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摘要

提出了一种具有不同杨氏模量或厚度的高分子薄膜复合结构的制造工艺规程。影片为先进的细胞培养研究或作为皮肤胶粘剂被生产。

摘要

在本协议中, 我们提出了制备薄弹性体复合膜的方法, 用于先进的细胞培养应用和皮肤胶粘剂的发展。两种不同的聚 (二甲基硅氧烷) (中和软皮肤胶粘剂 (SSA)), 已被用于深入调查的生物效应和胶粘剂的特点。复合膜由柔性支撑层和粘接顶涂层组成。这两个层都是由医生刀片应用技术制造的。在本研究中, 对复合膜的粘接性能进行了研究, 作为层厚度的函数或顶层杨氏模量的变化。通过改变基向交联剂混合比, 使其杨氏模量发生了变化。此外, SSA 薄膜的厚度从大约16µm 到大约320µm. 扫描电镜 (SEM) 和光学显微镜已被用于厚度测量。弹性体膜的粘结性能强烈依赖于薄膜厚度、聚合物杨氏模量和表面特性。因此, 研究了这些薄膜在表面光滑粗糙的玻璃基片上的正常附着力。脱扣应力和分离工作取决于有机硅弹性体的配比。

此外, 软皮肤胶粘剂的厚度放置在支持层的顶部已经变化, 以产生补丁皮肤应用。对 L929 小鼠成纤维细胞的细胞毒性、增殖和细胞黏附力进行了研究。我们在这里首次展示了两种聚合物制备的薄层复合薄膜的并排比较, 并对它们的生物和胶粘剂性能进行了研究。

引言

在该协议中, 提出了制备薄弹性体薄膜的详细方法。该技术广泛应用于薄层复合膜的生产中。在 polyethylenterephtalate (PET) 箔上进行了制造技术, 使这些薄膜能够在很大程度上得到后续生产。本协议的重点是对重复性的评估, 对复合膜的不同层的精确制造, 以及最终复合片的生物和粘附性能的测定。有机硅弹性体 (甲基) 广泛应用于生物医学技术, 包括皮肤胶粘剂的生产、微流体应用和其他研究领域1、2、3 ,4。最近, 一个新的子类, 即所谓的软皮肤胶粘剂 (SSAs) 已经被介绍, 特别是为温和的皮肤粘合和脱粘。

硅胶 ssa 是乙烯基功能弹性体, 不同于类似的聚合物, 没有加强二氧化硅5。类似于其他的, SSA 的杨氏模量可以通过调节交联器浓度或固化时间6,7,8来适应广泛的范围。硅弹性体杨氏模量的这种变化对材料的粘附性能有显著影响, 对9、10表面培养的原核和真核细胞也有深远的影响。,11. 在细胞生物学水平上, 它显示, 真核细胞在信号转导水平上响应, 以调制的基体弹性或厚度的表面9,10,12 ,13,14。因此, 广泛的兴趣在细胞培养应用的聚合物具有可调谐的机械性能存在。重要的是, 硅基弹性体的固有低表面能为真核细胞细胞培养提供了最佳条件。氧等离子体处理是一种应用广泛的技术, 可以暂时增加低表面能量, 从而提高其拉断强度, 减少分子表面吸附, 同时促进附着、扩散和真核细胞增殖15,16,17,18。

除材料性质外, 表面形貌显著影响细胞黏附力和两种材料之间的粘接作用19、20、21、22。表面粗糙度对两个表面的接触形成有若干影响: 接触面积的减少, 粗糙周围的高储能弹性能量, 以及对裂纹扩展的影响可以改变粘结强度23, 24。自粘膜对人体皮肤的粘附是一个新兴的应用领域,如伤口敷料, 心电图电极固定或其他可穿戴电子设备25,26,27, 28。为测量自粘胶在表面形貌方面的粘结性能, 不同粗糙度的玻璃基板可用于正常附着力测量8、21。在这里, 选择了两个玻璃基板来研究聚合物薄膜的粘结性能。首先, 以不同掺量比的10至1重零件的混合比为基材的复合膜。在第二个步骤中, 制备了一个胶粘剂 SSA 层, 其两个组分的重量相等, 并在支持的二甲基硅胶片上有不同的膜厚。

研究方案

警告: 使用前请查阅所有相关的材料安全数据表 (MSDS)。本议定书中使用的一些化学品具有刺激性、剧毒和/或致癌性。在处理这些化学品时, 请使用所有适当的安全措施。这包括使用工程 (化学柜) 和个人防护设备 (安全眼镜, 手套, 实验室大衣, 全长长裤和闭合脚趾鞋)。下列程序的一部分涉及动物细胞系的培养。因此, 请遵守具体的生物安全条例。化学和生物废物需要根据具体的国家和机构规则和建议加以处理。

1. 硅弹性薄膜复合结构的制备

  1. 聚合物的制备
    1. 在比值10:1 中制备1.1 克的二甲基硅烷, 混合1.0 克的复方 a 与0.1 克复合 B。
    2. 混合和 degase 前聚合物的速度搅拌机在 2350 rpm 下真空3分钟。
    3. 将复合 a 和复合 B 之间的质量比率改变为45:1 和70:1。准备类似于1.1.2 中描述的方法。
    4. 准备1克的软皮肤胶粘剂 (SSA) 的比例为50:50。因此, 混合0.5 克化合物 a 和0.5 克化合物 B, 如1.1.2 所述。
  2. 聚 (乙烯醇) (PVA) 包覆聚酯箔的制备
    1. 在水中加入聚乙烯醇, 用磁性搅拌器在一夜之间混合, 制备 18% (w/w) pva 溶液。将此解决方案存储在摄氏4摄氏度。
    2. 用刀片应用机制作15µm 有效厚度的薄膜, 使用100µm 缺口, 速度约2.0 毫米/秒。
    3. 将影片放在烤箱中95摄氏度, 15 分钟。
  3. 用刮刀技术制备10:1 混合比的支撑层
    1. 使用自动控制的医生刀片应用机器为薄膜的准备。
    2. 用100% 异丙醇清洗 PET 箔, 并将其放在医生刀片应用区域的表面。
    3. 将医生刀片放在箔顶部, 用微定位螺钉调整厚度。对于湿层的制造, 应用厚度为60µm, 100 µm, 200 µm 和500µm。
    4. 用注射器将步骤1.1 中制备的10:1 聚合物填充在医生刀片的库中。开始移动的刀片速度约2.0 毫米/秒。
    5. 从机器上取下10:1 涂层的 PET 膜, 将其放在烤箱中, 1 小时95摄氏度, 位于一个房间, 在40% 和65% 之间显示湿度。
    6. 用异丙醇和纸巾清洁医生刀片。
    7. 对所有要求的厚度重复此过程。
  4. 用刀片技术制备不同配比的聚硅烷顶层
    1. 用手术刀或剃刀刀片去除底层薄膜的长度两侧的薄条纹, 以允许在 PET 箔上放置和滑动医生刀片。
    2. 按照协议步骤1.3.3 到1.3.6。涂膜湿厚度为160µm。
    3. 重复这一过程, 生产两个独立的电影, 每一个与其他混合比的新一组的组件 (45:1 和 70:1)。在室温下贮存薄膜 (约22摄氏度, 湿度介于40和65% 之间), 以防止污染和灰尘。
  5. 不同厚度的 SSA 50:50 层薄复合膜的制备
    1. 按照步骤1.3 前的描述, 将10:1 电影作为支持层进行准备。
    2. 按照协议步骤1.4.1 和1.4.2 生成这些影片。使用 SSA 的混合比例为 50:50, 并制造一个膜的湿厚度为40µm。
    3. 重复该过程的额外湿厚度: 120 µm, 300 µm, 500 µm。

2. 使用不同表面粗糙度的基体进行正常粘接测量

  1. 不同表面粗糙度玻璃基片的制备与表征
    1. 使用2毫米直径的玻璃圆筒作为 ' 光滑的基体 '。
    2. 用玻璃切割机制造 "粗糙的衬底", 从磨砂的玻璃滑梯上将一件与有关 4x4 mm 的尺寸。使用研磨金刚石手垫获得约3毫米直径的圆形区域。
    3. 用 uv 胶水将玻璃连接到铝锥上, 在紫外线照射室中照射3分钟。
    4. 用光学显微镜确定基体表面的半径。根据公式 A = πr2计算面积。
    5. 确定粗糙度参数 ra和 rz (根据: DIN EN ISO 4287, ASME B46.1) 与手写笔轮廓。
    6. 在轮廓的样品台上贴上基体, 并将尖端 (钻石, 标准: 2 µm/) 与样品接触。
    7. 记录粗糙度剖面, 速度为0.3 毫米/秒, 长度为1毫米。
    8. 要分析表面形貌, 用手写笔轮廓测量一个精确 1 mm2的面积, 由相关软件操作。
      注意: 轮廓由外部计算机操作。当1毫米的位移在 x 方向到达时, 支架在 y 方向被转移0.001 毫米。记录在案。RS3 文件是导入 Surfcom 地图专家软件, 以创建3D 图像。
  2. 硅烷或 SSA 制造薄膜的正常粘附测量
    1. 使用剃刀刀片将 PET 箔上的胶片切成小块, 面积约为4.0 厘米2 , 然后将它们放在带有 UV 胶水的玻璃滑梯上。用 UV 光照射3分钟。
    2. 在样品架上安装高分子样品。
    3. 用乙醇轻轻地清洁基体表面, 用氮气干燥。
    4. 将玻璃基板安装到铝锥上, 再连接到负载单元。
    5. 使用 tiltable 表 (量角器), 通过调整靠近聚合膜的基底倾角来精确地对齐曲面。为了做到这一点, 把承印物手动与胶片接触。改变倾斜角度, 直到两个曲面的完全平行对齐, 由相机图像可视化, 得到。
      注意: 负载单元格连接到 tiltable 表。玻璃棱镜位于样品下面, 如图 4所示, 允许用两个摄像头可视化接触区域, 并使基板对聚合物薄膜进行对准。
    6. 将基板移动到聚合物薄膜表面, 直到达到13到5帕的预紧应力 (图 4)。
    7. 启动在 LabView 编写的定制程序软件包, 以控制所需的测量参数, 如保持时间和接近/撤回速度。保持时间 t保持为1秒, 方法和分离速度分别为30µm 和10µm/秒。
    8. 对三个独立制造的样品和每片表面的六个不同位置执行粘附测量。
  3. 关键机械因素的数据分析和计算: 拉应力和分离工作。
    1. 通过将记录figure-protocol-3152的力除以基底面积 A 来计算应力.
      figure-protocol-3249
    2. 确定拉断应力, 被描述为正常应力的最大值。
      figure-protocol-3352
    3. 通过将拉伸状态的起始位置减去0的位移Δs, 从试样位置结束, 完成了脱粘。将拉伸机制的开始定义为 s0 = 0。
      figure-protocol-3534
    4. 根据下面的公式, 按照系统符合性 C 更正采样位置的测量值:
      figure-protocol-3646
    5. 为了计算分离的工作, 将 s0和 s端之间的应力位移曲线进行积分。
      figure-protocol-3783
  4. 利用数学计算软件来源计算关键机械因素。
    1. 从源表中的单个粘附度量中导入记录的. dat 文件。记录的参数为时间、样本位置和力。在列 A (时间)、B (样本位置) 和 C (强制) 中插入这些参数。
    2. 为了确定空值, 在接触聚合物膜之前, 平均大约有20的测量值。命名此平均值 F偏移量并将其粘贴到 D 列中。
    3. 根据以下公式计算背景修正力 F *
      figure-protocol-4109
      并将此公式插入到 E 列中, 如下所示。
      figure-protocol-4202
    4. 将拉伸机制的开始定义为零位移,即s0 = 0。因此, 确定 s0并将其从 B 列中的位移中减去, 并将其保存在 F 列中:
      figure-protocol-4376
    5. 此外, 通过机器的符合性来更正样品位置。此更正在列 g 中执行. 将以下公式插入 g 列中
      figure-protocol-4503
    6. 计算下一列 H 中的应力。因此, 将力除以基底区域。插入以下公式
      figure-protocol-4619
      其中 A 是玻璃基体的表面区域在毫米2 (确定在 2.1)。
    7. 计算从应力和位移值的分离工作。因此, 沿 x 轴和沿 y 轴的应力绘制位移。将该图从 s0到 s端, 将 s末端定义为拉伸应力返回到零的位移, 即完全脱离发生。要集成图形, 请选择集成函数。将计算值添加到列 I 和 J 中。

3. 用扫描电子显微镜 (SEM) 和光学显微镜对薄膜进行表征

  1. 光学显微镜
    1. 用剃刀刀片将聚合物薄膜切成小块 (约0.25 厘米2), 并将其附着在玻璃滑梯的边缘。将玻璃滑动垂直放置在直立显微镜下, 测量胶片横断面的厚度。
      注: 使用20X 目标 (NA = 0.45, 理论分辨率为 800 nm 1.1 µm), 以测量大约≤20µm 的胶片厚度值。为影片厚度在范围20µm 50 µm 使用10X 目标 (NA = 0.30, 理论决议在800毫微米1.6 µm) 和为影片厚度≥50µm 使用5X 目标 (NA = 0.15, 理论决议在800毫微米3.3 µm)。
  2. 扫描电镜调查
    1. 切下 PET 箔, 并将约2厘米2的样品贴在玻璃滑轨上, 并将其垂直放置在样品架内的夹紧机构中, 其顶部表面低于支架的顶端。
    2. 选择加速度电压 10 kV, 背散射电子探测器 (BSD) 和低真空条件 (60 Pa)。
    3. 调整图像的焦点、放大倍数、亮度和对比度。
    4. 选择二十八年代的图像采集时间, 分辨率为 1024年 x 2048 像素。
    5. 从 SEM 上取下样品架。

4. 生物调查

  1. L929 细胞的常规细胞培养
    1. 用小鼠成纤维细胞系 L929 进行调查。培养细胞在伊罗戈罗斯威尔公园纪念学院 (RPMI) 1640 基底培养基, 补充10% 胎牛血清和青霉素和链霉素在37°c, 5% CO2在 T75 细胞培养烧瓶。通过细胞在大约70% 到80% 的汇合处。
    2. 对于细胞传代, 去除培养基的吸入和洗涤钙和镁游离磷酸盐缓冲 (DPBS) 在三十年代下层流内阁。之后孵化细胞与2毫升 Accutase, 酵素解答以蛋白水解和 collagenolytic 活动为5分钟在37°c, 5% CO2。
    3. 用相衬显微镜验证细胞培养瓶表面的脱离。
    4. 在烧瓶中加入8毫升含血清的培养基, 将细胞悬浮液转移到15毫升的反应管中。
    5. 从细胞悬浮液中抽取10µL 样品, 并与10µL 的台盼蓝混合。
    6. 用 Neubauer 室确定细胞数并计算细胞总数。
      注意: 台盼蓝是有毒的, 因此咨询 msds, 按照 msds 中规定的强制性程序, 必须穿戴适当的人身安全保护和在化学品柜下处理。收集废物用于化学废物沉积。
      注: 台盼蓝阳性细胞呈彩色蓝色, 显示非完整的细胞膜。
    7. 对于下一个段落, 培养 5 x 105细胞在一个新的无菌细胞培养瓶与10毫升新的培养基。为实验条件, 培养 3 x 105细胞在6个井板和 6 x 104个细胞在24个井板的每个井, 包含聚合物样品 (协议步骤 4.2)。
  2. 细胞培养实验用复合膜的制备。
    1. 将在协议步骤1.4 和1.5 中制造的所需尺寸的单片胶片从 PET 支撑层中制成, 用手术刀和将镊子放置在玻璃盖板的表面上, 显示直径为12毫米. 将样品放在油井的24井板。
    2. 对于细胞毒性测定和计数, 请勿从 PET 箔中取出胶片。切圆面积约9.4 厘米2, 整齐地装入6井板的单井, 从1.4 和1.5 生产的影片并且安置他们入细胞培养板材的井。
    3. 将高分子样品浸泡在去离子 H2O 上以≥30分钟。
      注: 聚合物样品可能被热处理灭菌。因此, 从细胞培养皿中除去所有含有样品的聚合物, 并将其放入玻璃培养皿内。灭菌在2.05 巴的高压釜中进行, 温度为121摄氏度时为20分钟。
  3. 聚合物等离子体处理
    1. 将附着在 PET 箔上的薄膜或在等离子装置的反应室内的圆形玻璃盖板上 (在4.2.1 中制造)。
    2. 关闭盖子和疏散, 直到 1.6 x 10-2毫巴的压力达到。
    3. 进行血浆治疗3分钟。
    4. 通风反应室和放置样品在24井或6井菜为进一步细胞培养调查。
    5. 使用一个量角器的水接触角测定样品。因此, 将注射器靠近聚合物表面, 使用软件包, 将3µL 的水放在表面上。用量角器软件计算静水接触角。
  4. 染色和显微术
    1. 按照步骤4.1.7 和文化中的描述, 在37摄氏度和 5% CO2处准备单元格. 3 d。
    2. 在固定前的三天内, 在原始的和等离子处理的胶片上捕获细胞的相对比图片。
    3. 准备 PBS 辅以 0.2% Triton-X-100。慢慢地将200µL 的溶液注入100毫升的 pbs (pbs t)。
    4. 准备一个4% 多聚甲醛/pbs 解决方案 (粉煤灰/pbs)。
      警告: 多聚甲醛是有毒的, 因此咨询 msds, 遵循在 msds 中描述的强制性程序, 并佩戴适当的人身安全保护和处理在一个化学品柜是必需的。
    5. 准备5% 的 BSA/PBS 解决方案。
    6. 在叶片流柜下吸入培养基。将 PBS 添加到井中以去除介质残留物。
    7. 将该板块转移到化学柜中, 用400µL 的粉煤灰/PBS 溶液在室温下更换 pbs 25 分钟。
    8. 从单井中取出粉煤灰/PBS 溶液, 用 PBS 仔细清洗四次。在每个洗涤步骤之间等待3分钟, 并收集化学废料处理的解决方案。直接使用盘子, 或储存在4摄氏度。
    9. 添加5% 牛血清白蛋白 (BSA)/PBS t 的水井和孵化60分钟的 RT, 以阻止不特异的结合点。
    10. 吸入溶液, 并用罗丹明共轭 Alexa-488 (1:160 稀释)/PBS T 溶液补充 0.2% Triton-X-100。
      警告: Phalloidin-488 是有毒的, 因此咨询 msds, 遵循在 msds 中描述的强制性程序, 并佩戴适当的人身安全保护和处理在一个化学品柜是必需的。
    11. 盖板与铝箔和孵化它为3小时在 RT 或隔夜在4摄氏度。
    12. 吸入溶液, 用 PBS 清洗三次。在每个洗涤步骤之间等待3分钟。收集化学废物处理的解决方案。
    13. 准备1µL 赫斯特染料 33342 (库存溶液1毫克/毫升) 的溶液。1:1000 稀释吸管1µL 赫斯特染料3334到1毫升的 PBS 和混合良好。添加300µL 的赫斯特染料33342溶液的水井和孵化10分钟在 RT 在黑暗中。
      注意: 赫斯特染料33342是一种 DNA 锂试剂, 因此有可能致突变, 因此咨询 msds, 遵循 msds 中描述的强制性程序, 并佩戴适当的人身安全保护和处理, 根据需要化学柜。
    14. 吸入溶液, 用 PBS 清洗样品四次。在每个洗涤步骤之间等待3分钟。收集化学废物处理的解决方案。
    15. 为嵌入, 小心地删除的影片从文化表面, 并把它们放在显微镜玻璃幻灯片。将20至40µL 水溶性嵌入介质添加到薄膜中, 并在顶部附加一个新的圆形玻璃盖板, 使用轻微的压力。
    16. 用荧光显微镜进行成像。照明所需的过滤器: Alexa-488 的激发最大值为 496 nm, 最大发射量发生在 519 nm。因此, 发射颜色为绿色。赫斯特染料 33342 trihydrochlorid 与 dna 复合, 其激发最大值为 355 nm, 最大 DNA 复发射发生在 465 nm。
  5. 细胞毒性测定及其数量的测定
    1. 在步骤4.3 中制备的6井板中生长的细胞和步骤4.1.7 中制备的细胞进行实验。培养细胞3天在37°c 和 5% CO2。对于正控制, 使用在细胞培养中生长的细胞, 处理过聚苯乙烯表面, 不含聚合膜。为背景确定 (阴性情况), 获得媒介从井没有细胞。
      注: 培养基也可取自培养在细胞培养的聚苯表面上的含孔细胞。
    2. 根据实验样品的数量标注15毫升管。
    3. 添加40µL 0.9% 海卫 X-100 包含 PBS 解决方案的积极控制和搅拌与1000µL 提示。等待约3分钟。
    4. 不去除附着于表面的细胞, 从所有样品中吸取培养基, 包括在4.5.3 中制备的样品, 并将培养基转移至15毫升管。添加3毫升的 DPBS-/-到单井, 并存储在层流柜下的板块, 以确定细胞数, 如4.5.9 所述。
    5. 离心机在 200 x g 3 分钟, 并删除1毫升的上清的乳酸脱氢酶活性测定。在层流柜下储存含有细胞和剩余介质的15毫升管。
    6. 为化验一个黑色96井板材以平底被使用。添加50µL 的 CytoTox-一试剂到50µL 的样品培养基和混合良好三十年代。
    7. 用铝箔盖住盘子, 在 RT 上贮存10分钟。
    8. 在每个井中添加25µL 的停止解, 并用荧光板读取器记录荧光强度。摇动盘十年代和检测荧光信号与激发波长的520毫微米和发射波长560毫微米。避免气泡。
    9. 对于细胞数的测定, 从4.5.4 中的培养板井中吸取 DPBS, 并将解决方案添加到包含协议步骤编号4.5.5 中所收集的上清液的15毫升反应管中。
    10. 离心15毫升反应管在 200 x g 3 分钟和吸入上清。加入0.5 毫升的胰蛋白酶/EDTA, 孵育10分钟37摄氏度。
    11. 加入2毫升的胰蛋白酶/EDTA 在该板块的水井和孵化约10分钟37摄氏度, 以分离细胞从聚合物薄膜。
    12. 细胞悬浮被转移到15毫升反应管从步数4.6.10。另外, 用含有培养基的血清大力冲洗盘子。
    13. 离心样品在 200 x g 3 分钟, 吸出上清, 并添加血清含培养基的管。
    14. 确定步骤4.1.5 和4.1.6 中所述的细胞数。

结果

在第一次试验中, 在 PET 薄膜上制作了不同厚度和恒定混合比的10:1 的薄膜 (图 1)。由于支撑层厚度对整个复合膜的刚度和处理性能有显著影响, 在最初的实验中, 13 2 µm 和 296-13 µm 之间的单片制作 (图 1)。众所周知, 在固化过程中聚合物薄膜的收缩发生。对于最薄的薄膜, 我们观察到在潮湿和固化的条件下, 78% 到3.1% 的差异。对于最厚的薄膜, 检测到 40.9% 2.6% 的收缩率 (图 1)。

对于本协议中提出的应用, 需要从 PET 箔中手动去除胶片。我们认识到, 特别是薄膜是难以处理的镊子, 并经常被销毁在此过程中。因此, 我们研究了薄聚 (乙烯醇) 涂层作为支撑层的影响。PVA 具有较高的刚度, 由于其在下游应用中的水溶性, 可以很容易地去除。所应用的聚乙烯醇涂层厚度约为17µm, 因此在这一层上涂覆的表面比没有 PVA 涂层的薄膜稍薄 (未显示数据)。我们认为, 特别关注处理性能, 只有最薄的薄膜需要一个支持 PVA 膜, 从 PET 箔去除。

为所有进一步实验选择了40µm 的有效膜厚度。对于复合膜的生产, 其混合比为10:1 到45:1 和 70:1, 并应用在先前聚合的这一薄膜的顶部与医生刀片技术 (图 2A)。除了10:1 的比例, 不同的薄膜可以清楚地区分光学显微镜与适当的精度。对于显微分析, 影片用手术刀切割并附着在玻璃滑梯的边缘。与支撑层的10:1 比相比, 顶层的高混合比在显微图像上看起来更加明亮 (图 2B)。此外, 扫描电子显微术用于图像样本放大约 860X (图 2C)。与10:1 比相比, 这两种在高掺量率下制造的二甲基硅烷薄膜之间的亮度有明显的差别。切削过程留下标记, 在 SEM 图片看见 (图 2B)。根据这些结果, 复合膜的平均总厚度为112µm 5.0 µm (图 2D)。

在进一步的实验中, 通过使用两种不同的玻璃基板, 测定了这些薄膜的粘附性能 (图 3)。"平滑基板" 拥有一个具有算术平均粗糙度 Ra的表面纹理, 其值为0.013 至0.0002 µm, 平均峰谷 rz为 0.12 @ 0.004 µm (图 3A)。衬底 2 (GS2, 被指定为粗糙) 显示粗糙度值为 0.338, 0.021 (ra) µm 和 2.055 @ 0.017 µm (rz) (图 3B)。以2.1.4 获得的平均半径为 "光滑" 衬底的表面积为3.2 毫米2 , 而对于 "粗糙" 衬底, 计算了 6.07 mm2的表面积。

通过这两种基体, 确定了不同薄膜的粘接性能。选择两个参数来描述薄膜的粘接性能: 拉断应力σ最大值和9月的分离工作。在整个粘结和脱粘过程中, 试样的位置 s 和正常的力 F 被记录下来。结果以应力位移曲线表示 (图 4)。

为了正确解释实验结果, 必须准确地将基体与聚合物薄膜表面对齐。另外, 为了纠正位移, 必须考虑测量装置的机械合规性。在测量过程中, 施加的力不仅在样品上, 而且在测试装置的其他部分也有作用。因此, 两个基板被压在玻璃滑块上, 压应力为 13 5 帕。为了测量合规性, 考虑了载荷曲线,即,当两个表面接触到到达精确预紧力的试样位置时, 力-位移曲线的一部分。曲线的倒数斜率等于机器合规性 C。C 的计算值为0.12 µm/锰。

在第一个不同混合比的实验胶片上进行了分析 (图 5)。对于复合膜, 其厚度和混合比的支持层, 制造的10:1 被保持恒定。顶层厚度也保持恒定, 值为65µm。最高的拉断应力为 109 27.6 帕是确定与光滑的玻璃基板上, 在10:1 膜 (图 5A)。混合比例的增加导致拉断应力减少到 76.7 17 帕45:1 混合比和 41.4 @ 17 帕为70:1 比率。与粗砺的玻璃基体22的拉断重音2.2 帕被确定了在10:1 影片。一般来说, 分离的工作是可比较的两个玻璃基板, e., 1.4, 0.6 J/米2在最薄的薄膜获得与光滑的基板和 1.84, 0.7 J/米2在最薄的薄膜获得与粗糙基板 (图 5B)。

接下来, 对皮肤应用和细胞培养应用的薄膜的生产进行了探索 (图 6)。SSA 50:50 已用于复合膜的顶层生产。在1:10 的混合比与厚度约40µm 已被用作支持层。与图 5所示的以前的实验相比, 顶层的厚度是不同的, 混合比保持不变 (图 6A)。SSA 之所以被选中, 是因为它在涉及附着于表面粗糙度高的表面, 特别是人体皮肤的应用中具有粘结性能, 使用了制造商推荐的混合比 50:505,8。人表皮具有较高的表面粗糙度。根据年龄和解剖区域一个平均表面粗糙度深度 (RZ) 在48µm 和71µm 之间被报告了29。安全和温和的皮肤粘连是重要的, 特殊性的敏感皮肤的新生儿或难以再生皮肤的老年人。不同的湿厚度范围从40µm, 120 µm, 300 µm 到500µm 被应用 (图 6A)。根据湿厚度, 复合薄膜的总厚度在51µm 和344µm 之间变化 (图 6B)。固化后, 该复合材料已附着在志愿者的手后 (图 6C)。不同的影片厚度在他们的适应物产清楚地显示区别对皮肤的粗糙度 (图 6C)。薄膜 (50 µm 和100µm 总厚度) 与较厚的薄膜 (220 µm 和340µm 总厚度) 相比, 对皮肤皱纹的适应率高。结果表明, 应用的刮刀技术可以精确地制作出具有广泛厚度的复合膜。

用这些复合薄膜进行粘附实验 (图 7)。根据 SSA 顶部膜的厚度, 我们观察到拉断应力随薄膜厚度的增加而减小。在平滑衬底上测量了 133 36.6 帕的最高拉拔力 (图 7A)。在最厚膜上, 用粗糙衬底获得了 18 4 帕的最低拉应力。有趣的是, 两种基质的比较显示, 在最薄的薄膜上有2.7 倍的差异 (图 7A)。随着膜厚的增加, 特别是在最厚的薄膜上, 没有显著的差异是可观测的 (图 7A)。与光滑的基体1.8 的分离的工作 0.8 J/m2在显示总厚度大约的影片被发现了. 100 µm, 其次是膜厚度依赖性下降 (220 µm 厚度: 1.6 @ 0.6 J/m2和330µm: 1.3 @ 0.4 J/m2(图 7B))。与粗糙衬底测量的分离工作一般与光滑衬底相比略低 (100 µm 厚度: 1.63 0.6 J/米2; 220 µm 厚度: 1.1 @ 0.6 j/m 2 和330µm : 1.0 @ 0.2 j/m2 (图7B)).

此外, 在测量过程中记录了脱离机制 (图 7C)。在最薄的薄膜上观察到小的空化现象, 而在较厚的薄膜上可见手指状裂纹的出现 (图 7C)。

测量是在电影制作后一个月内进行的。然而, 弹性薄膜的力学性能的稳定性和保存可能受到环境因素的影响, 包括温度和湿度。如协议步骤1.4.3 中所述, 薄膜已存储在室温下, 湿度为 40-65%。为了防止它们受到污染和灰尘, 这些薄膜在黑暗中储存在塑料培养皿中。为研究50:50 膜在制作后的长期稳定性、粘附量和厚度测定, 已进行约四月。贮存后, 对薄膜厚度、拉断应力和分离工作均无重大影响。例如, 由湿厚度为120µm ssa 的 ssa 复合膜的拉断应力和100µm 的湿厚度为 46.6, 6 帕和分离1627米/米592的工作在制造之后. 大约四月在制造业以后, 拉扯的压力 48.8 "5.4 人民军和分离的工作 1666年 @ 723 mJ/m2被确定了。此外, 在制造后不久, 这些薄膜的总厚度为 103.3 13.9 µm, 存储后 98.1 @ 9.1 µm。

在进一步的实验中, 10:1 和 SSA 50:50 复合膜的总厚度约105µm 已被用作细胞培养基质 (图 8)。在协议步骤1中制造的复合薄膜可以很容易地从 PET 箔上除去, 并在所需尺寸和几何形状上进行切割。此外, 当将薄膜粘附到刚性表面时, 例如玻璃, 多片显示不同杨氏模量的薄膜可以并排附着, 并可放置在细胞培养板的单个井中。薄膜可以直接附着在聚苯乙烯表面, 而无需额外的盖玻片。此外, 薄膜可以适应不同的表面和几何结构, 如管或环, 使进一步的研究无法实现与传统的细胞培养材料。在图 8所示的实验中, pet 箔上的复合膜被直接放置在细胞培养板上, 或从 pet 箔上取出, 放在玻璃盖上。在实验条件下, 对某些聚合物进行了空气等离子体处理, 以提高其自由表面能量。一般情况下, 在等离子处理前, 115°的水接触角约为, 并变得高度亲水性 (水接触角 < 30°) 后加工8。等离子处理使表面具有生物相容性, 促进真核细胞的附着。根据处理时间和强度, 聚合物表面发生了变化, 显示出较高的粗糙度, 也可能出现裂纹。治疗后立即进行疏水恢复过程。如协议步骤4.3.5 所述, 量角器用于确定静水接触角。因此, 在空气等离子体处理后, 已放置在 ddH2O 1 小时的聚合物随后进行了分析。等离子处理显著降低了水接触角 (2.2°: 117.0);SSA 原始: 127.9 5.6°;18.0 7.2°;SSA 血浆: 29.3 11.5°)。

适用于嵌入水中安装介质的样品。如果在任何时间点的样品需要再次删除, 标本可以放置在水中含有培养皿过夜。最后, 可以删除盖板以进行额外分析。

用相衬显微镜和荧光共轭 phalloidin-488 和赫斯特染料 33342 (图 8) 染色后, 测定了3天 L929 细胞在50:50 复合膜上的附着行为和形态。强烈推荐采用相衬显微镜进行图像采集, 特别是对未采用等离子处理的聚合物进行成像。由于细胞黏附力对这些聚合物表面单细胞或聚集容易地分离, 复杂化正确解释以后分析方法。

在原始聚合物上播种的细胞显示出不良的附着和细胞传播行为 (图 8A1 和 C1), 同时观察在等离子处理表面培养的细胞的汇合单层 (图 8B1 和 D1).细胞团聚体的形成和离地表的脱离在原始表面上更为明显。4% 多聚甲醛固定后肌动蛋白丝的可视化显示, 少量细胞迁移到细胞聚集体的外围, lamellipodia 突起的放射在原始的甲基化和 SSA 50:50 复合膜上 (图 8A2和 C2, 箭)。在比较高分子材料时, 不能观察到主要的质量差异。作为一个侧面说明, 在 SSA 50:50 中出现的细胞聚集量与该组相比似乎较少。此外, 附加到 SSA 50:50 表面上的骨料显得更加扁平 (图 8C1)。如预期的那样, 用空气等离子改善细胞附着和在两个表面上传播显著, 导致形成显着的 lamellipodia 突起和汇合单层 (图 8B2 和 8D2)。

3天的培养后, 乳酸脱氢酶的释放被用作确定细胞毒性作用的指标 (图 9A)。一般情况下, 乳酸脱氢酶水平可与两种高分子材料培养的细胞相媲美, 其毒性小于 5% (原始的: 2.8 ~ 2.0%; 原始 SSA 50:50: 4.5 @ 3.6%; 等离子治疗: 3.4 ~ 1.5%; 血浆治疗 SSA 50:50: 3.4 @ 1.6%)。这些结果与我们以前发表的研究中所提出的数据相比较, 重点是对两种弹性体的研究。8为进一步验证 LDH 检测结果, 进行了台盼蓝排除试验。此外, 还确定了整个细胞的数量以显示扩散活动的差异 (图 9B)。一般不到5% 台台盼蓝阳性细胞计数 (原始的: 2.4) 0.3%; 原始 SSA 50:50: 3.8 @ 2.5%; 等离子治疗: 0.74 @ 1.3% 等离子治疗 SSA 50:50: 0.95 @ 1.6%)。

figure-results-7435
图 1: 在聚 (乙烯醇) (PVA) 涂覆 PET 箔上制备塑料薄膜:在 PET 箔上, 采用不同厚度的异硅薄膜制造工艺, 以确定重现性和处理性能 (a)。在95°c (B) 固化后, 用光学显微镜分析了该薄膜的厚度。对 N=3 独立制作的薄膜进行了分析。从每部影片中选择了三个不同的位置, 分别对每个样本进行了切割和3个位置分析 (k=27)。误差线表示标准偏差。请单击此处查看此图的较大版本.

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图 2: 用不同配比配制的聚硅烷复合膜的制备:采用刮刀技术制作了不同配比的复合膜 (a 组分) 与二甲基硅烷交联剂 (组分 B)。顶层包括在比值 10:1 (a A: B), 45:1 和70:1 在先前固化的一组10:1 膜 (A) 的顶部。随后用光学显微镜 (B) 和扫描电镜 (C) 分析了95°c 厚度的复合膜的固化。采用光学显微镜 (D) 进行 N=3 独立实验。在每种独立制作的胶片上, 分别选取三个不同的位置, 并对每个样品的切口和3个位置进行分析 (k=27)。误差线表示标准偏差。请单击此处查看此图的较大版本.

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图 3: 用于粘附测量的两个基板的地形表面粗糙度的测定:对两种具有不同表面粗糙度的玻璃基板进行了表征。三维轮廓尺寸测量分析的表面上进行了 ' 平滑 ' 基体 GS (A1) 和 ' 粗糙 ' 基体 GR (B1)。在 A2 和 B2 中描述了相应的单行曲线。请单击此处查看此图的较大版本.

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图 4: 正常附着力测量原理:使用自定义生成设置来表征聚合物样品的粘附特性。测量设置在 (A) 中描述, 详细信息显示在 (B) 中。对于测量分析, 应根据应力时间曲线 (C) 确定应力。分离的工作由 s末端和 s0 (D) 之间的应力位移曲线的积分确定。请单击此处查看此图的较大版本.

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图 5: 对不同混合比的复合薄膜的粘附性能的测定:测量了在混合比10:1、45:1 和70:1 中, 采用聚硅烷生产的复合薄膜的拉断应力 (a) 和分离 (B) 的工作。分析中, 使用 r a = 0.338 µm 的 "平滑" 玻璃基板 (GS) 展示 ra = 0.013 µm 和一个 ' 粗糙 ' 玻璃基板 (GR)。对 N=3 独立制作的薄膜进行了分析。从每部影片中, 选择了两个片断, 并分析了每个样品的三个不同位置 (k=18)。误差线表示标准偏差。请单击此处查看此图的较大版本.

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图 6: 不同厚度的 SSA 复合膜的制备:SSA 50:50 被应用于先前固化的10:1 膜 (a) 之上。采用40到500µm 的不同湿厚度, 用光学显微镜 (B) 研究了固化后的厚度。影片的附件在志愿者手的后面显示影片以大约100µm (影片 #2) 的总厚度符合皮肤的粗糙度 (C)。单层厚度和复合薄膜的总厚度如图 6B所示。为分析 n=3 独立地被制造的样品用光学显微镜测量。从每部影片中选择了三个不同的位置, 分别对每个样本进行了切割和3个位置分析 (k=27)。误差线表示标准偏差。6C 中的缩放条描述约1厘米.请点击这里查看这个数字的大版本。

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图 7: 软皮肤胶粘剂复合膜粘合性能的测定:制作了作为顶层的 SSA 的薄复合膜和以10:1 为支撑层的基板。顶层厚度在50和330µm 之间变化. 分析了两种不同的玻璃基片所测量的复合薄膜的拉断应力 (a) 和分离工作 (B) ("平滑" 玻璃基板 (GS), 展示了 RA= 0.013 µm 和一个 ' 粗糙 ' 玻璃基板 (GR) 与 Ra = 0.338 µm)。分离机制的模范图片在C被形象化。对数据分析 n=3 独立制作的实验进行了分析。从每部影片中, 选择了两个片断, 并分析了每个样品的三个不同位置 (k=18)。误差线表示标准偏差。刻度条在7C 描绘0.5 毫米.请单击此处查看此图的较大版本。

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图 8: 薄膜培养的 L929 成纤维细胞的细胞形态学:L929 小鼠成纤维细胞的培养3天的薄膜, 从生产的硅烷 (A1, A2, B1, B2) 或 SSA (C1, C2, D1, D2)。为了提高表面的亲水性, 空气等离子处理 (B1, B2, D1, D2)。D1 和 D2 中的刻度条描绘了100µm.请单击此处查看此图的较大版本.

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图 9: 细胞毒性和细胞增殖的测定:为确定细胞毒性效应和细胞增殖, L929 细胞在10:1 和 SSA 50:50 复合膜上播种三天。乳酸脱氢酶 (ldh) 的释放是由 LDH 活性测定, 并揭示少于5% 的细胞毒性 (A)。在人工计数单个细胞与 Neubauer 室 (B) 后, 对培养期后的总细胞数进行评估。N=3 独立进行实验分析。误差线表示标准偏差。请单击此处查看此图的较大版本.

讨论

复合结构的设计使材料性能的简单调整, 如杨氏模量或试样的厚度。采用不同的硅胶弹性体30、31, 通过改变两组分的混合比或制造混合料, 可以有效地改变杨氏模量。所描述的方法并不局限于目前的研究中使用的, 但特别是胶粘剂的性能取决于所使用的特定类型。该协议中的一个关键步骤是复合薄膜的制造过程 (图 1)。结果表明, 薄膜厚度对不同基质 (包括皮肤) 的粘附性能有显著影响 (图 5和图 6)。除薄膜厚度外, 固化过程中的时间和温度影响材料性能32。因此, 需要对聚合物层厚度的参数进行仔细的调整和验证。

用两个不同表面粗糙度的玻璃基片对0.338 µm (图 3) 进行了常规力粘附测量, 对薄膜的粘接性能进行了分析。一般而言, 粗糙度对表面的附着力有显著影响, 特别是弹性材料33、34。玻璃的粗糙度可以很容易地由不同的粗糙度的砂纸研磨, 因此允许制造的衬底表现出更高的糙率值21。另外, 其他材料, 例如环氧树脂可以使用为基体15,35的生产。这可能是提出的协议的一个重要修改策略。例如, 如果需要提供不同表面自由能量的基板, 或者需要特定的地形。在此基础上, 用自定义的设置 (宏观粘附测量装置 (MAD,图 4) 分析了该薄膜的拉拔应力和分离工作。36压的光学对准是测量结果分析的关键步骤。因此, 倾斜角的调整需要与量角器, 尽可能精确。这可以达到足够的精度, 手动使基板接触到薄膜表面, 直到达到水平接触。

在当前协议中, 保持时间在一秒钟内保持不变 (图 5 和图 7)。特别是对弹性薄膜在粗糙衬底表面的粘接性能的研究, 保留时间的延长提供了额外的信息。例如, 增加了拉断应力, 增加了保持时间已报告8。除了在当前协议中进行的测量外, 还可以执行其他方法, 例如剥离测试, 允许对附着力性能进行更全面的调查37。

测定了不同膜厚的复合膜在软皮肤胶粘剂中的粘结性能 (图 7)。我们的结果与公布的数据一致, 表明薄膜厚度的降低导致拉断应力的增加,即衬底直径与膜厚度的比值, 增加38,39.根据这些结果和图 7中描述的数据, 我们得出的结论是, 复合薄膜的总厚度约为100µm (大约60µm 的 SSA 层的厚度适用于大约40µm 的一部以上的一片薄膜), 具有良好的附着力。roperties 在粗糙的表面上。

其次, 在原始复合膜和等离子处理复合膜上进行了与生物特性相关的实验 (图 8)。等离子处理硅弹性体是一种常用的, 多功能的技术, 以提高表面亲水性的性质和促进细胞附着和细胞传播40,41。有机硅是众所周知的低毒性和高 biostability, 但可能含有残留单体或催化剂, 可能影响生理过程, 也导致细胞毒性42,43。在进行的实验中, 我们观察到的细胞毒性小于 5%, 以 LDH 释放为指标和台盼蓝排斥试验。在所提出的协议中, 对整个细胞群, 包括从表面分离出来的细胞团聚体进行了分析, 以进行扩散分析 (图 9B)。对议定书的修改可以产生更有差别的结果。对于每个样品, 含有分离细胞集料的上清液可以转移到一个单独的反应管, 而不与酶从聚合物表面移除的细胞结合。这将允许对附着在表面的细胞进行精确的评估, 并最终揭示出聚合物对细胞黏附过程的影响的更详细的测定。除了这里提出的免疫细胞化学方法外, 还可以利用应用免疫印迹的方法来采集干细胞, 从而对蛋白质表达进行详细的定量评估。

总之, 我们已经建立了生产条件的薄弹性复合膜的应用, 在先进的细胞培养研究。此外, 这些薄膜具有很高的适应性, 皮肤粗糙度, 使复杂的皮肤胶粘剂设计。

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

马丁 Danner 在准备样品和建立细胞培养程序方面得到了认可。作者要感谢 Biesterfeld Spezialchemie GmbH (德国汉堡), 特别是罗伯特 Radsziwill 为连续的支持和讨论。导致这些结果的研究得到了欧洲研究理事会根据欧洲联盟第七框架方案 (FP/2007-2013)/紧急救济协定340929的资助。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
2-Propanol, 97%Stockmeier Chemie1000452610000Isopropanol
Abrasive diamnod hand padBohleMO 5007522Grit: 220
AccutaseCapricorn ScientificACC-1B
Albumin Fraktion VRoth0163.2BSA
Alexa Fluor 488 PhalloidinThermoFischer ScientificA12379highly toxic
AquamountPolysciences18606-20water soluble mounting medium
CytoTox-ONE Homogeneous Membrane Integrity AssayPromegaG7890
DPBS, without Ca2+, Mg2+ThermoFischer Scientific14190094
Fetal bovine serum goldGE Health Care Life ScienceA15-151FBS
Goniometer OCA35Dataphysicsfor the determination of the static water contact angle
Hoechst Dye 33342Sigma-AldrichB1155-100MGbisBenzimide H 33342 trihydrochloride, highly toxic
Microscope Axiovert 25ZeissMicroscope used for cell culture documentation
Microscope Eclipse LV100NDNikonMicroscope used for film thickness determination
Paraformaldehyde, aqueous solution 16%Electron Microscopy SciencesRT 15710electron microscopy grade
penicillin und streptomycin solutionSigma-AldrichP4333-100ML
Phenom XL Scanning Electron Microscope (SEM)Phenom
Poly-(vinyl alcohol) 4-88, MW 31000Sigma-Aldrich81381-1KGMowiol 4-88
Poly-dimethyl siloxanes, Sylgard 184Dow Corning(400)000108351397PDMS
RPMI 1640 basal mediumThermoFischer Scientific21875034
soft skin adhesive (SSA)Dow Corning(400)000108251792MG 7-9800 Soft Skin Adhesive (SSA)
speed mixer DAC 600.2 VAC-PHauschild
stylus profilomterZeissModel: SURFCOM 1500SD3
Tecan Infinite M200 proTecanfluorescence plate reader
Triton X 100Calbiochem648466
Trypan Blue solutionSigma-AldrichT8154-100MLhighly toxic
Trypsin/EDTA solutionPAN-BiotechP10-0235000.05% Trypsin, 0.02% EDTA in PBS
UV glueBohleBO MV76002medium viscosity

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