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  • Resumen
  • Introducción
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  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Hemos desarrollado un novedoso método para expresar conjuntamente múltiples proteínas de fusión quimérica de fluorescentes en las plantas a superar las dificultades de los métodos convencionales. Toma ventaja del uso de un plásmido de expresión única que contiene múltiples proteínas funcionalmente independiente expresando cassettes para lograr la expresión de la proteína.

Resumen

Información sobre la localization(s) espacio-temporal subcelular de una proteína es fundamental para comprender sus funciones fisiológicas en las células. Proteínas fluorescentes y la generación de proteínas fluorescentes de fusión se han utilizado violentamente como una herramienta eficaz para visualizar directamente la localización de proteínas y la dinámica en las células. Es especialmente útil para compararlos con los marcadores de organelo conocido después de coexpresión con la proteína de interés. Sin embargo, métodos clásicos para la expresión de la proteína en las plantas implican generalmente múltiples plásmidos de expresión independiente y por lo tanto tienen inconvenientes que incluyen eficacia baja expresión Co, variación del nivel de expresión y alto tiempo de gasto en cruce genético y cribado. En este estudio, describimos un método robusto y novedoso para la expresión de múltiples proteínas quiméricas fluorescentes en las plantas. Supera las limitaciones de los métodos convencionales mediante el uso de un vector de expresión individual que se compone de múltiples cintas expresando semi-independiente. Cada cassette de expresión de la proteína contiene sus propios elementos de expresión de la proteína funcional, y por lo tanto se puede ajustar fexiblemente para satisfacer la demanda de expresión diversa. Además, es fácil y conveniente para llevar a cabo la Asamblea y fragmentos de manipulación del ADN en el plásmido de expresión mediante el uso de una reacción de un paso optimizado sin digestión adicional y pasos de ligadura. Además, es totalmente compatible con proteína fluorescente derivada bio-proyección de imagen de las tecnologías actuales y las aplicaciones, como el traste y centro. Como una validación del método, se empleó este nuevo sistema vacuolar receptor clasificación express Co fluorescente fundido y proteínas en la membrana secretora portador. Los resultados muestran que sus localizaciones subcelulares de la perspectiva al igual que en anteriores estudios de expresión transitoria y transformación genética en plantas.

Introducción

Proteínas de fusión fluorescente quimérico se han mirado como herramientas útiles para estudiar la dinámica intracelular y localización subcelular y entiendo sus funciones fisiológicas y trabajo mecanismos1,2, 3 , 4. es especialmente beneficioso para express Co organelo conocido reportero las proteínas con la proteína en cuestión para mejor ilustrar su razonamiento espacio-temporal, distribución y funciones dentro del Sistema endomembranoso de células4 , 5 , 6 , 7 , 8.

Una proteína quimérica fusión fluorescente se puede expresar en las plantas a través de la expresión transitoria y transformación genética estable, que tienen sus respectivas ventajas y limitaciones9,10,11. La expresión transitoria de una proteína es un método conveniente que incluye biolística bombardeo-, glicol de polietileno (clavija)-, o la expresión transitoria de ADN mediada por electroporación de protoplastos y Agrobacterium-mediada por infiltración de la hoja en células vegetales intactas, tal como se muestra en la figura 1A, B12,13,14,15,16. Sin embargo, coexpresión múltiples quiméricos fluorescentes de proteínas de fusión en una célula de la planta solo requiere una mezcla de varios plásmidos de expresión independiente. Así, las desventajas de emplear múltiples plásmidos para la expresión de la proteína en las plantas son niveles más bajos de la expresión debido a la posibilidad dramáticamente reducido de varios plásmidos entrar simultáneamente en las mismas células en comparación con un solo plásmido y la variaciones de niveles de expresión de la proteína causadas por la cantidad incontrolable al azar de cada tipo de plásmido se transfiere a la célula17,18. Además, es un desafío técnico para introducir varios plásmidos de expresión independiente de una sola Agrobacterium para proteína coexpresión9,10,11. Por lo tanto, Agrobacterium-mediada proteína expresión transitoria por la infiltración de tabaco deja sólo es capaz de expresar un plásmido a la vez, como se muestra en la figura 1B. En cambio, generación de plantas transgénicas que expresan proteínas fluorescentes de fusión se logra por Agrobacterium que lleva un vector de transformación binaria. Sin embargo, el vector binario que media la transferencia de genes y la inserción en el genoma de la planta sólo es capaz de expresar una sola fusión fluorescente proteína (figura 1B)9,10,12. Generación de una planta transgénica que expresa simultáneamente varias proteínas fluorescentes quiméricas requiere múltiples rondas de cruce genético y proyección, que puede tomar de meses a años dependiendo de los números de los genes que expresa conjuntamente.

El empleo de que un vector de expresión solo para co expresión de varias proteínas en planta ha sido reportado por varios anteriores estudios19,20,21. Sin embargo, múltiples rondas de digestión enzimática y la ligadura de la DNA de las moléculas de ADN y vectores de la columna vertebral deben generalmente para generación del plásmido final de coexpresión de la proteína o expresión. Aquí, hemos desarrollado un método nuevo y robusto para co expresando múltiples proteínas quiméricas fluorescentes en plantas. Es un método altamente eficaz y práctico que alcanza múltiples coexpresión de la proteína en las plantas para la expresión transitoria tanto y la transformación estable de manera tradicional. Emplea un único vector que contiene varios cassettes de expresión proteína funcionalmente independiente para la expresión de la proteína y así supera los inconvenientes de los métodos convencionales. Por otra parte, es un sistema muy versátil en que ADN manipulación y montaje se logran mediante una reacción en un paso simple optimizado sin pasos adicionales de digestión de DNA y la ligadura. El principio de funcionamiento se ilustra en la figura 2. Además, es totalmente compatible con el actuales enfoques celulares, moleculares y bioquímicos que están basados en proteínas de fusión quimérica de fluorescente.

Protocolo

1. primer diseño estrategia y amplificación del ADN

  1. Diseño de los cebadores para la clonación molecular de fragmentos de ADN. Los iniciadores comprenden secuencias de unión específica gen bp 20 y 20 a 25 bp 5'-el extremo voladizo las secuencias, que son la secuencia complementaria superpuesta de las moléculas de ADN adyacentes (ver tabla 1 por ejemplo).
    Nota: El montaje posterior de cada ADN fragmentos, acoplamiento de cassettes de expresión de proteínas diferentes, y dependen de integración con el vector de expresión final todos en el reconocimiento de las secuencias superpuestas adyacentes.
  2. Amplificar fragmentos de ADN, como promotor, reportero fluorescente, gene de la blanco y terminator, que son necesarios para la construcción de los cassettes de expresión de proteína semi-independiente por reacciones de polimerización en cadena estándar con sus correspondientes cebadores y alta polimerasa de fidelidad.
    Nota: Las plantillas utilizadas en este estudio para la amplificación de ADN se derivan de los anteriores estudios15,22,23. La temperatura de recocido y el tiempo de extensión de las reacciones de PCR son la cartilla y dependiente del gen.

2. ADN fragmento montaje y construcción de Cassettes de expresión de la proteína

  1. Examinar la calidad de los productos PCR de primera ronda por electroforesis de ADN y cuantificar por el espectrofotómetro. Compruebe si han producido contaminación y degradación del ADN por electroforesis en gel de agarosa 1%. El OD260/OD280 de los productos PCR debe ser entre 1.6 y 1.8.
  2. Mezclar diferentes fragmentos de ADN (0.05 - 0.1 pmol de cada fragmento) en un nuevo tubo PCR en un volumen final de 5 μl.
    Nota: Las moléculas de ADN de mezcla diseñado para el mismo cartucho de expresión de proteína juntos en un tubo de PCR. Evitar mezcla de DNAs de cassettes de expresión diferente, ya que reducirá la eficacia de la Asamblea de ADN debido al creciente número de moléculas de ADN que necesitan vincularse.
    Nota: El protocolo se puede detener aquí.
  3. Preparar 5 x ISO buffer stock: 500 mM Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM MgCl2; 1 mM Deoxinucleótidos (dNTP); 50 mM Ditiotreitol; 25% de polietilenglicol (PEG) 8000; y 5 mM nicotinamida adenina dinucleótido (NAD).
  4. Completar 1 mL 2 x mezcla maestra de 400 μL 5 x buffer stock ISO, 7,5 unidades de T5 exonucleasa, 62,5 unidades de ADN polimerasa de alta fidelidad, 5.000 unidades de Taq polimerasa (véase Tabla de materiales), y doble esterilizada destilada H2O.
    Nota: Esto es adaptado de anteriores estudios24,25,26; Estos volúmenes deben ser optimizados.
  5. Alícuota de 100 μl de 2 x master mezcla por el tubo y conservar a-20 ° C.
    PRECAUCIÓN: Frecuentes de congelación y descongelación de la mezcla principal de 2 x pueden causar baja eficiencia de ensamblaje de ADN.
  6. Añadir 15 μl de la mezcla principal de 2 x a la mezcla de ADN 5 μl e incubar a 50 ° C durante 60 minutos.

3. construcción del Vector para la co-expresión de múltiples proteínas de fusión quimérica de fluorescentes en las plantas

  1. Amplificar el casete de expresión de toda proteína semi-independiente mediante una PCR de segunda ronda con el producto (0,5 - 1,0 μL) de la reacción de la primera ronda Asamblea isotermo como la plantilla y los iniciadores exteriores (por ejemplo, 1 FP35S y 1-RNOS para la expresión cassette 1).
    1. Unidad de uso 1 de polimerasa de alta fidelidad en un volumen de reacción de 50 μl seguido de 30 ciclos (94 ° C por 30 s, 55 ° C por 30 s y 68 ° C por 2 min), seguido de una extensión final a 68 ° C durante 5 minutos.
  2. Alinear la proteína final expresión columna vertebral vectores pUC18 y pCAMBIA1300, que están diseñados para la expresión transitoria de proteínas y transformación genética, respectivamente, mediante la adición de 4 unidades Sma I en un volumen final de reacción de 10 μl y de incubación de 1 - 2 horas a 25 ° C. Inactivar la enzima de restricción por incubación a 65 ° C por 20 min.
  3. Mezcla equimolares moléculas de ADN de cassettes de expresión de la proteína y vector final lineal en un volumen final de reacción de 5 μl. Luego, realizar la recombinación de ADN de la segunda ronda por mezcla con 15 μl 2 x buffer principal y a 50 ° C durante 60 min de incubación.
  4. Utilizar los productos finales de la reacción de recombinación isotermo segunda ronda para transformar competentes de e. coli las células (por ejemplo, DH5α) según procedimientos estándar27. Revise dos veces las colonias positivas ordenando Colonia PCR y ADN. Extraer la plásmidos positiva de la e. coli utilizando un kit de extracción del plásmido mini y almacenar a-80 ° C.
    PRECAUCIÓN: Para almacenamiento a largo plazo, plásmidos disuelven en tampón TE o doble destilada H2O son más estables que mantenerlos en cepas de e. coli .

4. biolística-bombardeo mediado coexpresión transitoria de múltiples proteínas de fusión quimérica de fluorescentes en las plantas

  1. Preparación de plantas juveniles de Arabidopsis y tabaco BY-2 células de suspensión para el bombardeo.
    1. Cultura por-2 células en medio Murashige y Skoog (MS) por subcultivo dos veces por semana a 25 ° C en un agitador a 130 rpm. Filtro recoge 30 mL 3 d cultivada por 2 células en un pedazo de papel de filtro esterilizado de 70 mm por medio de una bomba de vacío mediante el establecimiento de la presión del vacío a 40 mbar.
    2. Para impedir que las células se sequen durante los pasos siguientes, añadiendo unas gotas de medio cultural líquido de la célula por 2 en una placa Petri antes de colocar el papel de filtro (paso siguiente).
    3. Transferir el papel filtro con las células de a-2 en él a un nuevo plato de Petri (85 x 15 mm).
    4. Superficie de esterilizar semillas de Arabidopsis thaliana (Col-0) con un vórtex una mezcla con etanol al 70% (v/v) que contenga 0.05% Tween 20 durante 10 minutos.
    5. Desactivación de las semillas utilizando una centrífuga Banco a máxima velocidad por 2 s, eliminar el sobrenadante y lavar las semillas con etanol al 100% una vez para pipeta s. 30 semillas en un nuevo papel de filtro estéril en una campana estéril. Luego, seque las semillas y extender sobre placas de agar de MS ½.
    6. Almacenar las placas a 4 ° C durante 48 horas antes de la transferencia en una cámara de crecimiento de la planta con los siguientes valores: 16 h de luz oscura 8 h con 120-150 μm m-2 s-1 de intensidad, 22 ° C.
    7. Transferencia de 7 día - viejas plantas de la muestra en un círculo de diámetro de 30 mm en el centro de una placa de medio MS ½ nuevo para aumentar la eficiencia del bombardeo.
      PRECAUCIÓN: Evitar la duplicación de las plantas de transferencia y colocarlos sobre la placa nueva de MS ½.
    8. Añadir varias gotas de medio líquido MS ½ en la superficie de las plantas o los tejidos para conservar humedad y evitar que se sequen las plantas durante los pasos siguientes.
  2. Capa de partículas de oro con ADN plásmido.
    1. Vórtice oro potencia solución completamente, durante 3 minutos Prepare un nuevo tubo de 1,5 mL.
    2. Añadir secuencialmente las siguientes soluciones en el tubo y vortex: 25 μl (1,5 mg) oro partículas, vortex 10 s; 10 μl de espermidina 25,46 mg/L, vortex 10 s; 5 μl de ADN de plásmido de 1μg/μl, vortex 3 min; 25 μl de 277,5 mg/L solución de CaCl2 , vortex 1 minuto.
      PRECAUCIÓN: Mantenga un vórtex durante este paso.
    3. Desactivación de la microcarriers oro utilizando una centrífuga Banco a máxima velocidad para 5 s y cuidadosamente la pipeta hacia fuera el sobrenadante sin perturbar el pellet. Lavado con 200 μL de etanol absoluto y volver a suspender el sedimento en el vórtex de vuelta s. 5-10 abajo a máxima velocidad para 5 s y eliminar el etanol.
    4. Vuelva a suspender las partículas de oro en 18 μL de etanol absoluto y alícuotas 6 μl partículas suspensión en el centro de tres macrocarriers. Dejarlos secar al aire.
  3. Transferencia de ADN en plantas mediante bombardeo de partículas.
    1. Establecer el sistema de partículas como siguiendo: 1100 psi, vacío de 28 mm Hg, distancia de 1 cm de separación y distancia de vuelo de partículas 9 cm.
    2. Bombardear las células/plantas en la placa de agar medio tres veces en tres posiciones diferentes y luego mantener las plantas de las células en oscuridad inmediatamente después del bombardeo.
      PRECAUCIÓN: Use gafas de seguridad cuando opere el sistema de partículas debido a la Asociación de gas de alta presión y alta velocidad partículas con el sistema.
  4. Mantener plantas de células bombardeadas en la oscuridad en la cámara de crecimiento de la planta de 6 a 72 horas antes de la observación de señales fluorescentes. Configurar la cámara de crecimiento de la planta a oscura 24 h y 22 ° C.
    PRECAUCIÓN: La eficacia de la expresión y la intensidad de la señal fluorescente están promotor, gen y planta/tejidos-dependiente.

5. generación de Arabidopsis transgénica estable Co expresando múltiples proteínas quiméricas fluorescentes por Agrobacterium-mediado transformación.

  1. Descongelar las células competentes de Agrobacterium (PMP90) en el hielo y esperar 30 minutos, luego añadir 2 μl binario vector (100-200 ng) (preparada anteriormente) en las células competentes. Sienta la mezcla en hielo durante 10 minutos.
  2. Transferir la mezcla en una cubeta de electroporación previamente enfriada 0,1 cm. Insertar la cubeta en el sistema de electroporación y realizar electroporación con los siguientes ajustes: 1,6 kV, 600 ohmios, 25 μF.
  3. Añadir 1 mL de medio líquido SOC en la cubeta inmediatamente después de la electroporación, pipetear las células en un tubo nuevo de 1,5 mL e incubar a 28 ° C en un agitador orbital horizontal a 200 rpm por 120 min.
  4. Centrifugar las células a 2.348 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos, desechar la mayor parte del sobrenadante, suavemente Resuspenda las células concentradas con una punta de pipeta, extender en una placa LB que contiene 50 mg/L de higromicina B e incubar a 28 ° C durante 2-3 días.
  5. Transformar plantas de Arabidopsis thaliana Col-0 con el Agrobacterium, que contiene el vector binario pCAMBIA1300 integrado con varios cassettes de expresión de proteína, por el método de inmersión floral28 según se describió anteriormente para generar plantas transgénicas estables.
  6. Esterilizar la superficie de las semillas transgénicas de Arabidopsis por mezcla con etanol al 70% (v/v) que contenga 0.05% Tween 20. Vortex durante 10 minutos de la vuelta abajo las semillas utilizando una centrífuga Banco a máxima velocidad por 2 s, eliminar el sobrenadante y lavar las semillas con etanol al 100% una vez por 30 s.
  7. Pipetear las semillas en un papel de filtro estéril en una campana estéril. Después, secar al aire y repartirlos en MS ½ placas de agar que contiene Hygromycin B para screening positivo progenie.
  8. Incubar las placas a 4 ° C durante 2 días. Luego, transferirlos a la cámara de crecimiento de plantas y la cultura durante 7 días.
  9. Seleccione 7 - viejo plantas juveniles de supervivencia buscando señales fluorescentes bajo el microscopio de fluorescencia y las plantas de transferencia en suelos de mayor proyección de plantas homocigóticas.

6. tratamientos farmacéuticos

  1. Para tratamientos farmacéuticos, diluir cada fármaco en medio líquido MS a sus concentraciones adecuadas de trabajo antes de la incubación con células o plantas.
    1. Wortmannin tratamiento: preparar 1 mM soluciones stock de wortmannin disolviendo polvo de wortmannin en DMSO y almacenar las existencias a-20 ° C. Transferencia de células de la planta o plantas menores en el medio MS líquido contiene 16.5 μm wortmammin e incube durante 30-45 min antes de la proyección de imagen.
    2. Tratamiento Brefeldin A (BFA): preparar 1 mM soluciones stock de BFA disolviendo polvo BFA en DMSO y almacenar las existencias a-20 ° C. Transferencia de células de la planta o plantas menores en el medio MS líquido que contiene 10 μg/mL BFA por 30-45 min antes de la proyección de imagen.

7. Análisis de localización subcelular de la proyección de imagen de microscopio confocal y la proteína

  1. Transferencia de las plantas juveniles o las células de suspensión en un portaobjetos de vidrio convencional y suavemente poner una diapositiva de cubierta en la parte superior de la proyección de imagen por láser confocal estándar de microscopía. Utilice la siguiente configuración: 63 X agua objetivo (1.4 N.A) 0 fondo, ganancia 700, tamaño de píxel de 0,168 mm y detector de tubo fotomultiplicador. Excite proteínas GFP-etiquetado a 485 nm y detectar la fluorescencia en 525 nm. Las proteínas con etiqueta RFP, excitar a 514 nm y detectar a 575 nm.
  2. Calcular el cociente de la co-localización de señales fluorescentes utilizando el software de Image J (https://imagej.nih.gov/ij/) con el Pearson Spearman correlación (PSC) co-localización plug-in como se describió previamente8. Coeficientes de correlación de Pearson o coeficientes de correlación de Spearman se muestran en los resultados (figura 4). Los valores de r producido será de -1 a 1. 0 no muestra ninguna correlación detectable de dos señales, mientras que + 1 y -1 muestran correlación total positivo y negativo, respectivamente, de dos señales.

Resultados

Hemos desarrollado un método robusto y altamente eficiente para la co-expresión de múltiples proteínas de fusión quimérica de fluorescentes en las plantas. Se rompe a través de las barreras de lo convencional enfoques utilizan múltiples plásmidos separados para la coexpresión de la proteína, como se muestra en la figura 1A, B, a través de la expresión transitoria o transformación genética estable. En este nuevo método...

Discusión

Aquí hemos demostrado un nuevo método para robusta Co expresar proteínas quiméricas fluorescentes fusión en plantas. Puede utilizar para la expresión transitoria y transformación genética y es compatible con actuales fluorescentes basados en proteína bio-proyección de imagen molecular y bioquímica aplicaciones y tecnologías9,10,13 . Además, supera las dificultades de los métodos convencionales que utilizan varios p...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a los miembros del laboratorio de Wang de las discusiones útiles y comentarios. Este trabajo es apoyado por la nacional Ciencias naturales Fundación de China (NSFC, grant no. 31570001) y la Fundación de Ciencias naturales de la provincia de Guangdong y la ciudad de Guangzhou (concesión 201707010024 y Nº 2016A030313401) a H.W.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
KOD-FX PolymeraseTOYOBOKFX-101
Sma INEBR0141L/S/V
Tris-HClBBIA600194-0500
MgCl2BBIA601336-0500
dNTPNEB#N0447V
DTTBBIC4H10O2S2
PEG 8000BBIA100159-0500
NADBBIA600641-0001
T5 exonucleaseEpicentreT5E4111K
Phusion High-Fidelity DNA polymeraseNEBM0530S
Taq DNA polymeraseNEBB9022S
Murashige and Skoog Basal Salt Mixture(MS)SigmaM5524
EthanolBBIA500737-0500
Tween 20BBIA600560-0500
AgarBBIA505255-0250
SpermidineBBIA614270-0001
Gold microcarrier particlesBio-Rad165-22631.0 µm
CaCl2BBICD0050-500
MacrocarriersBio-Rad165-2335
Rupture diskBio-Rad165-2329
Stopping screenBio-Rad165-2336
TryptoneOXOIDLP0042
Yeast ExtractOXOIDLP0021
NaClBBIA610476-0001
KClBBIA610440-0500
GlucoseBBIA600219-0001
Hygromycin BGenviewAH169-1G
WortmanninSigmaF9128
Brefeldin ASigmaSML0975-5MG
Dimethylsulphoxide (DMSO)BBIA600163-0500
T100 Thermal CyclerBio-Rad1861096
Growth chamberPanasonicMLR-352H-PC
PSD-1000/He particle delivery systemBio-Rad165-2257
Gene PulserBio-Rad1652660
CuvetteBio-Rad1652083
Benchtop centrifugeEppendorf5427000097
Confocal microscopeZeissLSM 7 DUO (780&7Live)
NanoDrop 2000/2000c SpectrophotometersThermo Fisher ScientificND-2000
EPS-300 Power SupplyTanonEPS 300
Fluorescent microscopeMshotMF30
AgroseBBIA600234
AmpicillinBBIA100339
Ethylene Diamine Tetraacetie AcidBBIB300599

Referencias

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