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Resumo

Nós descrevemos um método novo para a entrega do plasmídeo de DNA em células uroteliais do rato bexiga na vivo através de cateterismo de uretra e eletroporação. Oferece uma maneira rápida e conveniente para gerar modelos de rato autóctone de doenças da bexiga.

Resumo

Modelos do rato geneticamente modificados (GEMMs) são extremamente valiosos em revelando romance biológicas insights sobre os mecanismos de iniciação e progressão de doenças como o câncer. Os ratos transgénicos e condicional nocaute foram usados frequentemente para superexpressão do gene ou ablação em tecidos específicos ou célula tipos em vivo. No entanto, gerar modelos de rato germline pode ser demorada e dispendiosa. Recentes avanços no gene edição de tecnologias e a viabilidade de entrega de plasmídeos de DNA por infecção viral permitiram a rápida geração de modelos de câncer não-germline autóctones do mouse para vários órgãos. A bexiga é um órgão que tem sido difícil para vetores virais acessar, devido à presença de uma camada de glicosaminoglicano cobrindo o Urotélio. Aqui, descrevemos um método novo desenvolvido em laboratório para entrega eficiente de plasmídeos de DNA no rato bexiga Urotélio em vivo. Através de instilação intravesical de plasmídeo de DNA pCAG-GFP e eletroporação de bexiga cirurgicamente exposta, nós mostramos que o plasmídeo de DNA pode ser entregues especificamente nas células uroteliais da bexiga para expressão transiente. Nosso método fornece uma maneira rápida e conveniente para superexpressão e nocaute de genes na bexiga do mouse e pode ser aplicado para a construção de GEMMs de câncer de bexiga e outras doenças urológicas.

Introdução

Modelos do rato geneticamente modificados (GEMMs) têm jogado um papel essencial em expandir o nosso conhecimento sobre o desenvolvimento animal, gene funções in vivoe mecanismos de progressão de doença1,2. GEMMs do germline tradicionalmente são desenvolvidos de duas maneiras. A primeira é a criação de ratos transgênicos por injeção pró-nuclear do plasmídeo de DNA seguido a transplantação de zigotos pseudopregnant mulheres. A outra é a geração de batida-para fora/TOC-em ratos por recombinação homóloga em células-tronco embrionárias e o desenvolvimento de quimeras. Nocaute condicional de genes num tipo específico de tecido ou célula de interesse envolve a criação de alelos geneticamente modificados com Cre e flox sites para várias gerações. Todo o processo pode ser caro e demorado, especialmente se o objetivo é atingir múltiplos genes tecido-especificamente. Recentemente, tecnologias de edição de gene como clusterizadas regularmente intercaladas curtas palíndromos repetições (CRISPR) foram aplicadas aos vários órgãos dos ratos para induzir alterações genéticas de tecido-específica para o cancro autóctone modelagem3, 4,5,6,7 ou doença correta mutações em situ8,9. Nesses estudos, a entrega dos vetores gRNA geralmente foi conseguida através de adenovírus ou particulas de Lentivirus infecção do órgão ou injeção de cauda-veia hidrodinâmica. A relativa facilidade de entrega dos componentes CRISPR para o pulmão e o fígado tem melhorado muito a conveniência e eficiência de câncer nesses órgãos em comparação com os modelos tradicionais de rato Cre-Lox com base de modelagem.

O bexiga Urotélio é onde a maioria dos tumores de bexiga são originários. A entrega dos vetores de DNA para a bexiga Urotélio para terapia de modelagem ou o gene do câncer é dificultada por uma camada de glicosaminoglicano na superfície apical urotelial, que age como uma barreira para a aderência do vírus infeccioso10,11. Vários agentes de pré-tratamento como Syn3 e o dodecil-β-d-maltoside tem sido utilizados para romper essa barreira e melhorar adenovírus infecção eficiência12,13,14. Se o vírus adeno-associado (AAVs) efetivamente podem infectar a bexiga não foi relatado. Em geral, um método de entrega com base não-virais seria desejável. Aqui, descrevemos um método inovador desenvolvido no laboratório para entrega eficiente do plasmídeo de DNA para o Urotélio rato através de cateterismo de uretra e eletroporação. Porque a nossa abordagem não implica pré-tratamento químico da camada glicosaminoglicano ou produção de vírus, significativamente simplifica a entrega de plasmídeos de DNA no rato Urotélio de bexiga e deve facilitar estudos em vivo doenças da bexiga.

Protocolo

Todos os procedimentos descritos aqui foram realizados em conformidade com as diretrizes e normas da institucionais Cuidado Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade da Califórnia em Santa Cruz.

1. plasmídeo e preparação de ferramentas

  1. Para cada bexiga transfect, preparar pelo menos 20 µ l de DNA do plasmídeo (1 µ g / µ l).
  2. Adicione 1 µ l de Trypan azul para a 20 µ l de solução de plasmídeo em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL. Pipeta para misturar bem.
  3. Autoclave cirúrgica todos os instrumentos e esterilizar a área de trabalho com 70% de etanol. Spray instrumentos cirúrgicos e luvas com etanol a 70% com frequência ou usar um esterilizador de grânulo de vidro ao executar as seguintes etapas para manter condições estéreis.

2. médico-Légal Animal

  1. Use um sistema de anestesia superior de tabela para anestesiar o animal com isoflurano. Ligue o tanque2 O e ajuste o medidor de fluxo de oxigênio para 1 L/min.
  2. Coloca um rato adulto de C57BL/6J feminino na câmara de indução. Ativar e ajustar o vaporizador de isoflurano para 3% para a indução. O mouse deve estar em anestesia dentro de 2 min. administrar analgésico de buprenorfina (0,1 mg/kg) por via subcutânea após a remoção do mouse da câmara de indução para analgesia preemptiva.
    Nota: No presente protocolo, ratos fêmeas são usados, porque são mais fáceis de trabalhar com durante cateterismo de uretra. O protocolo também funciona para ratos masculinos, mas um cuidado adicional é necessária ao executar a etapa 3.
  3. Aplica a pomada oftálmica nos olhos do animal para evitar ressecamento. Coloque o mouse anestesiado virado para cima sobre uma almofada de aquecimento com seu nariz do cone de nariz. Gire o interruptor de circuito de ar para soltar isoflurano através do cone de nariz.
  4. Conter a cabeça e o cone de nariz com fita adesiva. Ajuste o vaporizador de isoflurano para 2% para manutenção.
  5. Conter os membros com fita adesiva. Realize testes de dedo-pinch para certificar-se de que o animal está em anestesia profunda e em seguida, raspar a região abdominal.

3. urina depleção e lavagem da bexiga

  1. Aplique lubrificante ao cateter (24G, comprimento de 2,11 cm, diâmetro externo de 0,045 cm) e certifique-se de que sua superfície externa é totalmente coberto.
  2. Insira o cateter na abertura da uretra e lentamente empurre-os até atingir a bexiga, momento em que a urina deve fluir através do cateter. Pressione suavemente o abdômen para ajudar a depleção de urina.
    1. Verifique se o cateter é inserido corretamente a bexiga, observando a urina automática out-fluxo. Evitar a perfuração da parede da uretra e da bexiga e aplique o lubrificante várias vezes se necessário.
  3. Descarte a urina com uma pipeta para um copo de resíduos.
  4. Pipete 80 µ l de soro de tampão fosfato (PBS) para a extremidade externa do cateter, com a outra extremidade ainda na bexiga. Cuidadosamente, anexe uma seringa de 1 mL para o cateter. Empurre suavemente a seringa para injetar a PBS para a bexiga. Embora alguns PBS o cateter para evitar a criação de bolhas de ar na bexiga.
  5. Remova a seringa. Espere para PBS drenar para fora da bexiga. Pressione suavemente o abdômen para evacuar PBS.
  6. Descarte a PBS o cateter com uma pipeta para o copo de resíduos.
  7. Repita PBS lavagem (etapas 3.4-3.6) para mais duas vezes.
    Nota: É essencial trabalhar suavemente durante estas etapas de lavagem. Sangue no cateter ou falhas de automatic out-fluxo de líquido geralmente indica a uretra é perfurada através de. Também é importante evitar a introdução de bolhas de ar, como eles irão diminuir a eficiência de eletroporação.

4. plasmídeo entrega

  1. Aplicar o etanol a 70% no abdômen do mouse e usar um bisturi para fazer uma incisão vertical de 1 cm para abrir a pele abdominal acima da bexiga.
  2. Pipetar pelo menos 20 µ l de solução de azul de Trypan além de plasmídeo a extremidade externa do cateter e aplique a seringa.
  3. Injete a solução de plasmídeo da bexiga. Se a bexiga ficar azul, a injeção é bem sucedida. Deixe algum líquido no cateter para evitar a criação de bolhas de ar na bexiga.
  4. Pegue o orifício uretral externo usando uma pinça e em seguida, retire o cateter e a seringa. Use uma sequência de caracteres para apertar o orifício uretral externo. Faça dois loops com a sequência de caracteres e em seguida amarre com dois nós.
    Nota: Aperto do uretral é importante para prevenir o refluxo de líquido do plasmídeo.
  5. Liga o gerador de eletroporação com os seguintes parâmetros: 33V, 50 ms de tempo de trabalho e tempo de intervalo de ms 950.
  6. Segurar a bexiga com uma pinça e comprima a bexiga com dois eletrodos. Pressione o pedal para executar a eletroporação.
    Nota: Os impulsos elétricos são definidos para ocorrer 5 vezes com intervalos curtos após cada impulso pedal. O mouse pode contorcer-se neste processo. Empurrar o pedal mais uma vez que pode aumentar a eficiência de entrega, mas também muitos pulsos elétricos podem danificar a integridade do tecido do Urotélio.
    1. Evite qualquer contacto entre a pinça e os eletrodos, como isso irá gerar uma faísca.

5. recuperação

  1. Suture a abertura abdominal e pele com esterilizados para suturas cirúrgicas e clipes. Aplica iodo sobre o ferimento.
  2. Retire o animal do sistema de isoflurano. Administre analgésico buprenorfina (0,1 mg/kg) por via subcutânea para aliviar a dor pós-cirúrgica.
  3. Manter o animal sobre a almofada de aquecimento e devolvê-lo para a gaiola em casa depois da recuperação completa. Verifique se o animal pelo menos uma vez por dia para mobilidade normal, beber e alimentar comportamentos e sem sinais de infecção até que a incisão é curado e remova os grampos. Administre injeções subsequentes de buprenorfina analgésico se o animal exibe sintoma de dor, tais como reduzida aliciamento, aumento da agressividade e vocalização.

Resultados

Para demonstrar o sucesso da entrega do gene para a bexiga Urotélio, usamos o plasmídeo de15 pCAG-GFP para eletroporação. 20 µ l de solução de azul de Trypan e plasmídeo foi injetado através da uretra e 5 pulsos elétricos foram administrados. Após 48 h, nós dissecado a bexiga de rato e observadas manchas de fluorescência de GFP sob um microscópio de fluorescência de dissecação, Considerando que um negativo controlar a bexiga que não sofreu electro...

Discussão

Electroporation aumenta a permeabilidade da membrana celular e é uma tecnologia poderosa para gene electrotransfer16. Entrega do gene em roedores vivos por eletroporação tem sido frequentemente usada em neurobiologia campos17,18,19,20,21. Suas aplicações potenciais em muitos outros órgãos não tem sido exploradas extensivamente. ...

Divulgações

Os autores não declaram nenhum interesse de concorrente.

Agradecimentos

Agradecemos o Professor Chen Bin, Dr. Yue Zhang e Kendy Hoang para ajuda com a configuração do sistema de eletroporação. Este trabalho foi financiado por doações do grupo de benefício de câncer de Santa Cruz e NIH para Z.A.W.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
BD 1mL TB SyringeFisher148232E
BuprenorphineSigmaB9275-50MG
Dumont TweezersRoboz Surgical InstrRS-5005Treat with 70% ethanol before surgical use
ECM830 SQ Wave ElectroporatorHarvard Apparatus450052
Exel International Disposable Safelet I.V. CathetersFisher Scientific14-841-2124G, 2.11 cm length, 0.045 cm outer diameter
Extra Fine Micro Dissecting ScissorsRoboz Surgical InstrRS-5135Treat with 70% ethanol before surgical use
IsofluraneVet one501017
K&H Heated Resting Mat for Small Animals, 9 By 12 InchesAmazonn/aCover the heat mat with paper towels
Ophthalmic ointmentFisherNC0849514
PBS, pH7.4Life Technologies10010049
Pipet tips 200 µLUSA Scientific1111-0206
Pipet Tips, Universal Fit; 0.1 to 10 µLFisher02707438(CS)
PIPETMAN NEO P2GilsonF144561
PIPETMAN NEO P200NGilsonF144565
plasmid CAG-GFPAddgene16664
Platinum tweezertrode 5 mmHarvard Apparatus4504895 mm diameter
ScissorsRoboz Surgical InstrRS-5880Treat with 70% ethanol before surgical use
String cordAmazonn/aMandala Crafts 150D 210D 0.8mm 1mm leather sewing stitching flat waxed thread string cord
Tape, ScotchFisher19047257
Therio-gel Veterinary LubricantPBS animal health353-736
Trypan Blue StainLife Technologies15250061
V-1 Table top system anesthesiaVetEquip901806
Vicryl violet suture 18" FS-2 cutting 5-0FisherNC0578475
Walgreens Povidone Iodine 10%Walgreens953982
Wound clipFisher018045
Wound clip applierFisher01804

Referências

  1. Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
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  5. Sanchez-Rivera, F. J., et al. Rapid modelling of cooperating genetic events in cancer through somatic genome editing. Nature. 516 (7531), 428-431 (2014).
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  7. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  8. Yin, H., et al. Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nat Biotechnol. 32 (6), 551-553 (2014).
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