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要約

従来の方法の難しさを克服するために植物の複数のキメラ蛍光融合タンパク質の共発現手法を開発しました。タンパク質の共発現を達成するためにカセットを表現する複数の機能的に独立して蛋白質を含んでいる単一発現プラスミドを使用する利点がかかります。

要約

蛋白質の時空間的細胞内 localization(s) については、細胞の生理機能を理解する重要です。蛍光タンパク質と蛍光融合タンパク質の生成は、乱暴に直接タンパク質の局在と細胞のダイナミクスを可視化する効果的なツールとして使用されています。それは興味の蛋白質と共発現後よく知られている細胞小器官のマーカーとの比較に便利です。それにもかかわらず、植物タンパク質の共発現の古典的手法は、通常、複数の独立した発現プラスミドを含む、したがって低共発現効率、発現レベルの変動、高時間などの欠点があります。遺伝学的交差およびスクリーニングの支出。本研究では堅牢で新しい植物の複数のキメラ蛍光タンパク質の共発現法について述べる。それは、複数の半独立した表現するカセットから成る単一発現ベクターを用いた従来の方法の限界を克服します。各蛋白質発現カセット、独自の機能性蛋白質の表現の要素を含み、したがってそれ柔軟に調整できる多様な表現の需要を満たすために。また、それは簡単なアセンブリを実行して追加消化と結紮手順なし最適化されたワンステップ反応を用いた発現プラスミドの DNA の操作の断片します。さらに、現在の由来の蛍光タンパク質バイオ イメージング技術やフレットなど BiFC のアプリケーションと完全に互換性が。メソッドの検証としては、蛍光融合共同エクスプレス空胞並べ替え受容体と分泌キャリア膜タンパク質にこの新しいシステムを採用しました。結果は、その視点細胞内局在化が一過性発現と形質転換植物における先行研究と同じであることを示します。

概要

キメラ蛍光融合タンパク質は、細胞内動態と細胞内局在を勉強し、さらに生理機能や作業のメカニズム1,2,を理解する役に立つツールとみなされています。3,4. 共同エクスプレスよく知られているオルガネラ レポーター蛋白質蛋白質の良い時空間理論的根拠、配布、およびセル4内システム内の機能を説明するために問題の特に有益です。,5,6,7,8。

キメラの蛍光融合蛋白質は、それぞれ長所と制限9,10,11を持っている植物を介して一過性発現と安定な形質転換で表現できます。タンパク質の一過性発現が含まれています biolistic の衝突-、ポリエチレング リコール (PEG) 便利なアプローチ-、またはプロトプ ラストとアグロバクテリウムのエレクトロポレーションによる DNA 一過性発現-葉浸潤を介したそのまま植物の細胞、図 1 a、B12,13,14,15,16に示すように。ただし、単一植物細胞における複数のキメラ蛍光融合タンパク質の共発現にはいくつかの独立した発現プラスミドの混合物が必要です。したがって、植物の共発現用の複数のプラスミドを用いたの欠点は、同時に単一のプラスミドと比較した場合の同じセルに入るいくつかのプラスミドの劇的に減らされたチャンスのため下位の共発現レベルとセル17,18に転送されているプラスミドのそれぞれのタイプの手に負えないほどランダムな量によって引き起こされる蛋白質発現レベルの変動。さらに、タンパク質の共発現9,10,11の単一アグロバクテリウムにいくつかの独立した発現プラスミドを導入する技術的に困難です。したがって、アグロバクテリウム-図 1 bに示すように、葉たばこの含浸による一過性発現を介したタンパク質は、一度に 1 つのプラスミドを表現できるのみ。対照的に、蛍光融合蛋白質を表現する遺伝子組換え植物の世代は、バイナリ変換ベクトルを運ぶアグロバクテリウムによって行われます通常。ただし、遺伝子導入および植物ゲノムへの挿入を仲介するバイナリのベクトルだけ単一蛍光融合タンパク質 (図 1 b)9,10,12を表現することが可能です。いくつかのキメラ蛍光タンパク質を同時に表現する遺伝子組換え植物を生成すると、複数回の遺伝的交差と共発現する遺伝子の数に応じて年ヶ月から取ることができるスクリーニングが必要です。

共同工場で複数のタンパク質発現の単一発現ベクターは、以前のいくつかによって報告されている雇用研究19,20,21です。ただし、複数回の酵素の消化力と DNA 分子とバックボーンのベクトルの DNA の ligation が通常必要タンパク質の共発現または過剰発現の最終的なプラスミッドの生成です。ここでは、共同植物における複数のキメラ蛍光蛋白質を表現するための新しい堅牢な方法を開発しました。両方の一過性発現のための植物で複数タンパク質の共発現と昔ながらの方法で安定した変換を実現する非常に効率的かつ便利な方法です。共発現用複数の機能的に独立してタンパク質発現カセットを含み、従来法の欠点を克服することにより 1 つのベクトルを採用しています。また、どの DNA DNA 消化と結紮の余分な手順なしに最適化された簡単なワンステップ反応により操作とアセンブリを実現します。 汎用性の高いシステムです。動作原理を図 2に示します。さらに、キメラの蛍光融合蛋白質に基づいている現在の細胞、分子および生化学的なアプローチと完全に互換性が。

プロトコル

1. プライマー デザイン戦略、DNA の増幅

  1. DNA のフラグメントの分子クローニングのためのプライマーを設計します。プライマー 20 bp の遺伝子特定のバインドのシーケンスと 20 に 25 bp 5' 終り突出部分シーケンスが隣接する dna の相補的な重複シーケンス (たとえばテーブル 1を参照) を構成します。
    注: 各 DNA のそれに続くアセンブリ フラグメント、異なった蛋白質発現カセットのリンケージと隣接する重複したシーケンスの認識に依存するすべての最終的な発現ベクターとの統合。
  2. その対応するプライマー標準 PCR 反応によって半独立したタンパク質式カセットの建設のため必要かつ高プロモーター、蛍光レポーター、ターゲット遺伝子、および終端記号を含む DNA 断片を増幅します。忠実性ポリメラーゼ。
    注: DNA 増幅用本研究で使用するテンプレートは、以前の研究15,22,23から派生されます。焼鈍温度と PCR の反作用の延長時間は、プライマーや遺伝子依存です。

2. DNA フラグメント アセンブリおよびタンパク質発現カセットの建設

  1. DNA 電気泳動による第 1 ラウンドの PCR の製品の品質を確認し、分光光度計による定量化します。1% アガロースゲル電気泳動によって DNA の劣化や汚染が発生しているかどうかを確認します。PCR の製品の OD260/OD280 は、1.6 と 1.8 の間する必要があります。
  2. さまざまな DNA 断片をミックス (0.05 - フラグメントごとに 0.1 pmol) 5 μ L の最終的なボリュームに新しい PCR チューブに。
    注: ミックス DNA 分子設計同じタンパク質発現カセットを一緒に 1 つの PCR チューブに。それはリンクが必要な dna の数を増やすために DNA アセンブリの効率を減らすので一緒に、別の式のカセットからの Dna を混合を避けてください。
    注: プロトコルはここで一時停止することができます。
  3. 5 x ISO 在庫バッファーの準備: 500 mM トリス-HCl、pH 7.5;50 mM MgCl2;1 mM deoxynucleotide (dNTP);50 mM ジチオトレイトール;25% ポリエチレング リコール (PEG) 8000;5 mM ニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド (NAD)。
  4. 1 mL から 400 μ L 5 マスターの混合物 x 2 x ISO 在庫バッファー、T5 エキソヌクレアーゼ、忠実度の高い DNA ポリメラーゼの 62.5 単位、Taq のポリメラーゼの 5,000 台の 7.5 単位を作る (材料の表を参照)、および滅菌二重蒸留水 H2o.
    注: これは以前研究24,25,26; から適応します。これらのボリュームを最適化する必要があります。
  5. 管し、-20 ° C でストアあたりマスター混合物 x 2 の 100 μ L 分注
    注意: 頻繁に凍結と 2 x マスター混合物の融解を引き起こす DNA 組立効率が低い。
  6. 5 μ L の DNA 混合物に 2 x マスター混合物の 15 μ L を追加し、で 50 ° C, 60 分間インキュベートします。

3. 共同植物の複数のキメラの蛍光融合タンパク質発現用ベクターの構築

  1. 製品を使用して 2 番目のラウンド PCR による全体の半独立したタンパク質発現カセットを増幅 (0.5 - 1.0 μ L) テンプレートと最も外側のプライマー (例えば、 1 FP35S、1-RNOS 式の最初のラウンドの等温アセンブリ反応からカセット 1)。
    1. 50 μ L 反応量の高再現性ポリメラーゼの使用 1 単位 30 サイクルが続く (94 ° C、30 s、55 ° C、30 s、および 2 分の 68 の ° C)、68 ° C、5 分で最後の拡張が続く。
  2. 最終的なタンパク質発現バックボーン ベクトル pUC18 と pCAMBIA1300、それぞれ、一過性発現と形質転換のため 4 台Smaを追加することによって設計されているリニア化最終 10 μ L 反応巻に私と 1 - のインキュベーター25 ° C で 2 時間20 分の 65 ° c の孵化によって制限酵素を不活性化します。
  3. 5 μ L の反応量にタンパク質発現カセットと線形補間の最終的なベクトルの等モルの DNA 分子をミックスします。15 μ L 2 x マスター バッファーと 60 分 50 ° C で培養で混合することによって、第 2 ラウンドの DNA の再結合を実行します。
  4. 第 2 ラウンド等温再結合反応の最終製品を使用して有能なエシェリヒア属大腸菌を変換する標準的な手順27によるとセルを (例えばDH5α)。コロニー PCR で DNA シーケンスによって肯定的なコロニーを再確認してください。ミニ プラスミド抽出キットを使ってエシェリヒア属大腸菌から肯定的なプラスミドを抽出し、-80 ° C で保存
    注意: 長期保存用プラスミドは TE バッファーに溶解または二重蒸留 H2O は大腸菌で保管するよりも安定しています。

4. Biolistic 砲撃を介した植物の複数のキメラ蛍光融合タンパク質の一過性の共発現

  1. タバコ by-2 懸濁液細胞およびシロイヌナズナの幼植物を砲撃を準備します。
    1. シェーカーに 25 ° C で週 2 回継代培養培地、培 (MS) の中で培養細胞は、130 rpm に設定します。40 mbar に真空圧を設定することによって収集 30 mL 3 d 培養細胞の 70 mm オートクレーブ フィルター紙経由で真空ポンプの部分にフィルターを適用します。
    2. セルの次の手順の中に完全に乾くことを防ぐためにシャーレに濾紙を配置する前ので 2 セル液体文化媒体の数滴を追加する. (次の手順)。
    3. それをろ紙で 2 セルを新しいペトリ皿 (85 mm × 15 mm) に転送します。
    4. 表面滅菌シロイヌナズナ(コル-0) 種子ボルテックス混合物 0.05% を含む 70% (v/v) エタノールとトゥイーン 20 10 分。
    5. スピン ・ ダウン 2 の最大速度でベンチ トップ遠心分離機を使用して種 s、上澄みを除去し、無菌フードに新しい滅菌フィルター紙の上に種を 30 s. ピペットの 100% エタノールで種子を一度洗浄します。種子を空気乾燥し、½ MS 寒天プレートの上に並べます。
    6. 次の設定での植物育成装置にそれらを転送する前に 48 時間の 4 ° C でプレートを格納: 16 h 120-150 μ m m-2の-1輝度で 22 ° C.の 8 h 暗いの光
    7. 砲撃の効率を向上させる新しい ½ MS 中皿の中央に直径の 30 mm の円に 7 日間の古いサンプル植物を転送します。
      注意: は、転送すると新しい ½ MS プレートの上に置いて植物を重ならないようにします。
    8. 植物や水分を保持し、次の手順の中に出て植物を乾燥を防止するために、組織の表面に ½ MS 液体培地を数滴を追加します。
  2. プラスミッド DNA が付いている金の微粒子をコートします。
    1. 渦金マイクロ ・ キャリア ソリューション、徹底的に 3 分新しい 1.5 mL チューブ準備です。
    2. 管と渦に以下のソリューションを順次追加: 25 μ L (1.5 mg) 金粒子、渦 10 s;25.46 mg/L スペルミジン、渦 10 s の 10 μ L5 μ L 1µg/μ L プラスミド DNA の渦 3 分;25 μ L 277.5 mg/L CaCl2ソリューションの渦 1 分。
      注意: この手順中にボルテックスをしてください。
    3. ペレットを乱すことがなく 5 s と慎重に上澄みをピペットの最大速度でベンチ トップ遠心分離機を使用してゴールド microcarriers スピンダウンします。エタノール 200 μ L で洗浄し、5-10, スピンの 5 s と削除、エタノールの最大速度でダウン渦によるペレットを再中断します。
    4. 再無水エタノールと 3 つの macrocarriers の真ん中に分注 6 μ 粒子サスペンションの 18 μ L で金粒子を中断します。空気乾燥させてください。
  3. パーティクルガンによる植物に DNA を転送します。
    1. 次に粒子配信システムを設定: 9 cm 粒子飛行距離 1 cm 間隔、28 ミリメートル Hg 真空 1100 psi。
    2. 3 つの異なるポジションで 3 回寒天培地プレート上のセル/植物を砲撃、砲撃後すぐに暗いセル/植物を保ちます。
      注意: は、高圧ガス及び高速粒子システムとの関連付けのため粒子配信システムを動作しているとき、安全眼鏡を着用します。
  4. 植物育成装置で暗闇の中で蛍光信号の観測の前に 6 〜 72 時間衝撃セル/植物を保ちます。24 h 暗いおよび 22 ° C に植物育成装置を設定します。
    注意: 式効率と蛍光信号強度がプロモーター ・遺伝子・植物/組織に依存します。

5. 共同アグロバクテリウムによる複数のキメラ蛍光蛋白質を表現する安定した形質転換シロイヌナズナの生成-変換を介した。

  1. 雪解けの氷にアグロバクテリウム有能なセル (PMP90) と 30 分待ってから、2 μ L バイナリ ベクトル (100-200 ng) 有能なセルに上 (準備) を追加します。混合物を 10 分間氷の上に座る。
  2. 中古冷蔵 0.1 cm エレクトロポレーション キュベットに混合物を転送します。キュベットをエレクトロポレーション システムに挿入し、次の設定でエレクトロポレーションを実行: 1.6 kV、600 ω、25 μ F。
  3. 直後に、エレクトロポレーション キュヴェットに SOC 液体培地 1 mL を追加、新しい 1.5 mL チューブに細胞をピペット, 200 rpm で 120 分間の水平軌道シェーカーで 28 ° C で。
  4. 2,348 の x g で 5 分間室温で細胞を遠心、上清の大半を破棄、優しく再中断ピペット チップとペレットの細胞、Hygromycin B、50 mg/L を含む LB プレート上に広がったおよび 2 〜 3 日の 28 ° C の孵化させなさい。
  5. シロイヌナズナCol 0、アグロバクテリウム、前述のように花のすくい28法による複数のタンパク質発現カセットを組み込んだベクター pCAMBIA1300 が含まれている植物を変換します。安定した遺伝子組換え植物を生成します。
  6. 0.05% を含む 70% (v/v) エタノールとそれらを混合することによって形質転換シロイヌナズナ種子の表面を殺菌するトゥイーン 20。2 の最大速度でベンチ トップ遠心分離機を使用して種を 10 分スピン渦 s が、上澄みを除去し、100% のエタノール 30 の回で種子を洗浄 s。
  7. 無菌フード滅菌フィルター紙の上に種子をピペットします。その後、自然乾燥し、½ MS 寒天 Hygromycin B を含む肯定的な後代をスクリーニングするためにそれらを広げます。
  8. 2 日間の 4 ° C で版を孵化させなさい。7 日間、植物育成装置と文化に転送します。
  9. 蛍光顕微鏡下で蛍光シグナルをチェックして 7 日間の古い生存幼植物を選択し、さらにホモ植物のスクリーニングのための土に植物を移します。

6. 医薬品治療

  1. 医薬品治療について、細胞または植物と孵化する前に、適切な作業濃度に MS 液体培地に各薬剤を希釈します。
    1. ワートマンニン治療: DMSO ワートマンニン粉末を溶解して 1 mM ワートマンニンの貯蔵液を準備し、-20 ° C で在庫を保管16.5 μ M wortmammin を含む MS 液体培地に植物細胞や幼植物を移すし、イメージングの前に 30-45 分間インキュベートします。
    2. ブレフェルジン A (bfa): DMSO で BFA 粉末を溶解して 1 mM BFA の貯蔵液を準備し、-20 ° C で在庫を保管植物細胞や幼植物を 10 μ g/mL BFA のイメージングの前に 30-45 分を含む液体の MS 培地に移します。

7. 共焦点顕微鏡とタンパク質の共局在解析

  1. 幼植物または従来のガラス スライド上に懸濁細胞を転送し、標準的な共焦点レーザ走査型顕微鏡によるイメージングのための上部のカバー スライドをそっと。次の設定を使用: 63 X 水目的 (N.A 1.4)、0 の背景、700 利得、0.168 mm ピクセル サイズ、および光電子増倍管検出器。485 で GFP 付けられた蛋白質をエキサイト nm 525 で蛍光を検出し、nm。514 でエキサイト RFP タグ付きタンパク質の nm 575 で検出と nm。
  2. プラグインを上記8として、ピアソン スピアマン相関 (PSC) の共局在をイメージ J ソフトウェア (https://imagej.nih.gov/ij/) を用いた蛍光信号の共局在比を計算します。ピアソンの相関係数、スピアマンの順位相関係数は、結果 (図 4) に表示されます。生産の r 値は-1 から 1 になります。0 は説明 +1 と-1 表示の 2 つの信号の完全正・負の相関、それぞれに対し 2 つの信号の相関を検出します。

結果

共同工場で複数のキメラの蛍光融合タンパク質発現のため堅牢で非常に効率的な方法を開発しました。それは従来の障壁を通って壊れるアプローチは、図 1 a、B で示すように、共発現に複数の分離されたプラスミドを使用、一過性発現または安定な形質転換。この新しいメソッドでは、共発現を一度に (図 1

ディスカッション

ここでしっかり共同植物におけるキメラ蛍光融合蛋白質を表現する手法を説明してきました。一過性発現と形質転換の両方に使用できる、現在蛍光タンパク質ベース バイオ イメージング、分子および生化学的なアプリケーションおよびテクノロジー9,10,13 との互換性.さらに、タンパク質の共発現にいくつかの個々 の発現...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

私たちの役に立つ議論やコメント王研究室のメンバーに感謝します。この作品は h. w. に、国家自然科学基金、中国の (NSFC、グラント号 31570001) と自然科学財団の広東省と広州市 (第 2016A030313401 と 201707010024 を付与) でサポートされて

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
KOD-FX PolymeraseTOYOBOKFX-101
Sma INEBR0141L/S/V
Tris-HClBBIA600194-0500
MgCl2BBIA601336-0500
dNTPNEB#N0447V
DTTBBIC4H10O2S2
PEG 8000BBIA100159-0500
NADBBIA600641-0001
T5 exonucleaseEpicentreT5E4111K
Phusion High-Fidelity DNA polymeraseNEBM0530S
Taq DNA polymeraseNEBB9022S
Murashige and Skoog Basal Salt Mixture(MS)SigmaM5524
EthanolBBIA500737-0500
Tween 20BBIA600560-0500
AgarBBIA505255-0250
SpermidineBBIA614270-0001
Gold microcarrier particlesBio-Rad165-22631.0 µm
CaCl2BBICD0050-500
MacrocarriersBio-Rad165-2335
Rupture diskBio-Rad165-2329
Stopping screenBio-Rad165-2336
TryptoneOXOIDLP0042
Yeast ExtractOXOIDLP0021
NaClBBIA610476-0001
KClBBIA610440-0500
GlucoseBBIA600219-0001
Hygromycin BGenviewAH169-1G
WortmanninSigmaF9128
Brefeldin ASigmaSML0975-5MG
Dimethylsulphoxide (DMSO)BBIA600163-0500
T100 Thermal CyclerBio-Rad1861096
Growth chamberPanasonicMLR-352H-PC
PSD-1000/He particle delivery systemBio-Rad165-2257
Gene PulserBio-Rad1652660
CuvetteBio-Rad1652083
Benchtop centrifugeEppendorf5427000097
Confocal microscopeZeissLSM 7 DUO (780&7Live)
NanoDrop 2000/2000c SpectrophotometersThermo Fisher ScientificND-2000
EPS-300 Power SupplyTanonEPS 300
Fluorescent microscopeMshotMF30
AgroseBBIA600234
AmpicillinBBIA100339
Ethylene Diamine Tetraacetie AcidBBIB300599

参考文献

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