929 (2017).
  39. Tang, H. W., et al. Multi-step formation, evolution, and functionalization of new cytoplasmic male sterility genes in the plant mitochondrial genomes. Cell Research. 27 (1), 130-146 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

137

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены