Il perinatale asfissiati agnello modello: Un modello per la rianimazione del neonato

Riepilogo

La strumentazione invasiva dell'agnello fetale fornisce accurate misure fisiologiche della circolazione transizione in un modello che imita molto attentamente l'infante appena nato.

Abstract

Asfissia di nascita rappresenta quasi 1 milione di morti in tutto il mondo ogni anno ed è uno delle cause principali di morbilità neonatale precoce e mortalità. Molti aspetti degli attuali orientamenti di rianimazione neonatale rimangono discutibili, tenuto conto delle difficoltà nella conduzione di studi clinici randomizzati a causa della rara e spesso imprevedibile bisogno per rianimazione estesa. Maggior parte degli studi sulla rianimazione neonatale derivano da modelli di manichino che non riescono a riflettere veramente cambiamenti fisiologici o maialino che hanno cancellato il loro liquido polmonare e che hanno completato la transizione da fetale alla circolazione neonatale. Il presente protocollo fornisce una dettagliata descrizione dettagliata su come creare un modello di agnello fetale asfittica perinatale. Il modello proposto ha una circolazione di transizione e fluido-riempita polmoni, che imita i neonati umani dopo il parto e dunque, è un eccellente modello animale per studiare la fisiologia del neonato. Una limitazione importante per esperimenti di agnello è il più alto costo associato.

Introduzione

Asfissia perinatale si verifica in circa 4 per 1000 nati vivi a termine negli Stati Uniti ed è responsabile di circa il 25% delle morti neonatali 4 milioni in tutto il mondo^1,2. Durante lo sviluppo naturale del feto, diversi adattamenti devono avvenire durante il travaglio e alla nascita per consentire una transizione senza soluzione di continuità da intra - all'ambiente extrauterina quando prendere i polmoni sul ruolo della placenta come l'organo dello scambio di gas. Qualsiasi guasto del neonato adeguatamente transizione alla nascita di ulteriori compromessi degli sforzi rianimatori. Casi in cui la rimozione del polmone fetale è incompleta o ritardata^3,4e le circostanze che provocano un impatto di⁵ la resistenza vascolare polmonare alta persistente (PVR) l'efficacia della ventilazione, che rimane il più importante intervento nella rianimazione del neonato asfissiato⁶. Inoltre, bloccaggio immediato del cordone ombelicale e la rimozione della placenta bassa resistenza può portare a cambiamenti improvvisi di gittata cardiaca che possono causare la disfunzione miocardica^7,8.

Data l'esigenza infrequente di rianimazione aggressiva (necessità di compressioni toraciche e/o somministrazione di epinefrina)^1,9, c'è una mancanza di forte evidenza da grandi studi clinici randomizzati per sostenere la corrente linee guida del programma (NRP) di rianimazione neonatale. Molti studi di ricerca traslazionale in rianimazione neonatale sono condotti utilizzando modelli animali postnatale (specialmente i suinetti) che non riescono a descrivere adeguatamente la transizione circolazione fetale e fluido-riempita polmoni inerenti al neonato la consegna camera. Date le sfide uniche legate alla transizione dalla circolazione fetale alla circolazione neonatale, il modello di agnello fetale perinatale asfittica arresto cardiaco è ideale per studiare la fisiologia resuscitative neonato.

Gli studi condotti da Joseph Barcroft su fetale Agnelli, fin dal 1930, le basi per fisiologia fetale e neonatale¹⁰. Nella seconda metà del 20^° secolo, esperimenti di innovativi e meticolosi di Geoffrey Dawes su fetale modelli di agnello, e più tardi quelli di Abraham Rudolph hanno contribuito enormemente alla conoscenza della fisiologia cardiovascolare e polmonare nel feto ^{11 , 12}. negli ultimi anni, gli studi sui modelli di agnello fetale/neonatale hanno fornito una migliore comprensione dell'impatto della ventilazione su emodinamica^13,14, gli effetti dell'ossigenazione del PVR^15,16, così come le modifiche circolatorie che si verificano durante cavo di bloccaggio^7,17. Infine, l'anno scorso, l'agnello appena nato ha servito come un nuovo modello per studiare gli effetti emodinamici durante la rianimazione^18,19,20. Una narrazione dettagliata di ciò che è coinvolto nella conduzione di un esperimento di agnello, nonché una descrizione dettagliata delle strumentazioni chirurgiche e sarà presentata la metodologia sperimentale.

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Protocollo

Tutti i protocolli sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) di Buffalo State University of New York. Un'illustrazione della metodologia raffigurante invasiva e il monitoraggio non invasivo è illustrata nella Figura 1.

1. gli animali

1. Uso tempo-datato, le pecore di sieronegativi, incinte di Q-febbre (razza mixed-Allevi, Suffolk-Dorset-Katahdin) con agnelli fetali alla gestazione di 127 – 143 giorni.
   Nota: Pecore termine gestazione è 145 giorni e 127 gestazione agnelli si comportano come bambini prematuri estremi.

2. preparazione pre-chirurgica

1. Trattenere il cibo da ewe 12 h prima della chirurgia.
2. Sedare la pecora con diazepam per via endovenosa (IV) (0,25-1,5 mg/kg) e ketamina (4 mg/kg).
3. Guida la pecora in decubito laterale su un carrello elevatore.
4. Spostare la pecora in decubito dorsale su un tavolo chirurgico V-top.

3. anestesia

Nota: Prima della sezione caesarean, la pecora è sedata con diazepam e ketamina e intubata seguita da inalazione continua di isoflurane (1 – 4%). Adeguatezza dell'anestesia è monitorato da valutazione dei riflessi tono e occhio muscolo insieme al monitoraggio continuo del livello di ossigeno del sangue con un ossimetro di impulso e la frequenza cardiaca. Durante la strumentazione, agnelli saranno sotto l'influenza dell'anestesia materno e riceveranno anche un anestetico locale a siti di strumentazione.

1. Intubare la pecora con un tubo endotracheale di 10,0 mm cuffed (ETT). Anticipo la ETT attraverso la voce cavi di 1 – 2 cm oltre il bracciale. Gonfiare il bracciale ETT e cravatta ETT intorno mascella di pecora per fissarlo in posizione.
   1. Quando la risposta palpebrale è assente, regolare l'isoflurano (2 – 3% è in genere sufficiente).
   2. Fornire respiri artificiali di ventilazione meccanica convenzionale (CMV) con una frazione di ossigeno inspirato (FIO₂) di 0,21. Impostare il ventilatore per fornire volumi correnti di 10 – 15 mL/kg.
   3. Monitorare la saturazione ossiemoglobinica continuamente un pulsossimetro collocato sulla linguetta di pecora.
   4. Misurare l'anidride carbonica fine-di marea (EtCO₂) con un capnograph.
   5. Regolare il FIO₂ e CMV per mantenere la saturazione ossiemoglobinica tra 90-97% e nell'aria espirata CO₂ tra 35 – 45 mm Hg, rispettivamente.
2. Fissare gli arti di pecora per il tavolo operatorio con chirurgica tie-downs.
   1. Regolare il tavolo operatorio per invertire la posizione di Trendelenburg per alleviare la pressione sul feto.
3. Posizionare un tubo orogastrico per decomprimere e drenare il contenuto gastrico.
4. Supplemento IV liquido (soluzione salina o soluzione di lattato Ringers) a 10 mL/kg/h.
5. Inserire una sonda rettale temperatura per ottenere la temperatura interna costante.

4. chirurgia

Nota: La sezione cesarean e procedure fetale sono considerate interventi chirurgici acuti in cui gli animali sono euthanized attraverso la somministrazione di sodio pentobarbital 100 mg/kg IV. Le pecore sono euthanized successivi alla consegna degli agnelli e gli agnelli sono euthanized dopo il completamento degli esperimenti. L'eutanasia è confermata da asistolia. È anche impiegato un metodo secondario di toracotomia bilaterale o dissanguamento. In questo caso, la tecnica asettica non è praticata durante l'intervento chirurgico. Personale comunque necessario indossare indumenti protettivi durante il contatto animale.

1. Radere la lana dall'addome ventrale.
2. Utilizzare il cauterio per fare un'incisione superficiale addominale di 15 – 18 cm sopra la linea alba per esporre la fascia.
   1. Creare una piccola apertura nell'addome usando pressione con una pinza emostatica punta smussata.
   2. Mantenere questa apertura mentre si fa scorrere una forbice punta smussata nella parete addominale.
   3. Utilizzare le forbici per completare l'incisione della linea alba.
3. Individuare ed esternare la testa del feto all'interno dell'utero dall'addome.
   1. Tenere la testa del feto con una mano e utilizzare il cauterio per praticare un'incisione di 10cm tramite la parete uterina (sopra la fronte dell'agnello). Garantire per evitare qualsiasi cotiledoni.
   2. Utilizzare forcipi Babcock per serrare gli strati dell'utero e placenta insieme ai quattro angoli opposti.
   3. Esporre la testa dell'agnello attraverso l'utero e di fuori dell'addome di pecora.
   4. Lasciare il forcipe Babcock posa di fuori dell'addome durante l'ambulatorio fetale.

5. fetale delle vie respiratorie

1. Intubare parzialmente esposto agnello fetale con un 3,5 – 4,5 mm ammanettato ETT. Avanzare la ETT attraverso le corde vocali 1 cm oltre il bracciale.
   1. Gonfiare il bracciale e fissare i ETT legando un nastro ombelicale attorno al tubo e poi intorno alla testa.
   2. Permettono di liquido in eccesso del polmone fetale in ETT per drenare passivamente inclinando la testa di lato. Questo simula l'uscita di liquido polmonare durante il travaglio.
   3. Occludere l'ETT per impedire lo scambio di gas durante ansimante nel periodo asphyxial.

6. collo vaso strumentazione

1. Radere la lana e infiltrarsi 1 – 2 mL di bupivacaina sottocutaneo cloridrato (0,25%) in tutti i siti di incisione.
   1. Fare due incisioni cutanee di 3 cm su ogni lato del collo (circa 6 cm distalmente alla testa) adiacente alla trachea. Le incisioni dovrebbero trasversale del collo.
   2. Eseguire l'incisione utilizzando il cauterio mentre tenting la pelle, per evitare di lacerare il tessuto profondo.
2. Separare la fascia usando la pinzetta Kelly o zanzara.
3. Isolare la vena giugulare interna destra e l'arteria carotica comune di destra.
   1. Posto due 20 cm, 0 suture seta sotto entrambe le navi.
   2. Lasciare uno spazio (prossimale a distale) di 1 cm tra i punti di sutura seta.
   3. Sollevare delicatamente ogni sutura che è intorno al vaso, superficialmente, per limitare il flusso di sangue e fare un taglio trasversale di 1 – 2 mm nel recipiente utilizzando forbici chirurgiche Iris.
4. Per l'arteria carotica, inserire un catetere pre-arrossato (15 – 17 G) nell'arteria carotica di destra caudalmente verso l'arco aortico per monitoraggio della pressione arteriosa e il prelievo di sangue.
   1. Usare la fascetta prossimale per legare l'arteria completamente.
   2. Ripetere i passaggi 6.3.2 - 6.3.3.
   3. Inserire il catetere arterioso carotideo pre-arrossato e utilizzare la sutura Seta distale per legare attorno l'arteria e il catetere con 3 nodi.
5. Utilizzare una tecnica simile, per inserire un catetere pre-arrossato (14 – 16 G) nella vena giugulare, ripetere i passaggi 6.3.2–6.3.3, anticipo 7 – 10 cm caudalmente per riposare all'interno l'ingresso toracico (verso l'atrio di destra). Questo è utilizzato per la somministrazione di fluidi e farmaci, nonché la misurazione della pressione venosa.
   1. Controllare il catetere per l'evidenza con soluzione fisiologica eparinizzata e quindi completare la cravatta di sutura attorno alla nave e catetere (con la sutura prossimale solo) usando 2-3 nodi.
   2. Inserire il catetere secondo (14 – 16 G) circa 5cm rostralmente per raccogliere il sangue dalla circolazione cerebrale. Utilizzare lo stesso taglio per il posizionamento di entrambi i cateteri.
   3. Ripetere il passaggio 6.5.1 per quanto concerne la sutura distale e il catetere e poi legare le suture seta intorno le linee avversarie di catetere per fissarli in atto per prevenire la torsione.
6. Estendere l'incisione precedentemente fatta in una forma a T (1-2 cm) sul lato sinistro.
   1. Elevare l'arteria carotide sinistra utilizzando aperti curvi emostatiche.
   2. Inserire una sonda di flusso 2mm perivascolare intorno alla nave per misurare il flusso di sangue.
   3. Coprire la sonda di flusso con un manicotto di polimero flessibile di 1 cm per stabilizzare la sonda in posizione.
   4. Posizionare la linea di cavo sonda di flusso nell'incisione a forma di T, permettendo il cavo eseguire in parallelo con la nave.
   5. Chiudere l'incisione cutanea. Legare intorno al cavo e intorno un anello del cavo, per evitare di limitare il flusso, se tirato.

7. grande vascello strumentazione

1. Estrarre l'agnello fetale per esporre il petto e coprire la pelle esposta con pellicola di polietilene per evitare perdite di calore.
2. Mettere l'agnello in decubito laterale di destra.
3. Posizionare l'arto anteriore sinistro intorno al collo per esporre il sito chirurgico.
4. Infiltrarsi in 3 mL di bupivacaina cloridrato (0,25%) lungo i 4^th v spazio intercostale e fare un'incisione della pelle di 6 cm utilizzando il cauterio.
   1. Attentamente trafiggere il muscolo intercostale con pinzetta smussata, cerchio sotto la costola 3^rd e nascono tra il successivo spazio intercostale. Assicurarsi di non ferire il polmone o il cuore.
   2. Aprire il morsetto per un pezzo di seta 0 pre-tagliato e portarlo per circondare la nervatura.
   3. Ripetere i passaggi 7.4.1–7.4.2 per proteggere la sutura sotto il 4^th costola.
   4. Fissare i lacci intorno ogni nervatura. Delicatamente tirare verso l'alto e inserire un applicatore con punta di cotone petto sotto il 4 spazio intercostale di^th .
   5. Utilizzare il bastoncino per proteggere il contenuto di petto mentre usando il cauterio per aprire lo spazio intercostale in 1 cm per un'apertura finale di 6-8 cm. Accertarsi che il polmone non è catturato nei legami della nervatura.
   6. Posizionare un divaricatore nel petto-apertura. Il petto di apertura rivelerà i lobi superiori sinistro del polmone, l'arteria polmonare principale (PA) e il arteriosus di ductus.
5. Utilizzare 2 x 2 pollici garze per avvolgere il polmone e spingere delicatamente qualsiasi tessuto esposto dalla zona chirurgica.
   1. Utilizzare un piccolo divaricatore manuale per migliorare il campo visivo (se necessario).
   2. Posto un nastro ombelicale (1/4 pollici di larghezza, lunghezza 6 pollici) pre-impregnati in amnios intorno ai grandi vasi. Ammollo il nastro ombelicale diminuisce l'attrito (e pregiudizio) sulle pareti del vaso.
6. Usando il forcipe, sollevare il pericardio e tagliare lungo l'arteria polmonare principale, facendo attenzione a non per tagliare il nervo vagale. Utilizzare un bastoncino per mantenere l'atrio di destra di interferire con un taglio laterale del pericardio lungo il nervo vagale.
7. Usando il forcipe di Gemini, spostare il forcipe lentamente dalla tacca ductal/PA intorno e dietro il PA sinistro per "circondare" ed emergere sul lato opposto dell'AP sinistro. Molti tessuti delicati eseguito in quest'area e procedere solo se non c'è alcuna resistenza.
   1. Quando la punta della pinza è osservata, aprire quanto basta per afferrare un'estremità del nastro ombelicale pre-umidificata. Morsetto con solo 1 posizione cliccato in luogo. È possibile che tessuto circostante potrebbe essere intercettato nel forcipe troppo, e se strettamente bloccato quel tessuto potrebbe essere catturato con il nastro ombelicale con conseguente lesione del vaso.
   2. Delicatamente indietro il forcipe per tirare il nastro nella posizione. Questo serve ad aprire uno spazio per la sonda di flusso e aiuta a dirigere l'inserimento delle sonde di flusso (Figura 2). Cura di proteggere la tacca porzione di ogni nave è di importanza fondamentale come questa è la parte più fragile del tessuto.
8. Inserire una sonda di flusso 4 – 6 mm perivascolare delicatamente sollevando il nastro ombelicale e guidare la parte metallica (staffa a L) della sonda intorno al vaso lungo l'apertura stabilito.
   1. Diretto il nastro verso il retro della sonda per aiutare la nave nel luogo di seduta e di visualizzare alla fine della L-staffa permettendo la chiusura scorrevole deve essere assicurato.
   2. Assicurarsi che il vaso è > 75% delle dimensioni sonda per assicurare un flusso stretto fit e preciso misurazioni.
   3. Accuratamente tagliare l'estremità del nastro ombelicale vicino la sonda e tirare delicatamente l'altra estremità per rimuovere il nastro dalla nave. Il nastro interferirà con misure se non vengono rimossi.
   4. Applicare il gel per ultrasuoni e regolare la posizione di sonda e cavo per migliorare la qualità e l'intensità del segnale.
9. Ripetere i passaggi da 7,6 – 7.7.4 per quanto concerne il posizionamento di un 6-8 mm perivascolare-sonda di flusso intorno il arteriosus di ductus.
10. Rimuovere qualsiasi garza 2 x 2 protettivo dal petto e consentire il polmone riposizionare.
11. Posto una nuova 2x2 garza intorno ogni staffa metallica della sonda flusso per proteggere il polmone.
12. Vicino al petto in strati usando un ago conico e 2.0 sutura monofilamento sintetico. Fissare i cavi delle sonde-flusso per la pelle esterna con un ciclo utilizzando un ago di taglio e sutura seta 2.0.

8. misura non-invasiva

1. Collegare cavi di EKG presso il axilla di destra, axilla di sinistra e zona inguinale destra (tre derivazioni ECG). Saturazione ossiemoglobinica arteriosa pre- e post-duttale (SpO₂) viene monitorata con un ossimetro di impulso messo sulla zampa anteriore destra ed entrambi hindlimb, rispettivamente. Fissare un monitor spettroscopio vicino infrarosso (NIRS) sopra la fronte con suture e una medicazione opaca.

9. raccolta dei dati

1. Raccogliere e registrare i dati utilizzando un software di acquisizione dati. La figura 1 illustra invasivi e non invasiva parametri tra cui: sangue venoso arterioso e centrale di pressione, sinistra comune flusso di sangue arterioso carotideo, sinistra polmonare e duttali, ECG, SpO_2, NIRS, ETCO₂.
   Nota: Il set-up software e attrezzature per la raccolta dei dati può variare ed è oltre la portata di questo articolo.

10. sperimentale protocollo

1. Occludere e tagliare il cordone ombelicale e spostare l'agnello dall'addome materno in un riscaldatore radiante.
2. Durante il periodo di asphyxial, inserire un catetere venoso ombelicale per la somministrazione di epinefrina (0,01-0,03 mg/kg IV, al consigli NRP).
3. Inserire un catetere arterioso ombelicale per raccogliere i gas del sangue arterioso post-duttale.
4. Monitorare l'agnello per asistolia imminente, che può essere definita come l'assenza di pressione e flusso rilevato carotica.
5. Assicurarsi che adeguato personale è disponibile e dedicare ogni persona per le seguenti attività: (1) il gestore di ventilazione e le vie respiratorie, (2) eseguire le compressioni del torace, (3) somministrare i farmaci, (4) prelevare campioni di sangue, (5) portare il codice.
6. Iniziare la rianimazione fornendo ventilazione di pressione positiva (PPV) con un raccordo a T pallone rianimatore a pressioni di 35/5 cm H₂O. avviare il timer di 20 min per protocollo sperimentale di rianimazione.
7. Dopo 30 s di ventilazione, iniziare le compressioni toraciche mettendo il pollice e le dita di una mano sui lati opposti del torace.
   1. Fornire le compressioni toraciche comprimendo le dita e il pollice insieme ad una profondità di circa 1/3.
8. Somministrare adrenalina a intervalli di 3 minuti.
9. Continuare gli sforzi di rianimazione fino al ritorno di circolazione spontanea o fino a 20 min.
10. Al ritorno di circolazione spontanea, continui fluidi IV (5 cc/kg/hr) e fentanil (0,5-2,0 mcg/kg/hr; titolato a effetto), vengono rese attraverso il catetere venoso giugulare precedentemente stabilito. Successivamente al periodo di rianimazione di 20 min, l'animale è eutanasia. Se agnelli non realizzare ROSC con 20 min, procedere con l'eutanasia.

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Risultati

A seguito di strumentazione degli agnelli fetali, variabili emodinamiche possono essere registrate (Figura 3 e Figura 4), poi analizzato e interpretato (Figura 5). Possono essere raccolti campioni di sangue frequenti, e la figura 6 Mostra il pH e PaCO₂ dati da uno degli esperimenti. Occasionalmente, i cateteri o sonde di flusso potrebbero funzionare male o ott...

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Discussione

Il modello di agnello è paragonabile per dimensioni ai neonati umani e permette facili strumenti misurare le variabili emodinamiche invasive. Il modello di feto/neonato agnello è stato uno strumento prezioso di ricerca che riccamente ha contribuito alla comprensione della circolazione di transizione, come pure la fisiologia cardiovascolare e polmonare del neonato. Diversi modelli sperimentali di agnello sono stati istituiti nel corso degli anni per studiare strategie di ventilazione ottimale nel pretermine agnelli

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Babcock forceps	Miltex	16-44
Blood pressure transducer	Becton Dickinson	P23XL-1	Used with saline filled diaphragm domes
Blunt tipped scissors	Miltex	98SCS50-56
Capnograph	Philips	7900	Used with Neonatal Flow Sensors
Cautery pencil	Valley Lab	287879
Cautery unit	Valley Lab	SSE2K
Curved Forceps	Everost	711714
Data acquisition software	Biopac Systems Inc.	ACK100W
EKG	Biopac Systems Inc.	ECG100C
Endotracheal tube -cuffed	Rusch	111780035
Flow modulator	Transonic Systems Inc.	T403
Flow-probe	Transonic Systems Inc.	MC4PSS-LS-WC100-CM4B-GA
Gastric tube	Jorgensen Labs Inc.	J0106LE	To decompress and drain ewe stomach
Hair clipper	Andis Company	65340	# 40 Clipper Blade
Infant radiant warmer	GE healthcare	7810
Intravenous catheters	Becton Dickinson	381234
Iris surgical scissors	Patterson	510585
Kelly Foreceps	Patterson	510535
Mosquito Forceps	RICA Surgical Products INC	1-74
Near-infrared spectroscopy	Nonin Medical Inc.	X-100M	Sensmart Equanox & PureSAT
RSO2 Sensor	Nonin Medical Inc.	8004CB-NA	Neonatal
Scalpel handle and blade	Everost	707203
Sutures -silk 2-0	Covidien	SS-695	Used for tying catheters to vessels
Sutures -vicryl  2-0	Ethicon	J269H	Used for closing thoracotomy
T-piece resuscitator	Neo-Tee	MCM1050812
Umbilical ties	Jorgensen Labs Inc.	J0025UA
Weitlander Retractor	Miltex	11-625