La Perinatal asfixia cordero modelo: Un modelo para la reanimación de recién nacido

Resumen

Instrumentación invasiva del cordero fetal proporciona mediciones precisas fisiológicas de la circulación de transición en un modelo que imita muy de cerca al bebé recién nacido.

Resumen

Asfixia del nacimiento representa casi 1 millón de muertes en todo el mundo cada año y es una de las principales causas de mortalidad y morbilidad neonatal temprana. Muchos aspectos de las pautas actuales de reanimación neonatal siguen siendo polémicos dadas las dificultades en la realización de ensayos clínicos aleatorios debido a la infrecuente y a menudo imprevisible necesidad de resucitación amplia. Mayoría de los estudios en la reanimación neonatal se derivan de modelos maniquí que no verdaderamente reflejar cambios fisiológicos o cochinillo modelos que han limpiado su líquido pulmonar y que han completado la transición de feto a la circulación neonatal. El presente Protocolo proporciona una descripción detallada paso a paso sobre cómo crear un modelo de cordero fetal asfixia perinatal. El modelo propuesto tiene una transición de la circulación y los pulmones llenos de líquido, que imita humanos recién nacidos después del nacimiento y es, por tanto, un excelente modelo animal para estudiar la fisiología del recién nacido. Una importante limitación a los experimentos de cordero es el mayor costo asociado.

Introducción

Asfixia perinatal ocurre en aproximadamente 4 por cada 1.000 nacidos de término en los Estados Unidos y es responsable de aproximadamente el 25% de los 4 millones de muertes neonatales en todo el mundo^1,2. A lo largo del desarrollo natural del feto, varias adaptaciones deben ocurrir durante el parto y al nacimiento para permitir una transición sin problemas desde el intra - al ambiente extrauterino cuando los pulmones toman el papel de la placenta como órgano de intercambio gaseoso. Cualquier falla del recién nacido a la adecuada transición al nacer más compromete esfuerzos de resucitación. Casos al pulmón fetal es incompleta o retrasada^3,4y las circunstancias que resultan en un impacto de⁵ de la resistencia vascular pulmonar alta persistente (PVR) la eficacia de la ventilación, que sigue siendo el más intervención importante en la reanimación de los recién nacidos asfixiados⁶. Además, el pinzamiento inmediato del cordón umbilical y extracción de la placenta de baja resistencia puede conducir a cambios bruscos en volumen cardiaco que puede causar la disfunción miocardio^7,8.

Debido a la frecuente necesidad de resucitación agresiva (necesidad de compresiones o administración de epinefrina)^1,9, hay una falta de evidencia fuerte de grandes ensayos clínicos para apoyar la corriente requisitos del programa (PNR) de la reanimación neonatal. Muchos estudios de investigación traslacional en la reanimación neonatal son efectuados por el postnatales modelos animales (especialmente cerdos) que no representan adecuadamente la transición de circulación fetal y en los pulmones llenos de líquido inherentes al recién nacido en la entrega habitación. Dado los desafíos relacionados con la transición de circulación fetal a la circulación neonatal, el modelo de cordero fetal cardiaco asfixia perinatal es ideal para estudiar la fisiología de resucitación neonatal.

Los estudios de Joseph Barcroft en fetal corderos, ya en la década de 1930, sentó las bases de fisiología fetal y neonatal¹⁰. En la segunda mitad del^{siglo 20} , experimentos innovadores y meticulosos de Geoffrey Dawes en fetal cordero modelos, y más adelante ésos por Abraham Rudolph han contribuido enormemente al conocimiento de la fisiología cardiovascular y pulmonar en el feto ^{11 , 12}. en los últimos años, estudios en modelos de cordero fetal y neonatal han proporcionado una mejor comprensión del impacto de la ventilación sobre la hemodinámica^13,14, los efectos de la oxigenación en PVR^15,16, así como de los cambios circulatorios que ocurren durante el cable de sujeción de^7,17. Finalmente, en el último año, el cordero recién nacido ha servido como un modelo novedoso para el estudio de los efectos hemodinámicos durante la resucitación^18,19,20. Un relato paso a paso de lo que está implicado en la realización de un experimento de cordero, así como una descripción detallada de la instrumentación quirúrgica y se presentará la metodología experimental.

Protocolo

Todos los protocolos han sido aprobados por el institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) por el búfalo de la Universidad Estatal de Nueva York. Una ilustración de la metodología que representa la invasión y la monitorización no invasiva se muestra en la figura 1.

1. los animales

1. Uso tiempo fecha, fiebre Q seronegativos, embarazadas ovejas (raza mezclada, Suffolk-Dorset-Katahdin raza) con corderos fetales en la gestación de 127 – 143 días.
   Nota: La gestación de término de ovejas es de 145 días y 127 de la gestación de corderos se comportan como prematuros extremos.

2. pre-operatorio preparación

1. Retener el alimento de la oveja 12 h antes de la cirugía.
2. Sedar a la oveja con diazepan intravenoso (IV) (0.25-1.5 mg/kg) y ketamina (4 mg/kg).
3. Guía de la oveja en recumbency lateral en un carro de elevación.
4. Hacia la oveja recumbency dorsal sobre una mesa quirúrgica de V.

3. anestesia

Nota: Antes de la cesárea, la oveja es sedada con diazepam y ketamina e intubada seguido por la inhalación continua de isoflurano (1-4%). Adecuación de la anestesia es supervisado por la evaluación de los reflejos de tono y ojo músculo junto con el monitoreo continuo del nivel de oxígeno de la sangre con un oxímetro de pulso y el ritmo cardíaco. Durante la instrumentación, será bajo la influencia de la anestesia materna y recibirá anestesia local para sitios de instrumentación.

1. Intubación la oveja con un tubo endotraqueal de 10,0 mm manguito (ETT). Avance de la ETT a través de las voces cuerdas 1-2 cm más allá de la banda. Inflar el manguito ETT y atar la ETT alrededor de la mandíbula de la oveja para asegurarlo en su lugar.
   1. Cuando la respuesta palpebral está ausente, ajustar el isoflurano (2 – 3% es suficiente).
   2. Proporcionar respiración artificial por la ventilación mecánica convencional (VMC) con una fracción de oxígeno inspirado (FIO₂) de 0,21. Conjunto del ventilador para proporcionar volúmenes corrientes de 10-15 mL/kg.
   3. Monitorear continuamente la saturación de oxihemoglobina mediante un oxímetro de pulso colocado en la lengua de la oveja.
   4. Medir el dióxido de carbono (EtCO₂) fin-de marea con un capnógrafo.
   5. Ajustar la FIO₂ y CMV para mantener la saturación de oxihemoglobina entre 90-97% y de CO espirado₂ entre 35 – 45 mm Hg, respectivamente.
2. Garantizar miembros de oveja a la mesa quirúrgica con amarre quirúrgico.
   1. Ajuste la mesa quirúrgica para invertir la posición de Trendelenburg para aliviar la presión sobre el feto.
3. Coloque un tubo orogástrico para descomprimir y drenar el contenido gástrico.
4. Suplemento líquido IV (solución salina normal o solución de timbres de lactato) a 10 mL/kg/h.
5. Colocar una sonda de temperatura rectal para obtener temperatura continua.

4. cirugía

Nota: Los procedimientos fetales y cesárea se consideran cirugías agudas en la que los animales son sacrificados mediante la administración IV de 100 mg/kg de pentobarbital de sodio. Las ovejas son sacrificadas después de la entrega de los corderos y los corderos son sacrificados después de la realización de los experimentos. Eutanasia es confirmada por asistolia. También se emplea un método secundario de toracotomía bilateral o exsanguinación. En este caso, la técnica aséptica no se practica durante la cirugía. Personal todavía necesita usar vestimenta de protección durante el contacto animal.

1. Afeitarse la lana del abdomen ventral.
2. Utilizar el cauterio para hacer una incisión abdominal superficial de 15 – 18 cm sobre la linea alba para exponer la fascia.
   1. Crear una pequeña abertura en el abdomen usando presión con una pinza con punta Roma.
   2. Mantener esta apertura mientras desliza una tijera con punta Roma en la pared abdominal.
   3. Utilice las tijeras para completar la incisión de la línea alba.
3. Localice y exteriorizar la cabeza fetal dentro del útero desde el abdomen.
   1. Mantenga la cabeza fetal con una mano y usar el cauterio para hacer una incisión de 10 cm a través de la pared uterina (en frente del cordero). Asegúrese de evitar cualquier cotiledones.
   2. Utilizar pinzas de Babcock para apretar las capas del útero y la placenta juntos en cuatro esquinas opuestas.
   3. Exponer la cabeza del cordero a través del útero y fuera del abdomen de la oveja.
   4. Deje las pinzas de Babcock tendido fuera del abdomen durante la cirugía fetal.

5. vía aérea fetal

1. Intubación parcialmente expuesta cordero fetal de 3.5 – 4.5 mm manguito ETT. Avanzar en la ETT a través de las cuerdas vocales 1 cm más allá de la banda.
   1. Inflar el manguito y asegure la ETT atando una cinta umbilical alrededor del tubo y luego alrededor de la cabeza.
   2. Deje que el fluido pulmonar fetal exceso en la ETT para drenar pasivamente inclinando la cabeza hacia el lado. Esto simula la salida del líquido pulmonar durante el parto.
   3. Ocluir la ETT para evitar intercambio de gases durante el jadeo en el período de asphyxial.

6. cuello barco instrumentación

1. Afeitarse la lana e infiltrarse en 1 – 2 mL de clorhidrato de bupivacaína subcutánea (0.25%) en todos los sitios de incisión.
   1. Hacer dos incisiones de piel de 3 cm a cada lado del cuello (aproximadamente de 6 cm distal a la cabeza) adyacente a la tráquea. Las incisiones deben transversales del cuello.
   2. Realizar la incisión con el cauterio y acampar la piel, para evitar lacerar el tejido profundo.
2. Separar la fascia con pinzas de Kelly o mosquito curvadas.
3. Aislar la vena yugular interna derecha y la arteria carótida común derecha.
   1. Lugar dos 20 cm, las suturas de seda 0 en ambos vasos.
   2. Dejar un espacio (proximal a distal) de 1 cm entre las suturas de seda.
   3. Levante con cuidado cada sutura que rodea el vaso, superficialmente, a restringir el flujo sanguíneo y a hacer un corte transversal de 1 – 2 mm en el vaso usando una tijeras quirúrgicas Iris.
4. De la arteria carótida, inserte un catéter previamente enrojecida (15 – 17 G) en la arteria carótida derecha caudalmente hacia el arco aórtico para control de presión arterial y tomar muestras de sangre.
   1. Utilizar la ligadura proximal para ligar la arteria completamente.
   2. Repita los pasos 6.3.2 - 6.3.3.
   3. Inserte el catéter arterial carótido previamente enjuagado y utilizar la sutura distal de seda para atar alrededor de la arteria y el catéter con 3 nudos.
5. Uso una técnica similar, para insertar un catéter previamente enrojecida (14 – 16 G) en la vena yugular, repita los pasos 6.3.2–6.3.3, avance 7 – 10 cm caudalmente para descansar dentro de la entrada torácica (hacia la aurícula derecha). Esto se utiliza para administración de fluidos y medicación así como las mediciones de la presión venosa.
   1. Revise el catéter permeabilidad con solución salina heparinizada y luego completa el lazo de sutura alrededor de la embarcación y el catéter (con la sutura proximal) usando 2-3 nudos.
   2. Inserte el segundo catéter (14 – 16 G) aproximadamente 5 cm rostral para recolectar sangre de la circulación cerebral. Usar el mismo corte para la colocación de dos catéteres.
   3. Repita el paso 6.5.1 lo que respecta a la sutura distal y el catéter y luego atar las suturas de seda alrededor de las líneas opuestas de catéter para fijarlos en su lugar para evitar la torsión.
6. Extender la incisión previamente hecha en una forma de T (1-2 cm) en el lado izquierdo.
   1. Elevar la arteria carótida izquierda mediante un hemostato curvo abierto.
   2. Lugar una sonda de flujo 2 mm perivascular alrededor de la nave para medir el flujo de sangre.
   3. Cubierta de la sonda de flujo con una funda de polímero flexible de 1 cm para estabilizar la sonda en posición.
   4. Coloque la línea de cable de sonda de flujo en la incisión en forma de T, permitiendo que el cable de paralelo con el buque.
   5. Cerrar la incisión de la piel. Atar alrededor del cable y alrededor de un lazo de cable, para evitar restringir el flujo si.

7. gran vaso instrumentación

1. Extraer el cordero fetal para exponer el pecho y cubrir la piel expuesta con envoltura de polietileno para evitar pérdida de calor.
2. Colocar el cordero en recumbency lateral derecho.
3. Posición del miembro anterior izquierdo alrededor del cuello para exponer el campo quirúrgico.
4. Infiltrarse en 3 mL de bupivacaína clorhidrato (0,25%) a lo largo de los 4 espacio intercostal^th y haga una incisión de piel de 6 cm con el cauterio.
   1. Cuidadosamente perforar el músculo intercostal con pinzas curvas contundentes, círculo debajo de la costilla 3^rd y salir entre el siguiente espacio intercostal. Asegúrese de no dañar el pulmón o el corazón.
   2. Abra la pinza para una pieza corta de seda 0 y pase a través para rodear a la costilla.
   3. Repita los pasos 7.4.1–7.4.2 para asegurar la sutura en el 4^th costilla.
   4. Amarrar los lazos alrededor de cada costilla. Suavemente tire e insertar un aplicador con punta de algodón en el pecho bajo el 4 espacio intercostal de la^th .
   5. Use el aplicador para proteger el contenido del pecho mientras utiliza la cauterización para abrir el espacio intercostal en 1 cm para una abertura final de 6-8 cm. Asegúrese de que el pulmón no es atrapado en los lazos de la costilla.
   6. Coloque un separador costilla en la abertura del pecho. Abrir el pecho revelará los lóbulos superiores izquierdos del pulmón, la arteria pulmonar principal (PA) y el conducto arterioso.
5. Utilizar gasas de 2 x 2 pulgadas que envuelve el pulmón y empuje suavemente cualquier tejido expuesto fuera de la zona quirúrgica.
   1. Usar un retractor manual pequeño para mejorar el campo de visión (si es necesario).
   2. Lugar una cinta umbilical (anchura de 1/4 pulgadas, 6 pulgadas de longitud) previamente remojados amnion alrededor de los grandes vasos. Remojo la cinta umbilical disminuye la fricción (y daño) en las paredes del recipiente.
6. Con unas pinzas, levantar el pericardio y cortar a lo largo de la arteria pulmonar principal, teniendo cuidado de no para cortar el nervio vagal. Utilizar una varilla aplicadora para mantener a la aurícula derecha de interferir con un corte lateral del pericardio a lo largo del nervio vagal.
7. Con unas pinzas de Géminis, mover las pinzas lentamente desde la muesca ductal/PA alrededor y detrás del izquierda PA que "rodean" y emergen en el otro lado del izquierda PA. Muchos tejidos delicados bajo esta área y proceden sólo si no hay ninguna resistencia.
   1. Cuando se observa la punta de las pinzas, abierta solamente lo suficiente para agarrar uno de los extremos de la cinta umbilical previamente humedecida. Abrazadera con 1 posición haga cliqueada en el lugar. Es posible que tejido circundante podría ser atrapado en las pinzas, y si bien afianzado con abrazadera ese tejido puede ser cogido con la cinta umbilical, lesiones de vasos.
   2. Suavemente se retiran las pinzas para tirar de la cinta en posición. Esto sirve para abrir un espacio para la sonda de flujo y ayuda a dirigir la inserción de las sondas de flujo (figura 2). Cuidado para proteger la ranura porción de cualquier barco es imprescindible ya que es la parte más frágil del tejido.
8. Coloque una de 4 – 6 mm perivascular flujo-sonda suavemente levantando la cinta umbilical y guiando la parte metálica (soporte) de la sonda alrededor de la nave a lo largo de la apertura establecida.
   1. Directa de la cinta hacia la parte posterior de la sonda para ayudar a la nave en el lugar de asiento y a visualizar el final del L soporte permitiendo el cierre deslizante para fijarse.
   2. Asegúrese de que el buque es > 75% del tamaño de la punta de prueba para asegurar un flujo forma y preciso medidas.
   3. Cuidadosamente corte el extremo de la cinta umbilical cerca de la sonda y tire el otro extremo para retirar la cinta de la nave. La cinta va a interferir con las mediciones si no se.
   4. Aplique el gel de ultrasonido y ajustar la posición de la sonda y el cable para mejorar la calidad y la intensidad de la señal.
9. Repita los pasos 7.6 – 7.7.4 lo que respecta a la colocación de una sonda 6-8 mm perivascular flujo por el ductus arterioso.
10. Saque cualquier gasa 2 x 2 protector del tórax y el pulmón se vuelva a colocar.
11. Colocar una nueva gasa 2 x 2 alrededor de cada soporte metálico de la sonda de flujo para proteger el pulmón.
12. Cerrar el pecho en capas usando una aguja cónica y sutura de monofilamento sintético 2.0. Asegure los cables de las sondas de flujo a la piel externa con un bucle usando una aguja de corte y sutura de seda 2.0.

8. no-medición invasiva

1. Conecte los conductores de EKG en el axilla derecho, axila izquierda y área inguinal correcta (ECG de tres derivaciones). Saturación de oxihemoglobina arterial pre y post ductal (SpO₂) se controla con un oxímetro de pulso colocado en la extremidad delantera derecha y sea trasera, respectivamente. Fije a un monitor de espectroscopia de infrarrojo cercano (NIRS) en la frente con las suturas y un vendaje opaco.

9. recolección de datos

1. Recoger y registrar datos utilizando un software de adquisición de datos. La figura 1 ilustra los parámetros invasivos y no invasivos incluyendo: presión de la sangre venosa central y arterial, flujo de sangre arterial pulmonar y ductal izquierda, carótida común izquierda, ECG, SpO_2, NIRS, ETCO₂.
   Nota: La configuración de software y equipo para colección de datos puede variar y está fuera del alcance de este artículo.

10. protocolo experimental

1. Ocluir y corte el cordón umbilical y hacia el cordero desde el abdomen materno un calentador radiante.
2. Durante el período de asphyxial, inserte un catéter umbilical venoso para la administración de epinefrina (0.01 – 0.03 mg/kg IV, según las recomendaciones de NRP).
3. Insertar un catéter arterial umbilical para recoger gases de sangre arterial post ductal.
4. Supervisar el cordero para asistolia inminente, que puede definirse como la ausencia de flujo detectado de la carótida y la presión.
5. Garantizar la adecuada personal y dedicar a cada persona a las siguientes tareas: (1) manejo de ventilación y las vías respiratorias (2) realice las compresiones, (3) administrar medicamentos, (4) extraer muestras de sangre, (5) llevar el código.
6. Iniciar reanimación proporcionando ventilación con presión positiva (PPV) con un resucitador de pieza en T con presiones de 35/5 cm H₂O. iniciar el temporizador de 20 minutos para el protocolo de reanimación experimental.
7. Después de 30 s de ventilación, iniciar compresiones de pecho colocando el pulgar y los dedos de una mano en los lados opuestos del pecho.
   1. Proporcionar compresiones apretando los dedos y pulgar juntos a una profundidad de aproximadamente 1/3.
8. Administrar epinefrina a intervalos de 3 minutos.
9. Continuar con los esfuerzos de reanimación hasta el regreso de la circulación espontánea o hasta 20 minutos.
10. En el retorno de la circulación espontánea, líquidos IV continuadas (5 cc/kg/hr) y fentanilo (0.5-2.0 mcg/kg/hr; valorada al efecto), se dan a través del catéter venoso yugular previamente establecido. Después del período de resucitación de 20 minutos, el animal es eutanasia. Si los corderos no alcanzan ROSC por 20 min, proceder con la eutanasia.

Resultados

Después de la instrumentación de los corderos fetales, variables hemodinámicas pueden ser registrados (figura 3 y figura 4), analizaron e interpretaron (figura 5). Se recogerán muestras de sangre frecuentes, y la figura 6 muestra el pH y la PaCO₂ datos de uno de los experimentos. En ocasiones, catéteres o sondas de flujo pueden funcionar mal o conseguirá...

Discusión

El modelo de cordero es comparable en tamaño a los recién nacidos humanos y permite fácil instrumentación para medir las variables hemodinámicas invasivas. El modelo fetal, recién nacido Cordero ha sido una herramienta invaluable que rico ha contribuido a entender la transición de la circulación, así como la fisiología pulmonar y cardiovascular del recién nacido. Varios modelos experimentales de cordero se han establecido durante los años para estudiar estrategias de ventilación óptima en prematuros cordero...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Babcock forceps	Miltex	16-44
Blood pressure transducer	Becton Dickinson	P23XL-1	Used with saline filled diaphragm domes
Blunt tipped scissors	Miltex	98SCS50-56
Capnograph	Philips	7900	Used with Neonatal Flow Sensors
Cautery pencil	Valley Lab	287879
Cautery unit	Valley Lab	SSE2K
Curved Forceps	Everost	711714
Data acquisition software	Biopac Systems Inc.	ACK100W
EKG	Biopac Systems Inc.	ECG100C
Endotracheal tube -cuffed	Rusch	111780035
Flow modulator	Transonic Systems Inc.	T403
Flow-probe	Transonic Systems Inc.	MC4PSS-LS-WC100-CM4B-GA
Gastric tube	Jorgensen Labs Inc.	J0106LE	To decompress and drain ewe stomach
Hair clipper	Andis Company	65340	# 40 Clipper Blade
Infant radiant warmer	GE healthcare	7810
Intravenous catheters	Becton Dickinson	381234
Iris surgical scissors	Patterson	510585
Kelly Foreceps	Patterson	510535
Mosquito Forceps	RICA Surgical Products INC	1-74
Near-infrared spectroscopy	Nonin Medical Inc.	X-100M	Sensmart Equanox & PureSAT
RSO2 Sensor	Nonin Medical Inc.	8004CB-NA	Neonatal
Scalpel handle and blade	Everost	707203
Sutures -silk 2-0	Covidien	SS-695	Used for tying catheters to vessels
Sutures -vicryl  2-0	Ethicon	J269H	Used for closing thoracotomy
T-piece resuscitator	Neo-Tee	MCM1050812
Umbilical ties	Jorgensen Labs Inc.	J0025UA
Weitlander Retractor	Miltex	11-625