Nuovo metodo di consegna plasmide DNA Urothelium della vescica del Mouse mediante elettroporazione

Riepilogo

Descriviamo un metodo novello per la consegna del plasmide del DNA nelle cellule uroteliali del mouse della vescica in vivo tramite cateterizzazione dell'uretra e l'elettroporazione. Offre un modo veloce e conveniente per la generazione di modelli murini autoctoni di malattie di vescica.

Abstract

Modelli murini geneticamente (GEMM) sono estremamente utili nel rivelare nuove conoscenze biologiche sui meccanismi di iniziazione e progressione delle malattie umane come il cancro. Topi knock-out condizionale e transgenici sono stati usati frequentemente per la sovraespressione genica o tipi di ablazione in specifici tessuti o cellule in vivo. Tuttavia, la generazione di modelli murini di germline possono essere lunghe e costose. Gli avanzamenti recenti nel gene editing tecnologie e la fattibilità di erogare plasmidi di DNA tramite l'infezione virale hanno permesso la rapida generazione di modelli di germline non autoctono del topo del cancro per parecchi organi. La vescica è un organo che è stato difficile per vettori virali accedere, a causa della presenza di uno strato di glicosaminoglicani che copre l'urotelio. Qui, descriviamo un nuovo metodo sviluppato nel laboratorio per la distribuzione efficiente dei plasmidi di DNA nel mouse vescica urotelio in vivo. Tramite instillazione intravescicale di plasmide del DNA pCAG-GFP ed elettroporazione della vescica esposta chirurgicamente, indichiamo che il plasmide del DNA possa essere consegnato in particolare le cellule uroteliali della vescica per espressione transitoria. Il nostro metodo fornisce un modo veloce e conveniente per la sovraespressione e atterramento di geni nella vescica del mouse e può essere applicato alla costruzione di GEMM di cancro alla vescica e altre malattie urologiche.

Introduzione

Modelli murini geneticamente (GEMM) hanno giocato un ruolo essenziale ad ampliare la nostra conoscenza circa lo sviluppo animale, gene funzioni in vivoe meccanismi di malattia progressione^1,2. Germline GEMM sono tradizionalmente sviluppato in due modi. Il primo è la creazione di topi transgenici di pronuclei iniezione del plasmide DNA seguito da trapianto di zigoti in femmine pseudopregnant. L'altra è la generazione di topi knock-out/knock-in di ricombinazione omologa in cellule staminali embrionali e lo sviluppo delle chimere. Knockout condizionale di geni nel tipo specifico dei tessuti o cellule di interesse comporta l'allevamento degli alleli geneticamente ingegnerizzati con siti Cre e flox per più generazioni. L'intero processo può essere costoso e richiede tempo, soprattutto se l'obiettivo è di indirizzare i geni multipli del tessuto-specifico. Recentemente, la modifica del gene tecnologie quali cluster regolarmente intercapedine ripetizioni brevi palindromi (CRISPR) sono state applicate a parecchi organi dei topi per indurre le alterazioni genetiche tessuto-specifico per il cancro autoctono modellazione^{3, 4,5,6,7} o mutazioni della malattia corretta in situ^8,9. In questi studi, la consegna dei vettori gRNA solitamente è stata realizzata attraverso l'infezione adenoviral o lentivirale dell'organo o idrodinamico vena caudale iniezione. La relativa facilità di consegna dei componenti CRISPR il polmone ed il fegato ha notevolmente migliorato la comodità e l'efficienza di cancro in questi organi rispetto ai tradizionali modelli del mouse Cre-Lox basata di modellazione.

Il urothelium della vescica è dove la maggior parte dei tumori della vescica hanno origine. La consegna dei vettori di DNA per il urothelium della vescica per la terapia del gene o modellazione è ostacolata da uno strato di glicosaminoglicani sulla superficie apicale urothelial, che agisce come una barriera per l'aderenza di virus infettivi^10,11. Diversi agenti di pretrattamento come Syn3 e dodecil-β-d-maltoside sono stati utilizzati per interrompere questa barriera e usufruire dell'adenovirus infezione efficienza^12,13,14. Se il virus adeno-associato (AAVs) efficacemente può infettare la vescica non è stata segnalata. Nel complesso, un metodo di consegna di base non-virale sarebbe auspicabile. Qui, descriviamo un nuovo metodo sviluppato in laboratorio per consegna efficiente DNA del plasmide dell'urotelio del mouse tramite cateterizzazione dell'uretra e l'elettroporazione. Perché il nostro approccio non comporta pretrattamento chimico di strato di glicosaminoglicani o produzione di virus, significativamente semplifica la consegna dei plasmidi di DNA nell'urotelio vescica del mouse e dovrebbe facilitare vari studi in vivo di malattie di vescica.

Protocollo

Tutte le procedure qui descritte sono state eseguite in conformità con le linee guida e regolamenti istituzionali Animal Care e uso Committee (IACUC) della University of California Santa Cruz.

1. plasmide e preparazione di strumenti

1. Per ogni vescica a transfect, preparare almeno 20 µ l di plasmide del DNA (1 µ g / µ l).
2. Aggiungere 1 µ l di Trypan Blue il 20 µ l di soluzione di plasmide in una microcentrifuga da 1,5 mL. Pipetta per mescolare bene.
3. Autoclave tutti chirurgico strumenti e sterilizzare l'area di lavoro con etanolo al 70%. Spruzzare frequentemente gli strumenti chirurgici e guanti con etanolo al 70% o utilizzare uno sterilizzatore del branello di vetro quando si eseguono le seguenti operazioni per mantenere condizioni di sterilità.

2. anestetizzante animale

1. Utilizzare un sistema di anestesia top tavolo per anestetizzare l'animale con isoflurano. Girare sul serbatoio O₂ e regolare il flussometro ossigeno a 1 L/min.
2. Posto un topo C57BL/6J femmina adulto nella camera di induzione. Accendere e regolare il vaporizzatore di isoflurane al 3% per induzione. Il mouse dovrebbe essere in anestesia entro 2 min amministra buprenorfina analgesico (0,1 mg/kg) per via sottocutanea dopo la rimozione del mouse dalla camera di induzione per preemptive analgesia.
   Nota: Nel presente protocollo, i topi femminili sono usati, come sono più facili da lavorare con durante la cateterizzazione di uretra. Il protocollo funziona anche per topi maschi, ma prestare particolare attenzione è necessaria quando si esegue il passaggio 3.
3. Applicare unguento oftalmico agli occhi dell'animale per prevenire la secchezza. Posizionare il mouse anestetizzato rivolto verso l'alto su un rilievo di riscaldamento con il suo naso nel cono di naso. Girare l'interruttore del circuito di aria per lasciare isoflurano andare attraverso il cono di naso.
4. Trattenere la testa e il naso a cono con nastro adesivo. Regolare il vaporizzatore di isoflurane al 2% per la manutenzione.
5. Trattenere le membra con nastro adesivo. Eseguire test toe-pizzico per assicurarsi che l'animale è in anestesia profonda e quindi radere la zona addominale.

3. urina svuotamento e lavaggio della vescica

1. Applicare il lubrificante al catetere (24G, 2,11 cm di lunghezza, diametro esterno di 0,045 cm) e garantire che la sua superficie esterna è completamente coperto.
2. Inserire il catetere nell'uretra apertura e spingere lentamente fino a raggiungere la vescica, momento in cui l'urina dovrebbe defluire attraverso il catetere. Premere delicatamente l'addome per aiutare lo svuotamento dell'urina.
   1. Verifica se il catetere è inserito correttamente nella vescica osservando automatico urina fuori-flusso. Evitare piercing la parete della vescica e uretra e applicare il lubrificante più volte se necessario.
3. Scartare l'urina con una pipetta in un becher da rifiuti.
4. Pipettare 80 µ l di tampone fosfato salino (PBS) nell'estremità esterna del catetere, con l'altra estremità ancora nella vescica. Con attenzione è possibile collegare una siringa da 1 mL al catetere. Spingere delicatamente la siringa per iniettare il PBS nella vescica. Lasciare alcuni PBS del catetere per evitare di creare bolle d'aria nella vescica.
5. Rimuovere la siringa. Aspettare per la PBS drenare dalla vescica. Premere delicatamente l'addome per evacuare PBS.
6. Scartare il PBS del catetere con una pipetta nel contenitore dei rifiuti.
7. Ripetere PBS lavaggio (passaggi 3.4-3.6) per altre due volte.
   Nota: È fondamentale lavorare delicatamente durante queste fasi di lavaggio. Sangue nel catetere o il fallimento di automatico fuori-fluire del liquido indica in genere l'uretra è trafitto. È anche importante evitare di introdurre bolle d'aria, come essi potranno diminuire l'efficienza di elettroporazione.

4. plasmide consegna

1. Applicare etanolo al 70% all'addome del mouse e utilizzare un bisturi per praticare un'incisione verticale di 1 cm per aprire la pelle dell'addome sopra la vescica.
2. Pipettare almeno 20 µ l di plasmide plus soluzione tripan blu in estremità esterna del catetere e collegare la siringa.
3. Iniettare la soluzione di plasmide nella vescica. Se la vescica diventa blu, l'iniezione è successo. Lasciare un po' di liquido del catetere per evitare di creare bolle d'aria nella vescica.
4. Afferrare l'orifizio uretrale esterno con pinzette e quindi rimuovere il catetere e la siringa. Utilizzare una stringa per stringere l'orifizio uretra esterno. Fare due anelli con la stringa e poi legare con due nodi.
   Nota: Serraggio dell'uretrale è importante per impedire il riflusso del liquido del plasmide.
5. Accendere il generatore di elettroporazione con i seguenti parametri: 33V, 50 ms tempo di lavoro e 950 ms tempo di intervallo.
6. Tenere la vescica con una pinzetta e pizzicare la vescica con due elettrodi. Spingere il pedale per eseguire l'elettroporazione.
   Nota: Gli impulsi elettrici sono impostati a verificarsi 5 volte con brevi intervalli di tempo dopo ogni pressione del pedale. Il mouse può contrarsi in questo processo. Spingendo il pedale più di una volta può aumentare l'efficienza di consegna, ma anche molti impulsi elettrici possono danneggiare l'integrità del tessuto dell'urotelio.
   1. Evitare il contatto tra le pinzette e gli elettrodi, come questo genererà una scintilla.

5. il recupero

1. Suturare l'apertura addominale e pelle con sutura chirurgica sterile e clip. Applicare iodio sulla ferita.
2. Rimuovere l'animale dal sistema isoflurano. Amministrare la buprenorfina analgesico (0,1 mg/kg) per via sottocutanea per alleviare il dolore post-operatorio.
3. Tenere l'animale il termoforo e tornare alla gabbia a casa dopo il recupero completo. Controllare l'animale almeno una volta al giorno per la normale mobilità, abbeveraggio e alimentazione comportamenti e senza segni di infezione, fino a quando l'incisione è guarito e quindi rimuovere le clip. Se l'animale Visualizza il sintomo di dolore come ridotto toelettatura, aumentata aggressività e vocalizzazione, somministrare iniezioni successive di buprenorfina analgesico.

Risultati

Per dimostrare il successo di consegna del gene in urothelium della vescica, abbiamo usato il plasmide di¹⁵ pCAG-GFP per elettroporazione. 20 µ l di soluzione Trypan Blue e plasmide è stato iniettato attraverso l'uretra e 5 impulsi elettrici sono stati amministrati. Dopo 48 h, abbiamo dissecato la vescica del mouse e osservato le patch di fluorescenza di GFP sotto un microscopio di fluorescenza di dissezione, mentre un negativo di controllo della vescica che non ...

Discussione

Elettroporazione migliora la permeabilità della membrana cellulare ed è una potente tecnologia per gene electrotransfer¹⁶. Consegna del gene in roditori vivente mediante elettroporazione è stato frequentemente utilizzato in neurobiologia campi^{17,18,19,20,21}. Le sue potenziali applicazioni in molti altri organi non sono stati esplorat...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD 1mL TB Syringe	Fisher	148232E
Buprenorphine	Sigma	B9275-50MG
Dumont Tweezers	Roboz Surgical Instr	RS-5005	Treat with 70% ethanol before surgical use
ECM830 SQ Wave Electroporator	Harvard Apparatus	450052
Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters	Fisher Scientific	14-841-21	24G, 2.11 cm length, 0.045 cm outer diameter
Extra Fine Micro Dissecting Scissors	Roboz Surgical Instr	RS-5135	Treat with 70% ethanol before surgical use
Isoflurane	Vet one	501017
K&H Heated Resting Mat for Small Animals, 9 By 12 Inches	Amazon	n/a	Cover the heat mat with paper towels
Ophthalmic ointment	Fisher	NC0849514
PBS, pH7.4	Life Technologies	10010049
Pipet tips 200 µL	USA Scientific	1111-0206
Pipet Tips, Universal Fit; 0.1 to 10 µL	Fisher	02707438(CS)
PIPETMAN NEO P2	Gilson	F144561
PIPETMAN NEO P200N	Gilson	F144565
plasmid CAG-GFP	Addgene	16664
Platinum tweezertrode 5 mm	Harvard Apparatus	450489	5 mm diameter
Scissors	Roboz Surgical Instr	RS-5880	Treat with 70% ethanol before surgical use
String cord	Amazon	n/a	Mandala Crafts 150D 210D 0.8mm 1mm leather sewing stitching flat waxed thread string cord
Tape, Scotch	Fisher	19047257
Therio-gel Veterinary Lubricant	PBS animal health	353-736
Trypan Blue Stain	Life Technologies	15250061
V-1 Table top system anesthesia	VetEquip	901806
Vicryl violet suture 18" FS-2 cutting 5-0	Fisher	NC0578475
Walgreens Povidone Iodine 10%	Walgreens	953982
Wound clip	Fisher	018045
Wound clip applier	Fisher	01804