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摘要

侵入性仪器的胎儿羔羊提供准确的生理测量的过渡循环的模型, 密切模仿新生儿。

摘要

出生窒息每年在全世界造成近100万人死亡, 是新生儿早期发病率和死亡率的主要原因之一。目前新生儿复苏指南的许多方面仍然存在争议, 因为在进行随机临床试验方面存在困难, 因为需要进行广泛的复苏。大多数关于新生儿复苏的研究都来自于假人模型, 它们无法真正反映生理变化或仔猪模型, 清除了他们的肺液, 已经完成了从胎儿到新生儿循环的转变。本议定书提供了一个详细的分步说明如何创建围产期窒息胎儿羔羊模型。该模型有一个过渡循环和液体填充肺部, 模仿人类新生儿分娩后, 因此, 是一个良好的动物模型, 研究新生儿生理学。对羔羊实验的一个重要限制是较高的相关成本。

引言

围产期窒息发生在大约4每1000足月出生在美国和负责大约 25% 400万新生儿死亡全世界1,2。在胎儿的自然发育过程中, 必须在分娩和分娩期间进行几种适应, 以便在肺部作为气体交换器官的作用下, 从内到宫外孕环境进行无缝过渡。新生儿在出生时没有充分过渡的任何失败进一步损害了复苏的努力。当胎儿肺间隙不完整或延迟3、4和导致持续性高肺血管阻力的情况下,5会影响通气效果, 这仍然是最重要干预在窒息新生儿的复苏6。此外, 立即夹脐带和去除低阻胎盘可能导致心脏输出突变, 可能导致心肌功能障碍7,8。

由于不经常需要积极的复苏 (胸部按压和/或肾上腺素管理需要)1,9, 缺乏强有力的证据从大型随机临床试验, 以支持目前新生儿复苏计划 (NRP) 指南。在新生儿复苏的许多翻译研究研究使用产后动物模型 (特别是仔猪), 无法充分描述过渡胎儿循环和液体填充肺部的新生儿在分娩房间。鉴于与胎儿循环向新生儿循环过渡有关的独特挑战, 围产期窒息心脏骤停胎儿羔羊模型是研究新生儿复苏生理学的理想方法。

约瑟夫来源对胎儿羔羊的研究, 早在1930代初, 奠定了胎儿和新生儿生理学的基础10。在20世纪的后半部分 , 杰弗里？道斯对胎儿羔羊模型进行了创新细致的实验, 后来亚伯拉罕. 鲁道夫对胎儿的心血管和肺生理学知识作出了巨大贡献。11,12. 近年来, 对胎儿/新生儿羔羊模型的研究提供了更好的了解通气对血流动力学的影响13,14, 氧合效应对以及在脐带钳夹7、17中发生的循环变化。最后, 在过去的一年中, 新生羔羊作为一种新的模型来研究复苏18,19,20的血流动力学效应。对进行羔羊实验所涉及的内容, 以及对外科仪器和实验方法的详细描述, 将提出一个循序渐进的叙述。

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研究方案

所有议定书均已由纽约州立大学布法罗 IACUC 机构动物保育和使用委员会批准。图 1显示了描述入侵和非侵入性监测的方法的说明。

1. 动物

  1. 使用时间日期, Q 发烧阴性, 怀孕母羊 (混合品种, 萨福克赛特-卡塔丁山品种) 与胎儿羔羊在127–143天怀孕。
    注: 绵羊足月妊娠期为145天, 127 只怀孕羔羊表现得像极端早产儿。

2. 手术前准备

  1. 在手术前从母羊那里扣留食物12小时。
  2. 用静脉注射 (IV) 安定 (0.25–1.5 毫克/千克) 和氯胺酮 (4 毫克/千克) 使母羊镇静。
  3. 引导母羊入侧卧床到升降推车上。
  4. 将母羊移至背卧床上至 V 型手术台上。

3. 麻醉

注: 在剖宫产前, 母羊以安定、氯胺酮和插管为镇静剂, 随后连续吸入异氟醚 (1–4%)。麻醉的充分性是通过评估肌肉的语调和眼睛的反射, 以及持续监测血氧水平的脉搏脉搏和心率来监测的。在检测过程中, 羔羊将受到产妇麻醉的影响, 并将接受局部麻醉, 以检测现场。

  1. 将母羊插管10.0 毫米的气管导管 (ETT)。ETT 通过声带超过袖口的声音。充气 ETT 袖口, 并绑在 ETT 周围的母羊的下巴, 以确保它到位。
    1. 当眼睑反应缺席时, 调整异氟醚 (2–3% 通常是足够的)。
    2. 提供人工呼吸的常规机械通气 (CMV) 与一小部分的灵感氧 (不负担装卸2) 的0.21。设置呼吸机提供10–15毫升/千克的潮汐量。
    3. 在母羊舌头上的脉冲脉搏连续监测 oxyhemoglobin 饱和度。
    4. 用 capnograph 测量最终潮汐二氧化碳 (EtCO2)。
    5. 调整不负担装卸2和巨细胞病毒, 以维持 oxyhemoglobin 饱和之间的 90-97% 和呼出 CO2之间的35–45毫米汞, 分别。
  2. 将母羊的四肢固定在手术台上, 并进行外科治疗。
    1. 调整手术表, 扭转向健位置, 减轻胎儿压力。
  3. 放置一个 orogastric 管减压和排泄胃的内容。
  4. 补充 IV 液体 (正常生理盐水或乳酸枪手溶液) 在10毫升/千克/小时。
  5. 放置一个直肠温度探头, 以获得连续的核心温度。

4. 手术

注: 剖宫产和胎儿程序被认为是急性手术, 其中动物通过管理戊巴比妥钠100毫克/千克 iv。母羊在羔羊分娩后被安乐死, 在实验完成后, 羔羊被安乐死。停搏证实了安乐死。另外还采用了双侧开胸或放血的辅助方法。在这种情况下, 无菌技术在手术期间没有被实践。在动物接触期间, 人员仍需佩戴防护服。

  1. 把腹部的羊毛剃掉。
  2. 使用烧灼做一个 15–18 cm 腹部皮肤深切口在 linea 的阿尔多暴露的筋膜。
    1. 用钝尖的止血的压力创建一个小开口入腹部。
    2. 保持这个开放, 而滑动钝的尖剪刀到腹壁。
    3. 用剪刀完成 linea 的切口。
  3. 从腹部定位并 exteriorize 子宫内的胎儿头部。
    1. 用一只手握住胎儿的头, 用烧灼在子宫壁 (在羔羊额头上) 做一个10厘米的切口。确保避免任何子叶。
    2. 使用 "用" 钳夹住子宫和胎盘的层, 在四个对立的角落。
    3. 通过子宫和母羊的腹部外暴露羔羊的头部。
    4. 在胎儿手术期间, 将在腹部外放置的一只钳子钳留下。

5. 胎气道

  1. 用3.5–4.5 毫米袖口 ETT 插管部分裸露的胎儿羔羊。通过声带1厘米以上的 ETT 向前推进。
    1. 充气袖口和安全的 ETT 通过绑在管周围的脐带胶带, 然后围绕头部。
    2. 在 ETT 中允许过量的胎儿肺液通过将头部倾斜到一侧而被动排出。这模拟在分娩过程中肺液体的出口。
    3. 咬合在窒息期间, ETT 防止气体交换。

6. 颈部容器仪表

  1. 在所有切口部位剃羊毛并渗入皮下盐酸布比卡因 (0.25%)。
    1. 将两个3厘米的皮肤切口在颈部的两侧 (大约6厘米的头部远端) 与气管相邻。切口应横颈。
    2. tenting 皮肤时, 用烧灼进行切口, 避免划破深层组织。
  2. 用弯曲的凯利或蚊子钳分隔筋膜。
  3. 隔离右颈内静脉和右颈总动脉。
    1. 在两条船下放置两个20厘米, 0 丝缝线。
    2. 在丝缝线之间允许 (近至远端) 1 厘米的空间。
    3. 轻轻地提起每条围绕血管的缝合线, 表面上, 以限制血液流动, 并使一个用虹膜外科剪刀切割到血管中的一毫米。
  4. 在颈动脉, 插入一个预冲洗导管 (15–17 G) 在右颈动脉 caudally 向主动脉弓的血压监测和血液取样。
    1. 使用近端领带完全结扎动脉。
    2. 重复步骤 6.3.2-6.3.3。
    3. 插入预冲洗的颈动脉导管, 用远端丝缝线将动脉和导管围成3节。
  5. 使用类似的技术, 将一个预冲洗导管 (14–16 G) 插入颈静脉, 重复步骤 6.3. 2–6.3 3, 提前7–10厘米 caudally 在胸腔入口 (朝向右心房) 休息。这是用于液体和药物管理以及静脉压力测量。
    1. 检查导管的通畅与血气生理盐水, 然后完成缝合领带周围的血管和导管 (仅近缝合) 使用2–3结。
    2. 插入第二导管 (14–16 G) 约5厘米 rostrally 收集血液从脑循环。使用相同的切口放置两个导管。
    3. 重复步骤 6.5.1, 因为它涉及到远端缝合和导管, 然后绑在对方导管线周围的丝缝线, 以确保他们到位, 以防止扭曲。
  6. 将先前做过的切口延伸到左侧的 T 形 (一厘米)。
    1. 用开曲止血剂抬高左颈动脉。
    2. 在血管周围放置一个2毫米周围流探针来测量血流。
    3. 用1厘米的挠性聚合物套筒覆盖流探针, 以稳定探头的位置。
    4. 将流探针电缆线放入 T 形切口, 使电缆与容器平行运行。
    5. 关闭皮肤切口。绑在电缆周围, 绕着一圈电缆, 以避免限制流量, 如果拉。

7. 大容器仪表

  1. 提取胎儿羔羊露出胸部, 并覆盖裸露的皮肤与聚乙烯包装, 以防止热损失。
  2. 把羔羊放在右外侧卧床。
  3. 将左前肢放置在颈部, 以暴露手术部位。
  4. 渗透3毫升盐酸布比卡因 (0.25%) 沿4次肋间空间和做一个6厘米皮肤切口使用烧灼。
    1. 小心刺穿肋间肌肉与钝弯曲钳, 圆在 3路肋骨之下, 并且出来在下肋骨空间之间。确保不要伤害肺部或心脏。
    2. 为0丝的预切件打开夹具, 并将其穿过以包围肋骨。
    3. 重复步骤 7.4. 1–7.4 2, 以确保在4次肋骨下缝合。
    4. 夹紧每个肋骨周围的领带。轻轻拉起, 并插入一个棉尖的涂抹器进入胸部4次肋间空间。
    5. 使用涂抹杆来保护胸部内容, 同时使用烧灼打开1厘米的肋间空间, 为最终开放 6-8 厘米. 确保肺不被夹在肋骨上。
    6. 把肋骨放在胸腔开口处。打开胸腔将显示左上叶的肺, 主肺动脉 (PA) 和动脉导管未闭。
  5. 使用 2 x 2 英寸纱布包络肺和轻轻推任何暴露的组织远离手术区。
    1. 使用小型手动牵引器改善视野 (如有必要)。
    2. 将脐带 (1/4 英寸宽, 6 英寸长) 预浸泡在羊膜周围的大血管。将脐带浸泡在血管壁上会减少摩擦 (和伤害)。
  6. 使用镊子, 提起心包, 沿主肺动脉切开, 注意不要切断迷走神经。使用涂抹杆保持右心房不干预心包侧切口沿迷走神经。
  7. 使用双子钳, 从导管/pa 凹槽缓慢移动钳在左 pa 周围和后面的 "包围", 并出现在左 pa 的另一侧。许多微妙的组织在这个区域运行, 只有在没有抵抗的情况下才进行。
    1. 当钳的尖端被观察到, 只打开足够远, 以抓住前湿润的脐带的一端。钳位, 只有1位置点击到位。可能, 周围的组织也可能被抓在钳, 如果紧紧夹住的组织可能会被捕获的脐带胶带导致血管损伤。
    2. 轻轻地退下镊子把胶带拉到原位。这有助于为流探针打开一个空间, 并帮助引导流探针的插入 (图 2)。注意保护任何船只的缺口部分是必要的, 因为这是最脆弱的部分组织。
  8. 放置一个第4-6 毫米周围流探针, 轻轻地抬起脐带, 引导探针周围的探头 (L 括号) 金属部分沿已建立的开口。
    1. 将胶带指向探头的背面, 以帮助放置容器, 并可视化 L 支架的末端, 从而使滑动闭合得到保护。
    2. 确保该船的探头尺寸 > 75%, 以确保紧密配合和准确的流量测量。
    3. 小心地切断靠近探头的脐带胶带的末端, 轻轻拉另一端从容器中取出胶带。如果不移除, 磁带将干扰测量。
    4. 应用超声波凝胶, 调整探头和电缆位置, 提高信号强度和质量。
  9. 重复步骤 7.6–7.7 4, 因为它涉及到放置一个 6-8 毫米周围流探针周围动脉导管未闭。
  10. 从胸部取出任何保护性的 2 x 2 纱布, 让肺部重新定位。
  11. 放置一个新的 2 x 2 纱布周围的每个金属托架的流量探头, 以保护肺部。
  12. 用锥形针和2.0 合成单丝缝合在层中闭合胸部。使用切割针和2.0 丝缝线将流探针的电缆固定在外层皮肤上。

8. 无创测量

  1. 在右腋窝、左腋窝和右腹股沟区域连接心电图引线 (三导心电图)。导管前动脉 oxyhemoglobin 饱和度 (2) 是用脉冲脉搏在右前肢和后肢分别监测。用缝线和不透明的敷料在前额上固定一个近红外光谱仪 (红外光谱) 监视器。

9. 数据收集

  1. 使用数据采集软件收集和记录数据。图 1显示了侵入性和非侵入的参数, 包括: 动脉和中心静脉血压, 左颈总动脉, 左肺和导管动脉血流, 心电图,2,近红外光谱, ETCO2。
    注意: 数据收集的软件和设备设置可能会有所不同, 超出了本文的范围。

10. 试验性议定书

  1. 咬合并切断脐带, 将羔羊从母体腹部移至辐射温暖的部位。
  2. 在窒息期, 插入脐静脉导管的肾上腺素管理 (0.01–0.03 毫克/千克 IV, 每 NRP 建议)。
  3. 插入脐动脉导管收集导管后动脉血气。
  4. 监测羔羊的临近停搏, 这可以定义为没有检测到颈动脉流量和压力。
  5. 确保有足够的人员, 并把每个人都奉献给以下任务: (1) 管理通气和气道, (2) 进行胸外按压, (3) 用药, (4) 抽取血样, (5) 引导代码。
  6. 开始复苏, 提供正压通气 (PPV) 与 T 片复苏器在压力35/5 厘米 H2o 启动20分钟计时器的实验性复苏协议。
  7. 在三十年代的通气后, 开始胸部按压通过放置拇指和手指的一只手在对面的胸部。
    1. 通过将手指和拇指挤压到大约1/3 的深度来提供胸部按压。
  8. 以3分钟的间隔管理肾上腺素。
  9. 持续复苏的努力, 直到返回的自发循环或高达20分钟。
  10. 在自发循环返回时, 连续 IV 流体 (5 毫升/千克/小时) 和芬太尼 (0.5-2.0 微克/千克/小时, 滴定), 是通过先前建立的颈静脉导管。在20分钟的复苏期后, 该动物被安乐死。如果羔羊不能达到 ROSC 20 分钟, 继续安乐死。

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结果

根据胎儿羔羊的检测, 可以记录血流动力学变量 (图 3和图 4), 然后进行分析和解释 (图 5)。可以收集频繁的血液样本,图 6显示了其中一个实验的 pH 值和帕2数据。有时, 导管或流探头可能会出现故障或脱落, 因此数据不能收集和用于分析, 如图 7所示。

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讨论

羔羊模型是可比的大小, 以人类新生儿和允许简易仪器测量侵入性血流动力学变量。胎儿/新生羔羊模型是一个宝贵的研究工具, 丰富的帮助了解过渡循环, 以及新生儿的肺和心血管生理学。多年来建立了几个实验性羔羊模型, 研究了持续性肺动脉高压导管中早产儿13、14、21、肺血流动力学的最佳通气策略。结扎模型...

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披露声明

作者没有利益冲突申报

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Babcock forcepsMiltex16-44
Blood pressure transducerBecton DickinsonP23XL-1Used with saline filled diaphragm domes
Blunt tipped scissorsMiltex98SCS50-56
CapnographPhilips7900Used with Neonatal Flow Sensors
Cautery pencilValley Lab287879
Cautery unitValley LabSSE2K
Curved ForcepsEverost711714
Data acquisition softwareBiopac Systems Inc.ACK100W
EKGBiopac Systems Inc.ECG100C
Endotracheal tube -cuffedRusch111780035
Flow modulatorTransonic Systems Inc. T403
Flow-probeTransonic Systems Inc. MC4PSS-LS-WC100-CM4B-GA
Gastric tubeJorgensen Labs Inc.J0106LETo decompress and drain ewe stomach
Hair clipperAndis Company65340 # 40 Clipper Blade
Infant radiant warmerGE healthcare7810
Intravenous cathetersBecton Dickinson381234
Iris surgical scissorsPatterson510585
Kelly ForecepsPatterson510535
Mosquito ForcepsRICA Surgical Products INC1-74
Near-infrared spectroscopyNonin Medical Inc. X-100MSensmart Equanox & PureSAT
RSO2 SensorNonin Medical Inc. 8004CB-NANeonatal 
Scalpel handle and bladeEverost707203
Sutures -silk 2-0CovidienSS-695Used for tying catheters to vessels
Sutures -vicryl  2-0EthiconJ269HUsed for closing thoracotomy 
T-piece resuscitatorNeo-TeeMCM1050812
Umbilical tiesJorgensen Labs Inc.J0025UA
Weitlander RetractorMiltex11-625

参考文献

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