JoVE Logo
发表
联系我们

登录

需要订阅 JoVE 才能查看此. 登录或开始免费试用。

本文内容

  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

我们描述了一种新的方法, 通过尿道插管和电穿孔将 DNA 质粒传送到小鼠膀胱的尿囊细胞中,体内。为小鼠膀胱疾病模型的产生提供了一种快速便捷的方法。

摘要

基因工程鼠模型 (GEMMs) 是非常宝贵的, 揭示了新的生物洞察到人类疾病的启动和进展机制, 如癌症。转基因和条件敲除小鼠经常被用于基因过度表达或消融在特定组织或细胞类型的在体内。但是, 生成生殖鼠标模型可能会耗费大量时间和成本。最近在基因编辑技术方面的进展和通过病毒感染提供 DNA 质粒的可行性, 使许多器官的非生殖的本土小鼠癌症模型得以快速生成。膀胱是一个器官, 这是一个很困难的病毒载体进入, 由于存在的多糖层覆盖的 urothelium。在这里, 我们描述了一个新的方法开发的实验室, 以有效地交付 DNA 质粒到老鼠膀胱 urothelium体内。通过 pCAG-GFP dna 质粒的膀胱灌注和手术暴露膀胱的电穿孔, 表明该 dna 质粒可以具体地传递到膀胱尿失禁细胞中进行瞬态表达。本方法为小鼠膀胱内基因的过度表达和击倒提供了一种快速便捷的方法, 可用于构建膀胱癌及其他泌尿外科疾病的 GEMMs。

引言

基因工程小鼠模型 (GEMMs) 在扩大我们对动物发育、基因功能的体内以及疾病进展的机制1、2等方面发挥了重要作用。生殖 GEMMs 传统上以两种方式发展。首先是通过显微注入 DNA 质粒, 然后将受精卵移植到 pseudopregnant 雌性中, 建立转基因小鼠。二是胚胎干细胞的同源重组和合体的发展, 产生的敲出/敲鼠。特定组织或细胞类型中的基因有条件的剔除, 涉及多代培养和 flox 的基因基因工程等位基因的育种。整个过程可能是昂贵和耗时的, 特别是如果目标是针对多个基因组织-具体。最近, 基因编辑技术, 如聚簇定期 interspaced 短回文重复 (CRISPR) 已被应用于几个小鼠器官, 以诱导组织特异性基因改变的本土癌症建模3, 4,5,6,7或正确的疾病突变原位8,9。在这些研究中, gRNA 载体的传递通常是通过腺病毒或慢病毒载体感染的器官或水动力的尾静脉注射实现的。与传统的以液氧基小鼠模型相比, CRISPR 成分对肺和肝脏的相对容易传递, 大大提高了这些器官的肿瘤建模的方便性和效率。

膀胱 urothelium 是大多数膀胱肿瘤起源的地方。将 DNA 载体传送到膀胱 urothelium 进行癌症建模或基因治疗, 是由顶端尿道表面的多糖层阻碍的, 这对感染病毒的黏附是一个障碍10,11。一些预处理剂, 如 Syn3 和月桂-β d-maltoside 已被用来扰乱这一障碍和增强腺病毒感染效率12,13,14。腺相关病毒 (自动增值服务) 是否能有效地感染膀胱尚未报告。总的来说, 一种非病毒性的交付方法是可取的。在这里, 我们描述了一个新的方法在实验室开发的有效的 DNA 质粒交付给小鼠 urothelium 通过尿道插管和电穿孔。因为我们的方法不涉及化学预处理的多糖层或病毒生产, 它大大简化了 DNA 质粒的交付到小鼠膀胱 urothelium, 并应促进各种在体内研究膀胱疾病。

研究方案

这里描述的所有程序都是按照加州大学圣克鲁斯学院动物保育和使用委员会 (IACUC) 的指导方针和条例进行的。

1. 质粒和工具的制备

  1. 每个膀胱染, 准备至少20µL 的 DNA 质粒 (1 µg/µL)。
  2. 在1.5 毫升离心管中添加1µL 的台盼蓝到20µL 质粒溶液中。吸管搅拌良好。
  3. 高压釜所有手术器械, 用70% 乙醇消毒工作室。在执行以下步骤时, 经常用70% 乙醇喷雾手术器械和手套, 或使用玻璃珠灭菌器, 以保持灭菌条件。

2. 麻醉动物

  1. 使用表顶麻醉系统麻醉的动物与异氟醚。打开 O2油箱, 并将氧气流量计调整为1升/分钟。
  2. 在感应腔内放置一只成年雌性 C57BL/6J 老鼠。打开并调整异氟醚蒸发器为3% 的诱导。小鼠应在2分钟内麻醉, 在从诱导室取出小鼠的同时, 对丁丙诺啡镇痛 (0.1 毫克/千克) 进行先发制人镇痛。
    注意: 在这个协议中, 雌性老鼠被使用, 因为它们在尿道插管过程中更容易使用。该协议也适用于雄性小鼠, 但在执行步骤3时需要格外小心。
  3. 在动物的眼睛上涂抹眼药膏以防止干燥。将麻醉鼠标置于一个加热垫上, 其鼻子位于鼻锥中。转动空气回路开关让异氟醚通过鼻锥。
  4. 用胶带抑制头部和鼻锥。将异氟醚蒸发器调整为2% 以进行维护。
  5. 用胶带抑制四肢。执行脚趾捏测试, 以确保动物在深度麻醉, 然后剃去腹部区域。

3. 尿耗和膀胱冲洗

  1. 将润滑剂应用于导管 (24G, 长度为2.11 厘米, 外径为0.045 厘米), 并确保其外部表面完全覆盖。
  2. 将导管插入尿道开口处, 慢慢将其推至膀胱, 此时尿液应通过导管流出。轻轻按压腹部, 帮助尿液耗尽。
    1. 通过观察尿液自动流出, 检查导管是否正确插入膀胱。避免穿孔尿道和膀胱壁, 并在需要时多次涂抹润滑剂。
  3. 用吸管将尿液丢弃在废烧杯中。
  4. 吸管80µL 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS) 到导管的外端, 另一端仍在膀胱。小心地将1毫升注射器插入导管。轻轻推注射器, 将 PBS 注入膀胱。在导管中留一些 PBS 以避免在膀胱内产生气泡。
  5. 取出注射器等待 PBS 从膀胱排出。轻轻按压腹部, 疏散 PBS。
  6. 用吸管把导管中的 PBS 丢弃在废烧杯中。
  7. 重复 PBS 洗涤 (步骤 3.4-3.6) 两次。
    注意: 在这些洗涤步骤中, 必须轻轻地工作。血液中的导管或自动流出液的失败通常表明尿道被刺穿。避免引入气泡也很重要, 因为它们会降低电穿孔效率。

4. 质粒的交付

  1. 将70% 乙醇应用于小鼠腹部, 用手术刀做垂直切口1厘米, 打开膀胱上方的腹部皮肤。
  2. 将至少20µL 的质粒加台盼蓝溶液注入导管的外端, 并附上注射器。
  3. 将质粒溶液注入膀胱。如果膀胱变蓝, 注射就成功了。在导管中留一些液体, 以避免在膀胱内产生气泡。
  4. 用镊子抓住外尿道孔, 然后取出导管和注射器。用绳子拧紧外尿道孔。用绳子做两个循环, 然后系上两个结。
    注: 收紧尿道对防止质粒液体回流具有重要意义。
  5. 使用以下参数打开电穿孔发生器: 33V、50毫秒工作时间和950毫秒间隔时间。
  6. 用镊子握住膀胱, 用两个电极捏住膀胱。推脚踏板执行电穿孔。
    注: 电脉冲设置为每踏板推送后短间隔5次。鼠标在这个过程中可能会抽搐。多次推脚踏板可以提高分娩效率, 但是太多的电脉冲会破坏 urothelium 的组织完整性。
    1. 避免镊子和电极之间的任何接触, 因为这会产生火花。

5. 恢复

  1. 缝合腹部和皮肤开放与无菌手术缝合和夹子。把碘敷在伤口上。
  2. 从异氟醚系统中取出动物。治疗丁丙诺啡镇痛 (0.1 毫克/千克), 以减轻术后疼痛。
  3. 把动物放在暖气垫上, 在完全恢复后把它送回家庭笼子。每天至少检查一次动物, 以正常的流动性, 饮酒和喂养行为, 没有感染的迹象, 直到切口愈合, 然后删除剪辑。如果动物显示疼痛症状, 如减少梳理、增加攻击性和发声, 则管理随后注射丁丙诺啡止痛药。

结果

为了证明基因传递到膀胱 urothelium 的成功, 我们使用了 pCAG-GFP15质粒进行电穿孔。采用尿道注射20µL 质粒和台盼蓝溶液, 5 电脉冲。48小时后, 我们对小鼠膀胱进行解剖, 在解剖荧光显微镜下观察 gfp 荧光斑块, 而没有进行电穿孔的阴性对照膀胱则没有显示 GFP 信号 (图 1A)。当我们用角蛋白 (CK) 5、CK18 和 GFP 抗体对切片膀胱组织进行免疫荧...

讨论

电穿孔增强细胞膜通透性, 是基因 electrotransfer16的一项强大技术。通过电穿孔将基因传递到活体啮齿动物中, 在神经生物学领域经常使用17,18,19,20,21。它在许多其他机构中的潜在应用尚未得到广泛探讨。根据我们的知识, 我们这里描述的方法是第一个报告成功...

披露声明

作者声明没有相互竞争的兴趣。

致谢

我们感谢 Kendy 教授、悦张博士和他的帮助建立电穿孔系统。这项工作得到了圣克鲁斯癌症福利小组和 NIH 对 Z.A.W. 的赠款的支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
BD 1mL TB SyringeFisher148232E
BuprenorphineSigmaB9275-50MG
Dumont TweezersRoboz Surgical InstrRS-5005Treat with 70% ethanol before surgical use
ECM830 SQ Wave ElectroporatorHarvard Apparatus450052
Exel International Disposable Safelet I.V. CathetersFisher Scientific14-841-2124G, 2.11 cm length, 0.045 cm outer diameter
Extra Fine Micro Dissecting ScissorsRoboz Surgical InstrRS-5135Treat with 70% ethanol before surgical use
IsofluraneVet one501017
K&H Heated Resting Mat for Small Animals, 9 By 12 InchesAmazonn/aCover the heat mat with paper towels
Ophthalmic ointmentFisherNC0849514
PBS, pH7.4Life Technologies10010049
Pipet tips 200 µLUSA Scientific1111-0206
Pipet Tips, Universal Fit; 0.1 to 10 µLFisher02707438(CS)
PIPETMAN NEO P2GilsonF144561
PIPETMAN NEO P200NGilsonF144565
plasmid CAG-GFPAddgene16664
Platinum tweezertrode 5 mmHarvard Apparatus4504895 mm diameter
ScissorsRoboz Surgical InstrRS-5880Treat with 70% ethanol before surgical use
String cordAmazonn/aMandala Crafts 150D 210D 0.8mm 1mm leather sewing stitching flat waxed thread string cord
Tape, ScotchFisher19047257
Therio-gel Veterinary LubricantPBS animal health353-736
Trypan Blue StainLife Technologies15250061
V-1 Table top system anesthesiaVetEquip901806
Vicryl violet suture 18" FS-2 cutting 5-0FisherNC0578475
Walgreens Povidone Iodine 10%Walgreens953982
Wound clipFisher018045
Wound clip applierFisher01804

参考文献

  1. Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
  2. Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nat Rev Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).
  3. Maddalo, D., et al. In vivo engineering of oncogenic chromosomal rearrangements with the CRISPR/Cas9 system. Nature. 516 (7531), 423-427 (2014).
  4. Xue, W., et al. CRISPR-mediated direct mutation of cancer genes in the mouse liver. Nature. , (2014).
  5. Sanchez-Rivera, F. J., et al. Rapid modelling of cooperating genetic events in cancer through somatic genome editing. Nature. 516 (7531), 428-431 (2014).
  6. Romero, R., et al. Keap1 loss promotes Kras-driven lung cancer and results in dependence on glutaminolysis. Nat Med. 23 (11), 1362-1368 (2017).
  7. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  8. Yin, H., et al. Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nat Biotechnol. 32 (6), 551-553 (2014).
  9. Yang, Y., et al. A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice. Nat Biotechnol. 34 (3), 334-338 (2016).
  10. Negrete, H. O., Lavelle, J. P., Berg, J., Lewis, S. A., Zeidel, M. L. Permeability properties of the intact mammalian bladder epithelium. Am J Physiol. 271 (4 Pt 2), F886-F894 (1996).
  11. Lilly, J. D., Parsons, C. L. Bladder surface glycosaminoglycans is a human epithelial permeability barrier. Surg Gynecol Obstet. 171 (6), 493-496 (1990).
  12. Ramesh, N., et al. Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium. Mol Ther. 10 (4), 697-705 (2004).
  13. Yamashita, M., et al. Syn3 provides high levels of intravesical adenoviral-mediated gene transfer for gene therapy of genetically altered urothelium and superficial bladder cancer. Cancer Gene Ther. 9 (8), 687-691 (2002).
  14. Engler, H., et al. Ethanol improves adenovirus-mediated gene transfer and expression to the bladder epithelium of rodents. Urology. 53 (5), 1049-1053 (1999).
  15. Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. P Natl Acad Sci USA. 101 (1), 16-22 (2004).
  16. Yarmush, M. L., Golberg, A., Sersa, G., Kotnik, T., Miklavcic, D. Electroporation-based technologies for medicine: principles, applications, and challenges. Annu Rev Biomed Eng. 16, 295-320 (2014).
  17. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
  18. Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PLoS One. 3 (4), e1883 (2008).
  19. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
  20. Molotkov, D. A., Yukin, A. Y., Afzalov, R. A., Khiroug, L. S. Gene delivery to postnatal rat brain by non-ventricular plasmid injection and electroporation. J Vis Exp. (43), (2010).
  21. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. (6), e239 (2007).
  22. Follenzi, A., Santambrogio, L., Annoni, A. Immune responses to lentiviral vectors. Curr Gene Ther. 7 (5), 306-315 (2007).

转载和许可

请求许可使用此 JoVE 文章的文本或图形

请求许可

探索更多文章

135

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

政策

使用条款

隐私

联系我们

向图书馆推荐

JoVE 新闻简报

科研

教育

发表

图书馆员

关于 JoVE

版权所属 © 2025 MyJoVE 公司版权所有，本公司不涉及任何医疗业务和医疗服务。