Nouvelle méthode de livraison ADN plasmidique aux souris vessie urothélium par électroporation

Résumé

Nous décrivons une nouvelle méthode pour la livraison de plasmides d’ADN dans les cellules urothéliales de souris la vessie in vivo par cathétérisme de l’urètre et électroporation. Il offre un moyen rapide et pratique pour générer des modèles autochtones murins de maladies de la vessie.

Résumé

Modèles de souris génétiquement modifiées (edged) sont extrêmement précieux en révélant de nouveaux aperçus biologiques sur les mécanismes de déclenchement et la progression des maladies humaines comme le cancer. L’ablation des tissus spécifiques ou d’un cellule types in vivoou souris transgéniques et conditionnel ont été fréquemment utilisés pour la surexpression du gène. Cependant, la génération de modèles de souris de lignée germinale peut être lente et coûteuse. Des avancées récentes gène édition de technologies et la faisabilité de délivrer des plasmides d’ADN par infection virale ont permis la génération rapide des modèles de cancer de souris autochtone non germinale pour plusieurs organes. La vessie est un organe qui a été difficile pour les vecteurs viraux accéder, en raison de la présence d’une couche de glycosaminoglycanes couvrant l’urothélium. Nous décrivons ici une nouvelle méthode développée en laboratoire pour une prestation efficiente des plasmides d’ADN dans la souris vessie urothélium in vivo. L’instillation intravésicale de plasmides d’ADN pCAG-GFP et électroporation de vessie chirurgicalement exposée, nous montrons que le plasmide d’ADN peut être livré plus précisément dans les cellules urothéliales de vessie pour expression transitoire. Notre méthode fournit un moyen rapide et pratique pour la surexpression et inactivation de gènes dans la vessie de souris et peut être appliqué à la construction de négociants de cancer de la vessie et d’autres maladies urologiques.

Introduction

Modèles de souris génétiquement modifiées (edged) jouent un rôle essentiel dans l’expansion de nos connaissances sur le développement animal, fonctions gène in vivoet mécanismes de la progression de la maladie^1,2. Gregory de la lignée germinale sont traditionnellement développés de deux façons. La première est la création de souris transgéniques par injection pronucléaire de plasmides d’ADN suivie par la transplantation des zygotes dans les femelles pseudo-gravides. L’autre est la génération de souris knock-out/knock-in par recombinaison homologue dans les cellules souches embryonnaires et le développement des chimères. Masquage conditionnel des gènes chez le type spécifique de tissus ou de cellules d’intérêt consiste à l’élevage des allèles génétiquement avec Cre et flox sites depuis plusieurs générations. L’ensemble du processus peut être long et coûteux, surtout si l’objectif est de cibler des gènes multiples tissu-spécifique. Récemment, édition de gène des technologies telles que les répétitions de courtes palindromiques régulièrement dois‑je cluster (CRISPR) ont été appliquées à plusieurs organes des souris pour provoquer des altérations génétiques tissu-spécifique du cancer autochtone modélisation^{3, 4,5,6,7} ou maladie correcte des mutations in situ^8,9. Dans ces études, la livraison des vecteurs gRNA est habituellement réalisée par infection adénovirale ou des gènes de l’organe ou l’injection hydrodynamique de queue veineuse. La relative facilité de livraison des composants CRISPR pour le poumon et le foie a grandement amélioré la commodité et l’efficacité du cancer modélisation dans ces organes par rapport à des modèles de souris Cre-Lox basés traditionnels.

L’urothélium de vessie est d'où sont originaires la plupart des tumeurs de la vessie. La livraison des vecteurs d’ADN à l’urothélium vessie pour le traitement de modélisation ou de gène du cancer est entravée par une couche de glycosaminoglycanes sur la surface apicale urothéliales, qui agit comme une barrière pour l’adhérence des virus infectieux^10,11. Plusieurs agents de prétraitement tels que Syn3 et dodécyl-β-d-maltoside ont été utilisés pour perturber cette barrière et améliorer les adénovirus infection efficacité^12,13,14. Si les virus adéno-associés (AAVs) peuvent infecter efficacement la vessie n’a été signalé. Dans l’ensemble, une méthode de livraison basée non viraux serait souhaitable. Nous décrivons ici une nouvelle méthode développée en laboratoire pour la prestation efficace de plasmide d’ADN à l’urothélium de souris par cathétérisme de l’urètre et électroporation. Parce que notre approche n’implique pas de prétraitement chimique de la couche de glycosaminoglycanes ou la production de virus, il a considérablement simplifie la livraison de plasmides d’ADN à l’urothélium de vessie de souris et devrait faciliter diverses des études in vivo des maladies de la vessie.

Protocole

Toutes les procédures décrites ici ont été réalisées selon les directives et les règlements de l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université de Californie à Santa Cruz.

1. le plasmide et préparation des outils

1. Pour chaque vessie à transfecter, préparer au moins 20 µL de plasmides d’ADN (1 µg/µL).
2. Ajouter 1 µL de bleu Trypan dans les 20 µL de solution de plasmide dans un tube de microtubes de 1,5 mL. Pipette pour bien mélanger.
3. Autoclave tout surgical instruments et stériliser l’espace de travail avec l’éthanol à 70 %. Vaporiser les instruments chirurgicaux et des gants d’éthanol à 70 % fréquemment ou utiliser un stérilisateur de perle de verre lorsque vous effectuez les étapes suivantes pour maintenir des conditions stériles.

2. anesthésier l’Animal

1. Utilisent un système d’anesthésie top table à anesthésier l’animal à l’isoflurane. Le réservoir de₂ O et régler le débitmètre oxygène à 1 L/min.
2. Placez une souris de C57BL/6J femelle adulte dans la chambre de l’induction. Allumer et régler le vaporisateur isoflurane à 3 % pour l’induction. La souris doit être en anesthésie dans 2 min. administrer buprénorphine analgésique (0,1 mg/kg) par voie sous-cutanée après le retrait de la souris de la salle d’induction pour l’analgésie préventive.
   Remarque : Dans le présent protocole, les souris femelles sont utilisés, car ils sont plus faciles à manipuler au cours du cathétérisme de l’urètre. Le protocole fonctionne également pour les souris mâles, mais il faut redoubler de prudence lorsque vous effectuez l’étape 3.
3. Appliquer la pommade ophtalmique aux yeux de l’animal pour prévenir le dessèchement. Placez votre souris anesthésiée vers le haut sur un coussin chauffant avec son nez dans le cône de nez. Tournez l’interrupteur de circuit d’air pour laisser l’isoflurane passent par le cône de nez.
4. Retenir la tête et le cône de nez avec du ruban adhésif. Ajuster le vaporisateur isoflurane à 2 % pour l’entretien.
5. Retenir les branches avec du ruban adhésif. Effectuer des tests d’orteil-pincée pour s’assurer que l’animal soit en anesthésie profonde et ensuite se raser la zone abdominale.

3. urines appauvrissement et rinçage de vessie

1. Appliquer du lubrifiant sur le cathéter (24G, longueur de 2,11 cm, diamètre extérieur de 0,045 cm) et faire en sorte que sa surface extérieure est entièrement couvert.
2. Introduire le cathéter dans l’ouverture de l’urètre et pousser doucement jusqu'à ce qu’il atteigne la vessie, date à laquelle l’urine devrait sortir dans le cathéter. Appuyez doucement sur l’abdomen pour aider l’appauvrissement de l’urine.
   1. Vérifiez si le cathéter est correctement inséré dans la vessie par l’observation automatique urine hors-flux. Éviter la perforation de la paroi de l’urètre et la vessie et appliquer du lubrifiant plusieurs fois si nécessaire.
3. Jeter l’urine avec une pipette dans un bécher de déchets.
4. Pipetter 80 µL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans l’extrémité du cathéter, avec l’autre extrémité reste dans la vessie. Fixer attentivement une seringue de 1 mL au cathéter. Poussez doucement la seringue pour injecter le PBS dans la vessie. Laissez quelques PBS dans le cathéter pour éviter de créer des bulles d’air dans la vessie.
5. Retirer la seringue. Attendez que PBS s’écouler hors de la vessie. Appuyez doucement sur l’abdomen pour évacuer les PBS.
6. Jeter le PBS dans le cathéter avec une pipette dans le bécher de déchets.
7. Répétez les PBS de lavage (étapes 3,4-3,6) pour deux fois plus.
   Remarque : Il est indispensable de travailler doucement au cours de ces étapes de lavage. Sang dans le cathéter ou l’échec d’automatique hors-flux du liquide indique habituellement que l’urètre est transpercée. Il est également important d’éviter l’introduction de bulles d’air, puisqu’ils diminuerait l’efficacité de l’électroporation.

4. plasmide livraison

1. Appliquer l’éthanol à 70 % à l’abdomen de la souris et utiliser un scalpel pour pratiquer une incision verticale de 1 cm pour ouvrir la peau abdominale au-dessus de la vessie.
2. Pipetter, au moins 20 µL de solution de bleu de Trypan plus de plasmide dans l’extrémité du cathéter et connecter la seringue.
3. Injecter la solution de plasmide dans la vessie. Si la vessie devient bleue, l’injection est réussie. Laisser peu de liquide dans le cathéter pour éviter de créer des bulles d’air dans la vessie.
4. Prenez l’orifice urétral externe à l’aide de pinces à épiler et puis retirer le cathéter et la seringue. Utilisez une corde pour serrer l’orifice urétral externe. Faites deux boucles avec la chaîne et puis lier avec deux noeuds.
   Remarque : Resserrement de l’urètre est important pour empêcher le reflux du liquide de plasmide.
5. Mettre en marche le générateur d’électroporation avec les paramètres suivants : 33V, 50 ms de temps de travail et Mme 950 intervalle de temps.
6. Tenez la vessie avec des pincettes et pincer la vessie avec deux électrodes. Poussez la pédale pour effectuer l’électroporation.
   Remarque : Les impulsions électriques sont configurées produisant 5 fois à intervalles courts après chaque pédale poussoir. La souris peut se contracter dans ce processus. En poussant la pédale plusieurs fois peut accroître l’efficacité de la livraison, mais trop d’impulsions électriques peuvent endommager l’intégrité des tissus de l’urothélium.
   1. Évitez tout contact entre les pinces et les électrodes, car cela va générer une étincelle.

5. le recouvrement

1. L’ouverture abdominale et de la peau avec stériles pour sutures chirurgicales et agrafes de suture. Appliquer l’iode sur la plaie.
2. Enlever l’animal du système isoflurane. Administrer un analgésique de buprénorphine (0,1 mg/kg) par voie sous-cutanée pour soulager la douleur postopératoire.
3. Garder l’animal sur le coussin chauffant et renvoyez-le à la cage après récupération complète. Vérifier l’animal au moins une fois par jour pour la mobilité normale et d’abreuvement des comportements et aucun signe d’infection jusqu'à ce que l’incision est guérie et puis retirez les clips. Administrer les injections ultérieures de buprénorphine analgésique si l’animal affiche symptôme douleur tels que la diminution de toilettage, augmente l’agressivité et vocalisation.

Résultats

Pour démontrer le succès de la livraison de gène dans la vessie urothélium, nous avons utilisé le plasmide de¹⁵ pCAG-GFP électroporation. 20 µL de plasmides et de solution de bleu de Trypan est injecté à travers l’urètre et 5 impulsions électriques ont été administrées. Après 48 h, nous disséqué la vessie de souris et observé des patchs de fluorescence GFP sous le microscope de fluorescence de dissection, alors qu’un négatif contrôler la ves...

Discussion

Électroporation améliore la perméabilité de la membrane cellulaire et est une technologie puissante pour le gène Electrotransfert¹⁶. Livraison de gène dans la vie des rongeurs par électroporation a été fréquemment utilisé en neurobiologie champs^{17,18,19,20,21}. Ses applications potentielles dans de nombreux autres organes n’...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD 1mL TB Syringe	Fisher	148232E
Buprenorphine	Sigma	B9275-50MG
Dumont Tweezers	Roboz Surgical Instr	RS-5005	Treat with 70% ethanol before surgical use
ECM830 SQ Wave Electroporator	Harvard Apparatus	450052
Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters	Fisher Scientific	14-841-21	24G, 2.11 cm length, 0.045 cm outer diameter
Extra Fine Micro Dissecting Scissors	Roboz Surgical Instr	RS-5135	Treat with 70% ethanol before surgical use
Isoflurane	Vet one	501017
K&H Heated Resting Mat for Small Animals, 9 By 12 Inches	Amazon	n/a	Cover the heat mat with paper towels
Ophthalmic ointment	Fisher	NC0849514
PBS, pH7.4	Life Technologies	10010049
Pipet tips 200 µL	USA Scientific	1111-0206
Pipet Tips, Universal Fit; 0.1 to 10 µL	Fisher	02707438(CS)
PIPETMAN NEO P2	Gilson	F144561
PIPETMAN NEO P200N	Gilson	F144565
plasmid CAG-GFP	Addgene	16664
Platinum tweezertrode 5 mm	Harvard Apparatus	450489	5 mm diameter
Scissors	Roboz Surgical Instr	RS-5880	Treat with 70% ethanol before surgical use
String cord	Amazon	n/a	Mandala Crafts 150D 210D 0.8mm 1mm leather sewing stitching flat waxed thread string cord
Tape, Scotch	Fisher	19047257
Therio-gel Veterinary Lubricant	PBS animal health	353-736
Trypan Blue Stain	Life Technologies	15250061
V-1 Table top system anesthesia	VetEquip	901806
Vicryl violet suture 18" FS-2 cutting 5-0	Fisher	NC0578475
Walgreens Povidone Iodine 10%	Walgreens	953982
Wound clip	Fisher	018045
Wound clip applier	Fisher	01804