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摘要

以荧光蛋白为基础的方法来监测细菌分泌到宿主细胞中的效应, 这是很有挑战性的。这是由于荧光蛋白与 III. 型分泌系统之间的不相容。在这里, 一个优化的分裂 superfolder GFP 系统是用来可视化的效应, 细菌分泌的宿主植物细胞。

摘要

细菌是各种植物病害中最重要的致病因子之一, 它将一组效应蛋白分泌到宿主植物细胞中, 破坏植物的免疫系统。在感染期间细胞质效应通过 III. 型分泌系统 (T3SS) 传递给宿主细胞质。传递到植物细胞后, 效应器 (s) 靶向特定的隔间, 调节宿主细胞的过程以生存和复制病原体。虽然对宿主细胞中效应蛋白的亚型定位进行了研究, 以了解其在致病性中的作用, 利用荧光蛋白, 直接从细菌中注射的效应研究由于 T3SS 和荧光蛋白之间的不相容性而受到了挑战。

在这里, 我们描述了我们最近的方法, 优化分裂 superfolder 绿色荧光蛋白系统 (sfGFP选择), 以可视化的效应传递通过细菌 T3SS 在宿主细胞。通过 T3SS 分泌的 sfGFP 的 sfGFP11 (11th β链) 可以与特定的细胞器 (sfGFP1-10 可选(1-10 β链 sfGFP) 一起组装, 从而导致现场的荧光发射.该协议提供了一个程序, 以可视化重组 sfGFP 荧光信号的效应蛋白从假单胞菌野火在一个特定的细胞器在拟南芥和烟草 benthamiana植物。

引言

植物是一种无梗的有机体, 在整个生命周期中遇到许多入侵的病原体, 包括细菌、真菌、病毒、昆虫和线虫。在 phytopathogens 中, 革兰阴性细菌病原体, 如铜绿假单胞菌和青, 通过进入伤口或自然开口, 如气孔和具1, 感染寄主植物。为了成功地将寄主植物殖民化, 细菌病原体已经进化形成了各种致病因子2。当细菌侵入寄主植物时, 它们会注射一系列的毒力蛋白--被称为效应者--直接进入植物细胞, 以促进其致病性。这些效应抑制或调节植物先天免疫, 并操纵宿主细胞过程, 导致细菌生存3。

致病细菌主要使用 T3SS 将效应蛋白直接传递到宿主细胞中4。T3SS 类似于一个分子注射器, 其针状通道连接从支架蛋白结构横跨内部和外部细菌膜到宿主细胞的注射点5。这种 T3SS-mediated 效应器 (T3E) 分泌机制在植物的各种革兰氏阴性细菌病原体以及人类中都保存良好。一个代表性植物病原体,野火pv。西红柿DC3000 hrcC变种通常有缺陷的 T3SS, 限制了植物的生长, 可能是由于这个突变体无法完全抑制植物免疫 (通过注射效应蛋白)6。在转移到宿主细胞后, 效应靶针对宿主细胞系统中重要的各种宿主蛋白, 包括植物防御反应、基因转录、细胞死亡、蛋白酶体、囊泡贩运和激素通路7,8,9,10. 因此, 跟踪宿主细胞中效应蛋白的细胞定位是了解它们在调节植物免疫力方面的作用的一个很有吸引力的目标。

大多数 T3Es 的定位研究都采用了农杆菌-介导的大荧光蛋白在寄主植物9中的过度表达。然而, 其他物种引入的基因的异种表达方法已被证明是错误本地化的, 或者偶尔不起作用的11,12,13。此外, 一些研究显示, 细菌效应在宿主细胞中进行了适当的靶向定位14,15,16,17。因此, 瞬时表达的效应在植物细胞的细胞质可能不是功能上或数量相同的效应者, 由 T3SS 提供的病原体感染18。此外, 大荧光标记与效应蛋白的融合可能会扰乱适当的效应传递和可视化18,19。因此, 这些检测 T3E 功能的方法可能无法充分反映 T3SS-secreted 效应的本土化。

绿色荧光蛋白 (GFP) 由一个11股的β桶组成, 其中包含一个包括生色20的中心链。金都et报道了一个新的分裂-GFP 系统, 由一个小组成部分 (gfp β链 11;GFP11) 和一个大的互补片段 (GFP β链 1-10;GFP1-10)21。片段不荧光自己, 但荧光后, 他们的自我联想, 当两个片断是在密切接近。对于蛋白质折叠效率的优化, gfp 的鲁棒折叠变体,即, sfGFP 和 sfGFP选择, 随后为分割的 gfp 系统20,21,22而开发。最近, sfGFP1-10 可选-sfYFP1-10选择和 sfCFP1-10选择的单个氨基酸突变变种, 可以用 sfGFP11 片段进行重建, 并分别显示黄色和青色荧光, 生成23.此外, sfCherry 是 mCherry 的导数, 可以以与 sfGFP23相同的方式拆分为 sfCherry1-10 和 sfCherry11 片段。

该系统已经适应了标签和跟踪 T3SS 在 HeLa 细胞感染期间使用的效应器从沙门氏菌24.然而, 它以前未被优化为寄主植物细菌病原体系统。最近, 我们优化了基于改进的 sfGFP1-10 可选的分割 GFP 系统, 以监视从野火发送到植物单元25的 T3Es 的亚细胞定位。为了促进 T3Es 对不同亚细胞间的定位研究, 一组转基因的拟南芥植物在不同的亚细胞间隔内生成 sfGFP1-10 可选25. 此外, 携带各种细胞器靶向的 sfGFP1-10 的质粒选择用于农杆菌介导的瞬态过度表达和 T3SS-based 效应传递的 sfGFP11-tagged 向量也产生。各种转基因的拟南芥线和质粒来表达 T3Es 的种子, 可以从材料表26,27中提到的来源获得。

在下面的协议中, 我们描述了一个优化系统, 以监测由细菌在宿主细胞中使用分裂 sfGFP 系统传递的效应器的动力学。表达 sfGFP1-10选择的植物感染转基因假单胞菌携带重组 sfGFP11 质粒导致 sfGFP11-tagged 效应器从假单胞菌交付宿主细胞。因此, 这些蛋白质被重组, 并植物常常将到特定的效应靶室 (s)。假单胞野火pv。西红柿CUCPB5500 菌株, 其中18个效应被删除, 使用, 因为这种菌株显示低或没有细胞死亡, 在A. 南芥和N. benthamianas28。然而, 这里描述的所有材料和步骤可以被替换或修改, 以适应分裂 sfGFP 系统的调查其他生物问题或优化在给定的实验室条件。

研究方案

注: 所有步骤均在室温下执行, 除非另有说明。

1. 植物材料的制备 (4 周)

  1. 为benthamiana工厂准备
    1. 在每个花盆的土面上播种benthamiana的2种子, 用塑料圆顶覆盖托盘, 并允许种子在25摄氏度、60% 湿度生长室中发芽, 其温度为16/8 小时/暗光周期。
    2. 两周后, 挑选出并丢弃每壶中最小的幼苗, 并继续种植在相同的生长条件下, 在1.1.1 发芽的应用。每两天增加1升的水每托盘。
      注意: 植物的生长条件可能在实验室中有所不同。因此, 遵循常规浇水协议, 种植植物在一个健康的条件。
    3. 在一周内, 将植物转移到一个新的托盘, 并安排他们有足够的空间, 以进一步增长。在步骤1.1.1 中描述的条件下, 保持植物的生长, 直到它们准备在4周的年龄内渗入。
      注: 植物生长可能会因不同实验室的生长情况而异。通常, 我们发现, 4 周大的benthamiana植物大约有六叶。
  2. 对南芥转基因植物的制备
    1. 请参阅材料表并订购转基因的拟南芥种子。
    2. 在1毫升蒸馏水中浸泡 ~ 50-100 转基因的拟南芥种子, 并将它们贮存在4摄氏度, 在黑暗中保存3天, 以同步发芽的开始。
    3. 在插头厂托盘的土壤表面播种 2-3 种子, 用塑料圆顶盖上托盘。允许种子发芽23摄氏度, 60% 湿度, 10/14 小时光/暗周期。
      注: 种子应纯合体。然而, 我们建议重申的存在, 转基因在批。在这种情况下, 用70% 乙醇洗涤种子, 2 分钟, 50% 漂白剂 (约2% 次氯酸盐), 含 0.05% X-100 的5分钟. 跟随通过洗涤 5-6 次以无菌双重蒸馏水 (ddH2O)。灭菌后, 分层在4摄氏度3天, 并将其印在植物萌发培养基上, 含潮霉素 B 的25µg/升, 以选择转基因植物。
    4. 一周后, 每个插头只留一株植物, 并继续生长在相同的生长条件下, 用于步1.2.3 的植物。
      注: 四周大的植物用于野火感染。水植物每隔一天保持植物的健康。

2. 准备假单胞菌文化 (~ 1 周)

  1. 铜绿假单胞菌转化质粒的构建
    1. 请参阅材料表, 并订购 T3SS-based 效应传递系统向量25所需的向量。
    2. 使用站点特定的重组克隆25将感兴趣的效应基因插入效应传递向量中。
      注: 在监测全长效应蛋白的亚细胞定位时, 将全长基因 pBK-GW-1-2 或 pBG-GW-1-2。还可以选择含有 2x sfGFP11 的 pBK-GW-1-4 或 pBG-GW-1-4, 以增加荧光信号。对于缺乏信号肽的部分效应器, 使用 pBK-GW-2-2 或 pBK-GW-2-4。有关效应传递向量25的详细信息, 请参阅公园et .。
  2. 将带有效应器的质粒转换为野火pv, 并将其与 sfGFP11 标记融合在一起。西红柿(Pst)CUCPB5500 使用标准电穿孔29。
    注意: 如果需要, 可以使用其他铜绿假单胞菌。sfGFP11 标记系统是为范围很广的向量30构造的, 并且该效应器的基因表达式由 AvrRpm1 启动子来调节, 它与如假单胞菌荧光(伊桑)31之间的比较。
  3. 将转化后的细菌细胞轻轻地散布在含有100µg/毫升利福平和25µg/毫升卡那霉素或25µg/毫升庆大霉素的王 B 琼脂板表面。孵育28°c 2 天。
  4. 接种一个殖民地入国王的 B 液体媒介以适当为载体使用的抗生素, 并且在28°c 隔夜生长细胞与震动在200转每分钟。
  5. 做甘油的存货。将蒸压甘油添加到最终浓度为 50%, 并贮存在-80 摄氏度。

3. 在benthamiana (4 天) 中, 以细胞器为目标的 sfGFP1-10选择的瞬时表达式

  1. 农杆菌区域性的制备
    1. 订购所需的细胞器目标 sfGFP1-10 可选质粒 (参见材料表)。
    2. 将质粒转换成根癌农杆菌应变 GV3101 细胞32。在 Luria-Bertani (磅) 琼脂培养基上生长细胞, 辅以50µg/毫升卡那霉素和50µg/毫升利福平28摄氏度, 2 天。
    3. 从单一菌落的 LB 琼脂培养基, 接种细胞成5毫升的液体 LB 培养基补充50µg/毫升卡那霉素和50µg/毫升利福平。在28摄氏度的时候以200转每分钟的抖动来生长细胞。
    4. 以 3000 x g 为10分钟, 以离心的方法收割细胞, 然后从上清介质中并用重悬, 并在1毫升的新入渗缓冲液中注入颗粒。
    5. 通过获取 600 nm (Abs 600 nm) 的吸收光密度 (OD) 值来测量农杆菌的数量。将细菌的 OD600调整为 0.5, 并使用浸润缓冲。
      注: 1 毫升的悬浮液足以渗入两个斑点。
    6. 在 1-5 小时的渗透前, 在室温下将培养基留在一个柔和的摇杆上。
    7. 把一个洞戳进叶子的中心, 然后用10µL 的尖端渗入。使用1毫升无针注射器渗入农杆菌悬浮液。仔细和缓慢地注入约500µL 的悬浮液准备从步骤3.1.5 到叶正面通过注射器。重复对至少三种不同植物的渗透实验复制。
      注意: 出于健康和安全的原因, 在渗透过程中应佩戴眼部防护。
    8. 擦掉叶子上残留的细菌悬浮液, 标记浸润区域的边界。
    9. 保持渗透植物在相同的生长条件下, 用于步骤 1.1.1 2 天。

4. 接种假单胞菌(4 天)

  1. 将从步骤2.5 中的甘油库存中的已转换的铜绿假单胞菌与相应的抗生素在28摄氏度处连续2天进行条纹。
    注意:铜绿假单胞菌的健康非常关键。如果殖民地不形成好, 再次条纹细胞或传播的细胞在国王的液体媒体之前, 继续进行。
  2. 在28摄氏度的甘露醇-谷氨酸 (MG) 液体介质中接种一 loopful 的铜绿假单胞菌细胞, 一夜之间以200转每分钟的抖动。
  3. 以 3000 x g 为10分钟, 以离心的方法收割细胞. 倒入上清介质, 在10毫米氯化镁2中并用重悬颗粒, 并将 N . benthamiana 叶和 1 (10 x7 0.002) 的OD 600 调整为 0.02 (1 x10 6 cfu/毫升);cfu/mL) 为拟南芥留下.
  4. 对于benthamiana, 将铜绿假单胞内的悬浮液渗透到叶子的区域, 其中农杆菌携带 sfGFP1-10选择构造被渗透2天前 (如步骤 3.1.7)。对于 sfGFP1-10选择转基因拟南芥, 将假单胞菌的悬浮液渗透到两个4周长的短日生长的叶子中。
    注意: 实验复制需要至少三株植物。

5. 通过共聚焦显微镜观察 sfGFP 信号 (1 天)

  1. 从假单胞菌接种的叶子中剪下叶盘。在铜绿假单渗入后的特定时间点, 图像两个2厘米2叶盘从单一植物使用激光扫描共焦系统与 40 x/1.2 NA c 复消色差水浸泡目标或 63 x/0.8 na c-复消色差油浸泡目的。为了避免被伤致死的细胞, 观察细胞远离浸润孔。
  2. 开始观察在低功率设置的 488 nm 氩激光。增加激光功率以检测 sfGFP。
    注: 我们通常使用 2-15% 的激光强度来检测荧光信号。但是, 激光功率和检测设置应根据用户的显微系统进行调整。在这里, 发射过滤器被设置为 520-550 nm。死细胞通常在488纳米激光激发下发出自动荧光。因此, 作为一个负控制, 在相同的观测条件下, 没有 sfGFP11 标记的同样的效应器应该被渗透和观察。此外, 高激光激发能诱发叶绿素自发荧光。因此, 用控制植物细胞调节激光强度, 不诱导叶绿素自发荧光。
    1. 对于细胞壁的 counterstaining, 在观察前 5-10 分钟内浸润20毫米碘碘化物 (PI) 到叶盘中。
    2. 对于细胞核染色, 将叶盘浸入0.1% 多聚甲醛5分钟, 然后用水冲洗。然后, 在显微镜观察之前, 将10毫米 PI 渗透到叶盘中 5-10 分钟。重复实验至少三次。
      注意: 这一步并不重要, 但有助于定义在等离子膜或原子核上的效应器定位。如果感兴趣的效应器显示他们在特定的细胞器中的定位, 使用一个标记为给定的细胞, 以确认该效应器的本地化。

结果

GFP 的β桶结构由十一β链组成, 可分为两个片段, 1-10th链 (GFP1-10 可选) 和 11th (GFP11) 链。尽管两个碎片本身都不是荧光的, 但自组装 sfGFP 可以在接近接近度 (图 1A) 存在时发出荧光。在该系统中, sfGFP1-10 "选择"-表示拟南芥或N. benthamiana植物接种了假单胞菌携带一个 sfGFP11 标记的效应器。由铜绿假单?...

讨论

这里描述的协议用于监测细菌 T3SS 注射的效应蛋白在感染时对宿主植物细胞的准确定位。以前, 分离 GFP 系统被用来作为一个工具, 研究哺乳动物蛋白的亚细胞定位23,36,沙门氏菌T3E 本地化, 和农杆菌VirE2 交付通过 T4SS 到植物细胞37。为了在植物细胞中应用这个系统, 以前的研究使用了一种转基因玉米植株, 组成性表达 GFP1-10 ?...

披露声明

作者没有披露的利益冲突。

致谢

这项研究是通过由科学、信息和通信技术和未来规划部 (NRF-2018R1A2A1A05019892) 资助的韩国国家研究基金会 (NRF) 和植物分子育种中心的赠款来支持的。PMBC) 下一代 Biogreen 21 农村发展管理计划 (PJ013201) 向 EP。我们感谢国家环境管理仪器中心的成像中心, 为拍摄提供了共焦显微镜。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Arabidopsis transgenic linesPark, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10ABRCCS69831
NU-sfGFP1-10ABRCCS69832
PT-sfGFP1-10ABRCCS69833
MT-sfGFP1-10ABRCCS69834
PX-sfGFP1-10ABRCCS69835
ER-sfGFP1-10ABRCCS69836
GO-sfGFP1-10ABRCCS69837
PM-sfGFP1-10ABRCCS69838
Organelle-targeted sfGFP1-10OPT plasmidPark, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10Addgene97387
NU-sfGFP1-10Addgene97388
PT-sfGFP1-10Addgene97389
MT-sfGFP1-10Addgene97390
PX-sfGFP1-10Addgene97391
ER-sfGFP1-10Addgene97392
GO-sfGFP1-10Addgene97393
PM-sfGFP1-10Addgene97394
ER-sfCherry1-10Addgene97403
ER-sfYFP1-10Addgene97404
CYTO-sfCFP1-10Addgene97405
sfGFP11-tagged Gateway compatible vector for T3SS-based effector delivery systemPark, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)
pBK-GW-1-2Addgene98250pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBK-GW-1-4Addgene98251pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBK-GW-2-2Addgene98252pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBK-GW-2-4Addgene98253pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-1-2Addgene98254pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-1-4Addgene98255pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-2-2Addgene98256pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-2-4Addgene98257pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
Bacterial strains
Agrobacterium tumefaciens GV3101Csaba Koncz and Jeff Schell, The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Resistant to gentamycin (50 ug/ml) and rifampicin (50 ug/ml)
Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500Kvitko, B. H. et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Resistant to rifampicin (100 ug/ml)
Media components
Plant germination mediaAdd 2.165g/L Murashige & Skoog powder, 10 g/L sucrose to water. Adjust to pH 5.8 and add 2.2 g/L phytagel. Autocalve.
Murashige & Skoog medium including vitaminsDuchefa BiochemieM0222Store at 4 °C.
SucroseDuchefa BiochemieS0809
PhytagelSigma-AldrichP8169
LB mediaAdd 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L NaCl to water. For solid media, add 15 g/L micro agar. Autoclave.  Allow solution to cool to 55 °C, and add antibiotic if needed.
TryptoneBD Bioscience211705
Yeast extractBD Bioscience212750
NaClDuchefa BiochemieS0520
Micro agarDuchefa BiochemieM1002
King's B media10 g/L protease peptone #2, 1.5 g/L anhydrous K2HPO4, 15 g/L of agar to water. Autoclave. Cool down to 55 °C and add sterile 15 ml/L glycerol, 5 ml/L MgSO4 to the medium. Add antibiotics if needed.
Proteose peptoneBD Bioscience212120
Anhydrous K2HPO4Sigma-Aldrich1551128 USP
GlycerolDuchefa BiochemieG1345
MgSO4Sigma-AldrichM7506
Bacto AgarBD Bioscience214010
Mannitol-Glutamate (MG) liquid media Add 10 g/L of mannitol, 2 g/L of L-glutamic acid, 0.5 g/L of KH2PO4, 0.2 g/L of NaCl, and 0.2 g/L of MgSO4 to water. Adjust to pH 7
MannitolDuchefa BiochemieM0803
L-glutamic acidDuchefa BiochemieG0707
KH2PO4Sigma-AldrichNIST200B
Infiltration buffer10 mM MES (2-(N-morpholino)-ethane sulfonic acid), 10 mM MgCl2, 150 µM acetosyringone. pH 5.6; Prepare a fresh buffer before use.
MESDuchefa BiochemieM1503Prepare 100 mM (pH 5.6) stock in water. Filter sterilize.
MgCl2Sigma-AldrichM8266Prepare 100 mM stock in water. Autoclave.
AcetosyringoneSigma-AldrichD134406Prepare 150 mM stock in DMSO.
Confocal microscope equipments/materials
710 laser scanning confocal systemCarl Zeiss
Axio observer Z1 inverted microscopeCarl Zeiss
Propidium iodideThermoFisherP1304MP

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